Name: Het gebruik van interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay om nieuwe T-cel epitopen van het humaan papillomavirus karakteriseren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: Leer T-cel klonen isoleren en karakteriseren voor immunologisch onderzoek naar humaan papillomavirus met interferon-γ ELISpot. Deze methode identificeert epitopen voor vaccinontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door een American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) en NIH-beurzen (R01 CA143130 en UL1RR029884).

<ol><li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+favorable+clinical+trend+is+associated+with+CD8+T-cell+immune+responses+to+the+human+papillomavirus+type+16+e6+antigens+in+women+being+studied+for+abnormal+pap+smear+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Low.+Genit.+Tract+Dis%22%5BJournal%5D)">A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results.</a> J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).</li>
<li>Walls, E., Crawford, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalls%2C+E+%22Lymphocytes%3A+A+practical+approach%22">Lymphocytes: A practical approach</a>. Klaus, G. G. B. , IRL Press. 149-149 (1987).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+CD8+T-cell+epitopes+within+the+human+papillomavirus+type+16+%28HPV+16%29+E6+protein+among+young+women+whose+HPV+16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Patterns of CD8 T-cell epitopes within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 protein among young women whose HPV 16 infection has become undetectable.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 12, 1003-1005 (2005).</li>
<li>Wang, X., Santin, A. D., Bellone, S., Gupta, S., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+CD4+T-cell+epitope+described+from+one+of+the+cervical+cancer+patients+vaccinated+with+HPV+16+or+18+E7-pulsed+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancer patients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells.</a> Cancer Immunol. Immunother. 58, 301-308 (2009).</li>
<li>Larsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+vaccinia+virus+based+ELISPOT+assay+detects+high+frequencies+of+Pol-specific+CD8+T+cells+in+HIV-1-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">A recombinant vaccinia virus based ELISPOT assay detects high frequencies of Pol-specific CD8 T cells in HIV-1-positive individuals.</a> AIDS. 13, 767-777 (1999).</li>
<li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+responses+to+E6+and+E7+proteins+of+human+papillomavirus+type+16%3A+relationship+to+cervical+intraepithelial+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte responses to E6 and E7 proteins of human papillomavirus type 16: relationship to cervical intraepithelial neoplasia.</a> J. Infect. Dis. 175, 927-931 (1997).</li>
<li>Wang, X., Moscicki, A. B., Tsang, L., Brockman, A., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+specific+for+novel+human+papillomavirus+type+16+%28HPV16%29+E6+epitopes+in+women+whose+HPV16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells specific for novel human papillomavirus type 16 (HPV16) E6 epitopes in women whose HPV16 infection has become undetectable.</a> Clin. Vaccine Immunol. 15, 937-945 (2008).</li>
<li>Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+processing+defects+in+cervical+carcinomas+limit+the+presentation+of+a+CTL+epitope+from+human+papillomavirus+16+E6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen processing defects in cervical carcinomas limit the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6.</a> J. Immunol. 167, 5420-5428 (2001).</li>
<li>Shi, Y., Smith, K. D., Kurilla, M. G., Lutz, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+CD8%2B+T+cells+recognize+EBV+antigen+but+poorly+kill+autologous+EBV-infected+B+lymphoblasts%3A+immunodominance+is+elicited+by+a+peptide+epitope+that+is+presented+at+low+levels+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic CD8+ T cells recognize EBV antigen but poorly kill autologous EBV-infected B lymphoblasts: immunodominance is elicited by a peptide epitope that is presented at low levels in vitro.</a> J. Immunol. 159, 1844-1852 (1997).</li>
<li>Varadarajan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%2B+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+methods+of+identifying+new+antigenic+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+and+E7+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Different methods of identifying new antigenic epitopes of human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 889-896 (2004).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Gillam, T. M., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+class+I+binding+promiscuity+of+the+CD8+T-cell+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HLA class I binding promiscuity of the CD8 T-cell epitopes of human papillomavirus type 16 E6 protein.</a> J. Virol. 81, 1412-1423 (2007).</li>
<li>Brown, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+epitope+%22hotspots%22+on+the+HIV+Type+1+gp120+envelope+protein+overlap+with+tryptic+fragments+displayed+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">T cell epitope "hotspots" on the HIV Type 1 gp120 envelope protein overlap with tryptic fragments displayed by mass spectrometry.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 21, 165-170 (2005).</li>
<li>Masemola, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+promiscuous+CTL+epitopes+in+conserved+regions+of+Gag+targeted+by+individuals+with+early+subtype+C+HIV+type+1+infection+from+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel and promiscuous CTL epitopes in conserved regions of Gag targeted by individuals with early subtype C HIV type 1 infection from southern Africa.</a> J. Immunol. 173, 4607-4617 (2004).</li>
<li>Walker, B. D., Korber, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+control+of+HIV%3A+the+obstacles+of+HLA+and+viral+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity.</a> Nat. Immunol. 2, 473-475 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Traditioneel probeerden immunologen nieuwe T-cel-epitopen te karakteriseren door de T-cellen van belang in vitro te stimuleren en een limiterend verdunningsexperiment uit te voeren om de epitoopspecifieke T-celklonen te isoleren. Vervolgens werden de T-celklonen gekarakteriseerd met behulp van een chroomvrijmakingsassay 8,9. Veel pogingen waren echter niet succesvol omdat de frequenties van de T-cellen mogelijk te laag waren om te isoleren of omdat er onvoldoende T-celklooncellen beschikbaar waren om ...

<table><tbody><tr><td>CD8 T-cel isolatiekit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-156</td><td></td></tr><tr><td>Fytohemagglutinine</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R-30852801</td><td>2mg/vial</td></tr><tr><td>Yssel&amp;rsquo;s medium</td><td>Gemini Bio Products</td><td>400-102</td><td>1% gepoold menselijk serum</td></tr><tr><td>96-wells plaat met ronde bodem</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772-17</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humaan IL-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>50&amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>24-wells plaat</td><td>Corning</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Primair anti-IFN-&amp;#947; monoklonaal antilichaam (D1K)</td><td>Mabtech</td><td>3420-3-1000</td><td></td></tr><tr><td>Biotine-geconjugeerd anti-IFN-&amp;#947; monoklonaal antilichaam (7B-6)</td><td>Mabtech</td><td>3420-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>Multiscreen HA ELISPOT plaat</td><td>EMD Millipore</td><td>MAHA S45 10</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>100 ml fles</td></tr><tr><td>Gepoold serum, humaan</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S40510H</td><td>Hitte-geïnactiveerd</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>MT-10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>NC9313719</td><td></td></tr><tr><td>Stabiel diaminobenzidine</td><td>Open Biosystems</td><td>MBI 1241</td><td></td></tr><tr><td>AID EliSpot Reader Classic</td><td>Autoimmun Diagnostika GmbH</td><td>ELR06</td><td></td></tr></tbody></table>

het gebruik van interferon-γ enzyme-linked immunospot assay om nieuwe t-cel epitopen van het humaan papillomavirus karakteriseren

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Er is een protocol ontwikkeld om de moeilijkheden bij het isoleren en karakteriseren van zeldzame T-cellen te overwinnen die specifiek zijn voor pathogenen, zoals het humaan papillomavirus (HPV), die lokale infecties veroorzaken. De betrokken stappen zijn het identificeren van regio(s) van HPV-proteïnen die T-cel-epitoop(s) van een proefpersoon bevatten, het selecteren van peptide-specifieke T-cellen op basis van interferon-γ (IFN-γ) secretie, en het kweken en karakteriseren van de T-celklonen (Fig. 1). Proefpersoon 1 was een patiënt bij wie onlangs via biopsie een hooggradige platsel epitheeliale intraepitheliale laesie was vastgesteld en die op de dag van de T-celafname een loop electrical excision-procedure onderging voor de behandeling1. Een regio binnen de proteïnen E6 en E7 van het humaan papillomavirus type 16 (HPV 16) die een T-cel-epitoop bevatte, werd geïdentificeerd met behulp van een IFN-γ enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay uitgevoerd met overlappende synthetische peptiden (Fig. 2). De gegevens van deze assay werden niet alleen gebruikt om een regio met een T-cel-epitoop te identificeren, maar ook om het aantal epitoop-specifieke T-cellen te schatten en deze te isoleren op basis van IFN-γ secretie met behulp van commercieel beschikbare magnetische kralen (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). De geselecteerde IFN-γ secreterende T-cellen werden verdund en afzonderlijk gekweekt in aanwezigheid van een mengsel van bestraalde feeder-cellen om de groei van één enkele T-cel per putje te ondersteunen. Deze T-celklonen werden gescreend met een IFN-γ ELISPOT assay in aanwezigheid van peptiden die de geïdentificeerde regio dekken en autologe, door het Epstein-Barrvirus getransformeerde B-lymfoblastoïde cellen (LCLs, verkregen zoals beschreven door Walls en Crawford)2 om het aantal benodigde T-celklooncellen te minimaliseren. In plaats van de 1 x 105 cellen per putje die gewoonlijk in ELISPOT assays worden gebruikt1,3, werden 1.000 T-celklooncellen in aanwezigheid van 1 x 105 autologe LCLs gebruikt, wat het aantal benodigde T-celklooncellen drastisch verminderde. De autologe LCLs dienden niet alleen om peptide-antigenen aan de T-celklooncellen te presenteren, maar ook om een hoge celdichtheid in de putjes te behouden, waardoor de epitoop-specifieke T-celklooncellen IFN-γ konden secreteren. Dit waarborgt de succesvolle uitvoering van de IFN-γ ELISPOT assay. Op soortgelijke wijze werden IFN-γ ELISPOT assays gebruikt om de minimale en optimale aminozuursequentie van het CD8 T-cel-epitoop (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) en het HLA klasse I restrictie-element (B58) ervan te karakteriseren. De IFN-γ ELISPOT assay werd ook uitgevoerd met autologe LCLs geïnfecteerd met vacciniavirus dat HPV 16 E6 of E7 proteïne tot expressie bracht. Het resultaat demonstreerde dat het E6 T-cel-epitoop endogeen werd verwerkt. De kruisrecognitie van homologe T-cel-epitopen van andere risico-HPV-typen werd aangetoond. Deze methode kan ook worden gebruikt om CD4 T-cel-epitopen te beschrijven4.

Het karakteriseren van T-cel-epitopen van pathogenen die lokale infecties veroorzaken, zoals het humaan papillomavirus, is een uitdaging vanwege het beperkte aantal circulerende T-cellen. Er wordt een methode beschreven waarbij zeldzame T-cellen werden geïsoleerd en gekarakteriseerd, beginnend met een zeer klein aantal cellen.

Het gebruik van interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay om nieuwe T-cel epitopen van het humaan papillomavirus karakteriseren

Er is een protocol ontwikkeld om de moeilijkheden bij het isoleren en karakteriseren van zeldzame T-cellen die specifiek zijn voor pathogenen, zoals menselijke ... te overwinnen.

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren, kweken en analyseren van HPV-antigeenspecifieke T-celklonen van patiënten. Stel eerst een CD8 T-cellijn op, voer een SBOT-assay uit en schat de frequentie van antigeenspecifieke T-cellen. Nadat de antigeenspecifieke T-celklonen zijn geïsoleerd op basis van interferon-gamma secretie, wordt een high-throughput screening interferon-gamma SBOT-assay uitgevoerd om epitopspecifieke T-celklonen te identificeren.Ga verder met het karakteriseren van de T-celklonen voor het minimale optimale peptide. Epitope-sequenties bepalen ook of het epitoop endogeen wordt verwerkt. Identificeer het HLA-restrictie-element en beoordeel de kruisreactiviteit met andere risicovolle HPV-typen.Uiteindelijk is het doel om nieuwe en klinisch relevante HPV T-cel-epitopen te beschrijven door middel van screening en karakterisering van antigeenspecifieke T-cellen van patiënten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het gebruik van de LY-assay om antigeenspecifieke T-cellen te identificeren, is dat de kans op succes veel groter is. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de immunologie, zoals welke delen van HPV door T-cellen worden herkend. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie of diagnose van baarmoederhalskanker, omdat vaccins en immunotherapieën kunnen worden ontwikkeld op basis van de kennis over T-cel-specificiteiten.Deze methode kan inzicht bieden in CD8 T-celepitopen en kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals CD4 T-celepitopen; een interferon-gamma SPO-assay met een CD8 T-cellijn afgeleid van proefpersoon één bepaalde dat de regio 46 tot 70 van HPV16 E6 een T-celepitoop bevatte. Deze epitoopspecifieke T-cellen werden geselecteerd op basis van interferon-gamma secretie. Bereid het feeder-celmengsel van bestraalde allogene mononucleaire cellen uit perifeer bloed, B-lymfoblasten en fytohemagglutinine in compleet E-celmedium.Bereid nu, met behulp van een seriële verdunning van de geïsoleerde epitope-specifieke T-cellen in het feeder-celmengsel, een concentratie van vijf cellen per milliliter voor met een multichannel pipetplaat. Breng 100 µL van de verdunde epitope-specifieke T-cellen per well aan in 96-well platen met ronde bodems. Kweek deze gedurende vijf dagen bij 37 °C en 5% CO2 en stimuleer de cellen met recombinant menselijk interleukine 2 op dag 11 tot 14.Identificeer groeiende T-celclonen visueel als grote pellets op de bodem van de putjes van de plaat. Soms kleurt het medium geel. Bereid een nieuw mengsel van feeder-cellen voor en vul elk putje van een 24-wells plaat met één milliliter compleet ecel-medium.Een succesvol experiment is afhankelijk van het vermogen om T-celklonen te isoleren en te kweken met de 200 microliter micropipet. Breng de T-celklonen individueel over naar afzonderlijke wells van de geplooide feeder-cellen. Herhaal dit totdat alle T-celklonen zijn overgebracht.Coat de wells van steriele sbot-platen met 50 µL van 5 µg/mL primaire anti-interferon gamma monoklonale antilichamen na een incubatie van één uur bij 4 °C. Was drie keer met 200 µL PBS.Blok vervolgens aspecifieke binding met 50 µL 5% gepoold menselijk serum in RPMI 1640. Verwijder eventuele grote luchtbellen altijd door ze door te prikken met een steriele naald. Incubeer gedurende een uur bij 37 °C en 5% CO2.Voeg vervolgens 1 × 10⁵ autologe LCL's toe in 50 µL RPMI 1640 met 5% menselijk serum. Meng de cellen van elke T-celkloon met een pipette van 1 mL en breng 100 µL over naar een steriele eppendorfbuis. Verdun met 500 µL RPMI 1640 dat 5% gepoold menselijk serum bevat.Pelleteer vervolgens de cellen door centrifugatie, decanteer het supernatant en resuspendeer de cellen in 110 µL RPMI 1640 met 5% menselijk serum. Plateer nu 50 µL van elke clonale cel-suspensie voor snelle screening in identiek gepositioneerde putjes van de twee Ellis spotplates voor de PHA-positieve controleputjes. Combineer het resterende medium uit verschillende eppendorfbuisjes en plateer telkens 50 µL in de volgende identiek gepositioneerde putjes.Bereid daarnaast negatieve controleputjes voor met 50 µL medium. Voeg voor de testplaat 50 µL van de peptiden uit de positieve regio toe aan de positieve controleputjes. Voeg 10 µL PHA-stamoplossing en 40 µL RPMI 1640 toe aan de plaat met uitsluitend medium.Voeg 50 µL RPMI 1640 met 5% gepoold menselijk serum toe en incubeer de Ellis spot plates overnight bij 37 °C en 5% CO2. Verplaats de platen niet gedurende de gehele incubatieperiode. Giet het medium af en was de wells vervolgens drie keer met 200 µL PBS bevatten 0,05% tween 20.Voeg vervolgens 50 µL van het biotine-geconjugeerde anti-interferon gamma monoklonale antilichaam toe en incubeer gedurende twee uur. Was drie keer met 200 µL PBS bevatttend 0,1% tween 20. Voeg daarna 50 µL vers bereid avidine-gebonden gebiotinyleerde mierikswortelperoxidase toe; incubeer de platen gedurende één uur bij 37 °C bij 5% CO2. Voeg na drie wasbeurten met PBS bevatttend 0,1% tween 20 50 µL stabiele substraat toe.Laat de kleur gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur ontwikkelen met Dino benzine. Was vervolgens drie keer met 200 µL gedeïoniseerd water. Laat de plaat volledig drogen.Tel de spots met een geautomatiseerde ELISpot-lezer. Selecteer T-celklonen voor epitooespecifieke bevestiging. Voer vervolgens de ELISpot-assay uit met 10³ clonale T-cellen om de reactiviteit te bepalen voor elk van de drie peptiden in de epitoopregio.Bereid autologe LCL's voor die zijn geïnfecteerd met wild-type recombinant vacciniavirus en evenzo autologe LCL's die zijn geïnfecteerd met recombinant vacciniavirus dat het HPV 16 E6- of E7-eiwit tot expressie brengt. Gebruik opnieuw de ELISpot-assay op geselecteerde T-celklonen om de reactiviteit ten opzichte van autologe LCL's geïnfecteerd met wild-type recombinant vacciniavirus te vergelijken met de reactiviteit ten opzichte van autologe LCL's geïnfecteerd met recombinant vacciniavirus dat het HPV 16 E6- of E7-eiwit tot expressie brengt bij geselecteerde T-celklonen. Voer eerst een ELISpot-assay uit met een reeks overlappende nine-MER-peptiden die de epitoopregio bestrijken.Voer vervolgens een LY spot assay uit om de reactiviteit op een reeks peptiden van verschillende lengte te bepalen. Ga daarna over naar een lie spot assay met een concentratiebereik van enkele peptiden. Deze bevatten waarschijnlijk de minimale en optimale aminozuursequentie.Bereid allogene LCL's voor die zijn geïsoleerd van het betreffende menselijke subject en één of twee HLA-klasse I-moleculen delen. Selecteer goed functionerende T-celklonen. Voer een ELISpot-assay uit met 10⁵ allogene LCL's, 10³ T-celklooncellen en met het minimale en optimale peptide bij 10 µM.Zodra de epitoopspecifieke T-celklonen zijn gekarakteriseerd, kunnen ze worden getest op kruisreactiviteit met andere hoogrisico-HPV-typen. Screen simpelweg geselecteerde clonale T-cellen van belang met een ELISPOT-assay op reactiviteit met peptiden die homologe aminozuursequenties bevatten van de andere hoogrisico-HPV-typen. Proefpersoon één is een 22-jarige Afro-Amerikaanse vrouw met een recente voorgeschiedenis van een hooggradige squameuze intraepitheliale laesie, gediagnosticeerd via biopsie.Op de dag van de behandeling via de LU-elektrische excisieprocedure werden T-cellen van de patiënte geoogst. De resultaten van de Elispot-assay van haar CD8 T-cellijn gaven aan dat de HPV 16, E6 46 tot 70 regio een T-cel-epitoop bevatte, gebaseerd op interferon-gamma secretieniveaus van 1,2 × 10⁵. Epitoopspecifieke T-cellen werden geselecteerd na beperkende verdunning op één vijfde van de geselecteerde cellen.Er werden 262 T-celclonen geoogst. De overige geselecteerde cellen werden niet gebruikt, aangezien de eerste poging tot T-celklonering succesvol was. De Hiro put screening Ellis spot assay, uitgevoerd op 94 van deze klonen, identificeerde 62 screen-positieve klonen.De resterende T-celklonen werden niet getest, aangezien de eerste Ellis Spot assay peptide-specifieke T-celklonen identificeerde. De epitoop-specifieke aard van acht goed groeiende, screeningspositieve klonen werd bevestigd met de drie 15-MER peptiden die de regio afzonderlijk bestreken.Alle T-celklonen waren positief voor de HPV 16, E 6 51 tot 65 peptiden. Zes van de acht klonen waren positief voor het E 6 46 tot 60 peptide en geen van de klonen waren positief voor het E 6 56 tot 70 peptide. Hier worden ELISPOT-assays getoond met autologe LCL's geïnfecteerd met een recombinant vacciniavirus dat het HPV 16 E6-eiwit of E7-eiwit tot expressie brengt.Deze resultaten tonen aan dat T-celklonen een endogeen verwerkt E6-epitoop herkennen; een reeks overlappende negen-mer peptiden die de regio HPV 16 46 tot 65 beslaan, vergemakkelijkte de karakterisering van de minimale en optimale sequentie van het T-celepitoop. De beste respons werd verkregen met het E6 53 tot 61 peptide. Overlappende peptide-epitopen identificeerden het E6 52 tot 61 tien-mer peptide het meest consistent als de minimale en optimale sequentie. Interessant genoeg vertoonde het E6 53 tot 61 peptide een even sterke respons met de T-celkloon.De dosis-respons-curves in nummer 79 geven aan dat het E 6 52 tot 61-peptide positiviteit veel effectiever behield dan het E 6 53 tot 61-peptide bij lagere peptideconcentraties. In dit voorbeeld werd subject A, bij wie een minimale en optimale sequentie van E 6 75 tot 83 werd aangetroffen, geanalyseerd voor restrictie van het HLA-klasse I-molecuul van het CD 8 T-cel-epitoop. Hoge positiviteit wordt waargenomen bij een LCL die de B 62- en CW 3-moleculen tot expressie brengt. Terwijl achtergrondpositiviteit wordt getoond bij een LCL die CW 3 tot expressie brengt, zijn sommige regio's van het HPV-genoom goed geconserveerd.Bijvoorbeeld, homologe sequenties van de HPV 16, E 6 52 tot 61 regio's die bij proefpersoon één werden geïdentificeerd, waren aanwezig in 13 andere high-risk HPV-typen. In overeenstemming hiermee werd een sterke kruisreactiviteit aangetoond voor acht van de 13 high-risk HPV-typen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in zeven weken vanaf de dag van de bloedafname worden uitgevoerd, mits deze correct wordt toegepast. Denk eraan om gedurende de gehele procedure de steriele techniek toe te passen.Vergeet niet dat het werken met elk virus gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van beschermende kleding, tijdens het uitvoeren van de procedure. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u nieuwe T-cel-Es kunt karakteriseren.

use-interferon-enzyme-linked-immunospot-assay-to-characterize-novel-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Identificatie van microbiële doelstellingen van adaptieve immuniteit in idiopathische ziekte kan worden bewerkstelligd door het gebruik van het enzym-linked immunospot assay.

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Kwantificering van de Th-1 cellulaire immuunreacties tegen microbiële antigenen

Source:Matthew J Murray1, Gary R McLean2,3, Matthew B Reeves11Institute of Immunity and Transplantation, University College London.2Cellular and Molecular Immunology Research Centre, London Metropolitan University.3National Heart and Lung Institute, Imperial College London.This video demonstrates an immunofluorescence assay designed to measure the neutralization of Human Cytomegalovirus (HCMV). Virus-specific antibodies are mixed with the virus and incubated with human fibroblast cells. The...

An Immunofluorescence Method to Measure the Neutralization of Human Cytomegalovirus

Dit artikel richt zich op de identificatie van hoog-vertrouwen interactie datasets tussen gastheer en pathogeen-eiwitten met behulp van een combinatie van twee orthogonale methoden: gist twee-hybride, gevolgd door een high-throughput interactie test bij zoogdiercellen genaamd HT-GPCA.

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

Nieuwe generaties van functionele testen zoals gamma interferon (IFN-γ) ELISPOT, die cytokineproductie detecteren op enkele cel en bieden zowel kwantitatieve als kwalitatieve karakterisering van T cel responsen kunnen worden gebruikt om celgemedieerde immuunresponsen tegen varicella zoster beoordelen virus (VZV).

Ontwikkeling van een IFN-γ ELISpot Assay aan varicella-zoster virus-specifieke-cel gemedieerde immuniteit na transplantatie van navelstrengbloed

Lange-termijn gekweekte interferon-γ enzymgebonden immunospot assay wordt gebruikt als maat voor centraal geheugen responsen en correleert met beschermende anti-mycobacteriële vaccinresponsen. Met deze assay worden perifeer bloed mononucléaire cellen gestimuleerd met mycobacteriële antigenen en interleukine-2 voor 14 dagen, waardoor differentiatie en expansie van centrale geheugen T-cellen.

Toepassing van Lange-termijn gekweekte interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay voor het beoordelen van effector en geheugen T cel responsen in Vee

We beschrijven hier een isolatiemethode om humane endocervicale intra-epitheliale lymfocyten te verkrijgen voor de analyse van intra-epitheliale gamma delta T-cellen. Dit protocol kan worden uitgebreid voor de zuivering van endocervicale gamma delta T-cellen door middel van magnetische kralen of door celsortering.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Human Endocervicale Gamma Delta T-cellen

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van de ontwikkeling en validatie van een enkel molecuul matrix digitale Analyse ELISA, waarmee de ultra gevoelige detectie van alle IFN-α subtypen in menselijke specimens.

Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α

De ontwikkeling van de interferon-gamma ELISpot assay voor cavia PBMCs kunt de karakterisatie van T-cel reacties in dit zeer relevant model voor het bestuderen van besmettelijke ziekten. Wij hebben de test voor het meten van de T cel reacties gekoppeld intradermale levering van vaccin dat DNA toegepast.

Geoptimaliseerde Interferon-gamma ELISpot Assay maatregel T cel antwoorden in het Model van de cavia na vaccinatie

Op basis van een van hepatitis B-virus (HBV) afgeleide peptidematrix konden HBV-specifieke CD4 T-celresponsen parallel aan de identificatie van HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen worden geëvalueerd.

Analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen en identificatie van HLA-DR-beperkte CD4 T-cel epitopen op basis van een peptidematrix

Dit manuscript beschrijft hoe in vivo immunogeniciteit van tumorcel-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) kunnen worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie. EV's afgeleid van tumoren die door behandeling geïnduceerde immunogene celdood ondergaan, lijken bijzonder relevant in tumorimmunosurveillance. Dit protocol is een voorbeeld van de beoordeling van door oxaliplatine geïnduceerde immunostimulerende tumor-EV's, maar kan worden aangepast aan verschillende instellingen.

In vivo Immunogeniciteitsscreening van tumor-afgeleide extracellulaire blaasjes door flowcytometrie van milt-T-cellen

Hier presenteren we een protocol om neutralisatie-epitopen te detecteren op antigeen-displaying virusachtige deeltjes (VLP's). Immunoprecipitatie van het van het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) afgeleide VLP's wordt uitgevoerd met behulp van envelop glycoproteïnen-specifieke monoklonale antilichamen gekoppeld aan eiwit G-geconjugeerde magnetische kralen. Gevangen VLP's worden vervolgens onderworpen aan SDS-PAGE en Western blot-analyse met behulp van virale kerneiwit Gag-specifieke...

Detectie van neutralisatiegevoelige epitopen in antigenen die worden weergegeven op op virusachtige deeltjes (VLP) gebaseerde vaccins met behulp van een capture-assay

Leer T-cel klonen isoleren en karakteriseren voor immunologisch onderzoek naar humaan papillomavirus met interferon-γ ELISpot. Deze methode identificeert epitopen voor vaccinontwikkeling.

Het gebruik van interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay om nieuwe T-cel epitopen van het humaan papillomavirus karakteriseren (Video) | JoVE Journal

Het gebruik van interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay om nieuwe T-cel epitopen van het humaan papillomavirus karakteriseren

Meer video's verkennen