Name: Genereren van organotypische Raft Culturen van primaire humane keratinocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Leer organotypische raftculturen genereren van primaire humane keratinocyten voor virologisch onderzoek. Deze methode bootst epitheeldifferentiatie in vivo na en biedt inzicht in virus:gastheer-interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Sally Roberts (Universiteit van Birmingham, Birmingham VK) bedanken voor het soort geschenk van de E1E4 antilichaam. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van het National Cancer Institute (4R00CA137160-03).

1. Voorbereiding voor organotypische Raft Culturen <ol><li> De metalen roosters veel vlot eerst worden behandeld met chroomzuur zwavelzuur om resten die kunnen interfereren met de differentiatie te verwijderen. Dompel metalen roosters in een bekerglas met zwavelzuur gedurende een uur, vervolgens continu &#39;s nachts gespoeld met leidingwater. Na het &#39;s nachts spoelen, moet vlot roosters worden gespoeld gedurende 3-5 uur in tweemaal gedestilleerd water. </li><li> Voor ondersteuning van de vlotten voorzien buig drie zijden van het vlot ongeveer 0,5 cm op gelijke afstand van elkaar. De metalen roosters moet dan worden geautoclaveerd. </li><li> Bereid de 10X reconstitutie buffer door het toevoegen van 2,2 g NaHCO3 en 4,8 g Hepes. Los in 100 ml 0,05 M NaOH. Filter sterilisatie en opslaan in 5 ml fracties bij -20 ° C. </li><li> Bereid de 10X DMEM zonder natriumbicarbonaat. Filter sterilisatie en opslaan in 5 ml fracties bij -20 ° C. </li><li> Bereid je muis epidermale groeifactor: Los 100 mg van het EFG en 10 mg van BSA elk in 10 ml gedeïoniseerd DDH 2 0. Combineer EGF en BSA en aan 80 ml ​​gedeioniseerd DDH 2 0 een totaal volume van 100 ml. Filter-steriliseren, aliquot (5 ml) en bewaar deze in de -20 ° C. Per liter E medium 5 ml 1 mg / ml EGF (eindconcentratie 5 ng / ml). </li></ol> 2. Bereiding van collageengels <ol><li> Een collageen gel is vereist voor elke vlot. Het collageen worden op ijs gehouden om te voorkomen stollen. Elke collageen gel vereist 3 ml van collageen mengsel bestaande uit: 2,4 ml koud Rat-tail collageen type I (eindconcentratie 3-4 mg / ml), 0,3 ml 10X reconstitutie buffer, 0,3 ml 10X DMEM en1-2 x 10 6 muis 3T3 fibroblasten J2 als feeder cellen. Voor hoge concentratie oplossingen rattenstaart collageen, verdund in 0,02 M azijnzuur totdat de juiste concentratie te bereiken. </li><li> Bepaal het aantal van collageen gels (vlotten) dan zul je nodig hebt en berekent een master mix voor de hoeveelheid collageen, 10X reconstitution buffer, 10x DMEM en J2 fibroblasten vereist. Neem genoeg elke master mix 3-4 extra gels door de viscositeit van het collageen. </li><li> Om het collageen gel voor te bereiden, trypsinize de J2 fibroblasten en neutraliseren met medium. Combineer alle fibroblasten en plaats in een 50 ml conische flacon. Tel de cellen om het aantal vlotten dat gemaakt kan worden bepaald. Nogmaals, zijn 1-2x10 6 fibroblasten nodig per collageen gel en dus per vlot. Draai de cellen af ​​bij lage snelheid. </li><li> Zuig het medium van de fibroblast pellet en resuspendeer in de juiste hoeveelheid 10X reconstitutie buffer, 10X DMEM en collageen voor het aantal berekende vlotten. Voeg de collageen laatste om de gel te voorkomen dat stolling te snel. Zodra het collageen wordt toegevoegd, snel te mixen, maar voorzichtig aan de introductie van bellen te voorkomen dat in de gel. De gel moet een rood-oranje tint, een indicatie van de juiste pH. Indien het gel mengsel te geel, voeg een paar druppels filter-gesteriliseerd 1NNaOH en schud zachtjes om de juiste kleur te verkrijgen. </li><li> 3 ml van het collageen: fibroblast mengsel om de putjes van een 6 goed kweekschaal. Het collageen mengsel moet worden gepipetteerd langzaam langs de zijkant van elk putje om te voorkomen dat het genereren van bubbels. Plaats de plaat in een 37 ° C incubator weefselkweek en laten stollen 30 minuten. </li><li> Na 30 minuten, 3 ml E medium EGF aan de bovenkant van de gestolde collageen gel en geven de plaat aan de incubator. De gels worden bewaard bij 37 ° C gedurende ten minste een dag maar gebruikt in vier dagen. Optimale resultaten komen na twee dagen incubatie. </li></ol> 3. Voorbereiden Keratinocyten voor differentiatie <ol><li> Lage doorgang keratinocyten worden gekweekt tot ongeveer 70% confluentie. Elke raft vereist 1-2x10 6 keratinocyten. Trypsinize de keratinocyten en neutraliseren met E medium met EGF. Tel de cellen om het aantal vlotten dat gemaakt kan worden bepaald. Draai de cellen bij lage speed. Resuspendeer de pellet in 1 ml van E medium met EGF voor elke berekende vlot cultuur. </li><li> Zuig het medium van de collageengels door kanteling van de 6 wells plaat. Voeg 2 ml verse E medium met EGF aan elke gel. Voor elke gel wordt voorzichtig 1 ml geresuspendeerde keratinocyten de 2 ml E medium reeds aanwezig in de wel. Voorzichtig pipet de keratinocyten plus de 2 ml van de media en dan laten vallen druppelsgewijs terug op de gel. Schudden of schommelen van de plaat kan in ongelijkmatige verdeling van cellen met een zijde van het collageen gel. Plaats de plaat in de 37 ° C incubator. </li><li> De cellen worden gekweekt tot confluentie vervanging van de E medium dag. De cellen zijn confluent bij het medium wordt geel een dag na een verandering in medium. Dit duurt meestal 2-4 dagen. Als het medium is niet veranderd door de vierde dag, ga dan naar de volgende stap. </li></ol> 4. Het maken van de Raft culturen <ol><li> Gebruik steriele pincet in een steriele metalen vlot het net te plaatsen, gebogen zijkanten naar beneden, In een 10 cm schotel. Zuig het medium van collageen gel. Om de gel los van de zijkanten van de goot, rond de omtrek van de gel met een steriele spatel met een op en neer bewegen. Om het collageen gel te verwijderen, iets schuin de plaat en til door het plaatsen van een spatel eronder. Leg de collageen gel op het metalen rooster zonder het genereren van bellen tussen het rooster en de gel. Twee gels kunnen worden geplaatst op elk rooster. </li><li> Om een ​​lucht-vloeistof grensvlak te maken, E medium langzaam toe te voegen zonder EGF aan de bodem van de schotel, zodat het vlot rooster raakt de media, de gel collageen is. De media zou niet door de openingen in het rooster. Voeg langzaam het medium om te voorkomen dat het genereren van bellen onder het rooster, omdat dit de uniforme differentiatie te voorkomen. Incubeer de vlotten bij 37 ° C en wijzigen medium om de andere dag behoud van de lucht-vloeistof grensvlak. Oogst de vlotten na 14 dagen. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Bij het thij protocol correct wordt uitgevoerd met primaire keratinocyten, zal deze procedure resulteert in een goed gedifferentieerde epithelium waarbij de verschillende lagen van de huid zijn evident. Dit wordt bereikt door histologisch onderzoek door kleuring delen van vlot culturen hematoxyline en eosine (H &amp; E), zoals weergegeven in figuur 1B. H &amp; E kleuring is nuttig de morfologie van vlotten en het effect van virussen of antivirale verbindingen op het vermogen van cellen om stratificeren en differentiëren. Bijvoorbeeld, vlotten uit HPV-geïmmortaliseerde primaire keratinocyten (HFS-31) name dikker dan vlotten uit normale humane voorhuid keratinocyten (HFS), hetgeen een verhoogde snelheid van proliferatie en de mogelijkheid van HPV eiwitten te handhaven differentiërende cellen actieve in de celcyclus (figuur 1B) 10. Dit resulteert in behoud van kernen in het epitheel, dat normale keratinocyten de celcyclus verlaten na differentiatie, waardoor een afbraak van denucleaire envelop. Uitvoerig onderzoek differentiatie kan immunohistochemie worden uitgevoerd om differentiatie merkers, zoals cytokeratinen alsmede involucrine en filaggrine onderzoeken. Verschillende cytokeratines worden uitgedrukt in specifieke fasen van differentiatie 7. Zoals getoond in figuur 2 is cytokeratine 10 (K10) die niet in de basale laag, en alleen in de suprabasale lagen bestaan ​​uit cellen progressief differentiëren. In HPV positieve vlotten is de expressie van K10 vertraagd ten opzichte van de normale keratinocyten weer als gevolg van de invloed van HPV eiwitten op keratinocytdifferentiatie. Immunohistochemie kan ook gebruikt worden om de expressie van virale genen profiel onderzoeken. In figuur 3 is een representatief kleuring onderzoek van de expressie van het eiwit HPV E1 ^ E4, een late eiwit waarvan de expressie beperkt tot de bovenste lagen van het epitheel. Zoals verwacht, is er geen vlekken waargenomen in raft culturen van de normale Human voorhuid keratinocyten. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig1.jpg" /> Figuur 1. A) Overzicht van de werkwijze voor de bereiding organotypische raft culturen van primaire keratinocyten of epitheliale cellijnen. B) Hematoxyline en eosine kleuring van organotypische raft culturen gegenereerd op basis van menselijke voorhuid keratinocyten stabiel handhaven van HPV-31 (HFK-31) episomen, of van normale menselijke voorhuid keratinocyten (HFK). De individuele epitheellagen worden geïdentificeerd, en de plug collageen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig2.jpg" /> Figuur 2. Cytokeratine 10 (K10) expressie beperkt tot de suprabasale lagen van het epitheel. Immunohistochemie werd uitgevoerd op een doorsnede van organotypische vlot culturen gegenereerd HFS-31 cellen, en normale HFKs met een antilichaam K10. Cellulaire DNA werd tegengekleurd met DAPI. Beelden werden vastgelegd met behulp van confokale fluorescentie microscopie. Pijlen geven de basale laag het epitheel. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig3.jpg" /> Figuur 3. De HPV E1 ^ E4-eiwit wordt geproduceerd laat in de productieve fase van de virale levenscyclus. Immunohistochemie werd uitgevoerd op een doorsnede van organotypische vlot culturen gegenereerd HFS-31 cellen, en normale HFKs met antilichamen tegen E1E4. Cellulaire DNA werd tegengekleurd met DAPI. Beelden werden vastgelegd met behulp van confocale fluorescentie microscopie. Pijlen geven de basale laag het epitheel.

<ol><li>Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+raft+cultures+for+investigations+of+virus+growth%2C+pathogenesis+and+efficacy+of+antiviral+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents.</a> Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).</li>
<li>Asselineau, D., Prunieras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+%27simplified%27+skin%3A+control+of+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication.</a> The British Journal of Dermatology. 111, Suppl . 27. 219-222 (1984).</li>
<li>Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBodily%2C+J+%22Organotypic+epithelial+raft+cultures+and+the+study+of+the+natural+history+of+human+papillomavirus%22">Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus</a>. , Caister Academic Press. Norfolk. (2006).</li>
<li>Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation-dependent+up-regulation+of+the+human+papillomavirus+E7+gene+reactivates+cellular+DNA+replication+in+suprabasal+differentiated+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes.</a> Genes & Development. 9, 2335-2349 (1995).</li>
<li>Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+papillomavirus+and+modulation+of+the+infectious+program+in+epithelial+raft+cultures.+OFF%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF.</a> Genes & Development. 6, 1131-1142 (1992).</li>
<li>Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+synthesis+of+oncogenic+human+papillomaviruses+requires+episomal+genomes+for+differentiation-dependent+late+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).</li>
<li>Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoids+as+important+regulators+of+terminal+differentiation%3A+examining+keratin+expression+in+individual+epidermal+cells+at+various+stages+of+keratinization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization.</a> The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).</li>
<li>Longworth, M. S., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+human+papillomaviruses+in+differentiating+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Review%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia.</a> Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).</li>
<li>Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+human+papillomavirus+from+a+continuous+cell+line+upon+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation.</a> Science. 257, 971-973 (1992).</li>
<li>Wilson, R., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+R+%22Differentiation+of+HPV-Containing+Cells+Using+Organotypic+Raft+Culture+or+Methylcellulose%22">Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose</a>. , Humana Press Inc. Totowa. 119-119 (2006).</li>
<li>zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papillomavirus+infections--a+major+cause+of+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Papillomavirus infections--a major cause of human cancers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Hier beschreven een methode die kan worden gebruikt om epitheliale differentiatie in het algemeen te bestuderen, maar kan ook gemakkelijk worden aangepast aan virale pathogenese, en de effectiviteit van potentiële therapeutische bestuderen. Veel virussen gericht epitheelcellen of als voornaamste van infectie zoals in het geval van HPV of ergens in de virale levenscyclus, zoals bij herpesvirussen. Hoewel groeiende organotypische raft culturen is tijdrovend, de mogelijkheid om trouw herhalen in-vivo-epitheliale d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Rat Tail Collageen type 1 (4-5mg/ml) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> DMEM zonder NaHC0 3 </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-061 </td></tr><tr><td> NaHC0 3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Calbiochem </td><td> 391338 </td></tr><tr><td> RVS metalen roosters </td><td> Williams en Mettle Co </td><td> CR-03063-040-100-S </td></tr><tr><td> E medium 11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Epidermal Growth Factor </td><td> BD Biosciences </td><td> 354010 </td></tr></tbody></table>

genereren van organotypische raft culturen van primaire humane keratinocyten

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

De ontwikkeling van organotypische epitheliale raft culturen heeft onderzoekers met een efficiënt in vitro systeem dat trouw recapituleert epitheliale differentiatie. Er zijn vele toepassingen van dit systeem. Zo heeft de mogelijkheid om drie-dimensionale organotypische raft culturen van keratinocyten te groeien is een belangrijke mijlpaal in de studie van het humaan papillomavirus (HPV) 1. De levenscyclus van HPV is nauw gekoppeld aan de differentiatie van plaveiselepitheel 2. Organotypische epitheliale raft culturen zoals blijkt hier weer de hele papillomavirus levenscyclus, inclusief antivirusprogramma productie 3,4,5. Bovendien zijn deze raft culturen vertonen dysplastische laesies gelijk aan die waargenomen tijdens het in-vivo-infectie met HPV. Vandaar dit systeem kan ook worden gebruikt om kanker epitheelcellen, alsmede de werking van geneesmiddelen op epitheliale celdifferentiatie in het algemeen te bestuderen. Oorspronkelijk ontwikkeld door Asselineau en Prunieras <sup&gt; 6 en gewijzigd door Kopan et al.. 7, de organotypische epitheliale vlot cultuur systeem is uitgegroeid tot een algemeen, relatief eenvoudig cultuur model, dat de groei van cellen gaat op de collageen-stekkers gehandhaafd op een lucht-vloeistof interface (figuur 1a). In de loop van 10-14 dagen, de cellen stratificeren en differentiëren, die een volledige dikte epitheel dat differentiatie-specifieke cytokeratines produceert. Geoogst vlotten kan histologisch worden onderzocht, en door standaard moleculair en biochemische technieken. In dit artikel wordt beschreven een methode voor het genereren van vlot culturen van primaire humane keratinocyten. Dezelfde techniek kan worden gebruikt vastgesteld epitheliale cellijnen en kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met epitheelweefsel van normale of zieke biopten 8. Veel virussen doel ofwel de cutane of mucosale epitheel als onderdeel van hun replicatieve levenscyclus. In de afgelopen jaren is de haalbaarheid van het gebruik organotypische vlot cultgelen als methode bestuderen virus-gastheercel interacties werd tot meerdere herpesvirussen, alsmede adenovirussen, parvovirussen en poxviruses 9. Organotypische raft culturen kan dus worden aangepast aan de virale pathogenese te onderzoeken, en zijn de enige middelen om nieuwe antivirale middelen te testen op de virussen die niet kweekbare in permanente cellijnen.

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Methode om na te bootsen<em&gt; In vivo</em&gt; Epitheliale differentiatie beschreven. Veel virussen richten op epitheliale cellen als onderdeel van hun virale levenscyclus, en deze methode biedt de mogelijkheid te onderzoeken virus: gastheer interacties die meer lijkt op dat die zich voordoet<em&gt; In vivo</em&gt;. Deze techniek kan gebruikt worden met primaire keratinocyten gevestigde cellijnen, alsmede normale of zieke biopsieweefsel.

Genereren van organotypische Raft Culturen van primaire humane keratinocyten

De ontwikkeling van organotypische epitheliale raft-culturen heeft onderzoekers voorzien van een efficiënt in vitro-systeem dat getrouwe reproductie biedt van ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van organtypische raft-culturen vanuit primaire keratinocyten of gevestigde epitheliale cellijnen. Dit wordt bereikt door eerst fibroblast-collageenpluggen te maken. Vervolgens worden epitheliale cellen bovenop de pluggen geplaatst.De pluggen worden vervolgens naar de raft-roosters verplaatst en gedurende 10 tot 14 dagen op een lucht-vloeistofgrensvlak gehouden. In de laatste stap worden de rafts geoogst. Uiteindelijk kunnen veranderingen in de epitheliale differentiatie worden geëvalueerd via histologische of immunohistochemische analyse. Deze methode kan inzicht bieden in de epitheliale differentiatie.Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals virussen die als onderdeel van hun levenscyclus het cutane of mucosale epitheel infecteren. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dan Anneker, een promovendus in mijn laboratorium. Giet eerst chroomzuur in een glazen bekerglas en dompel de metalen raft-grids gedurende één uur in het zuur.Spoel de roosters vervolgens gedurende de nacht continu met kraanwater. Na het overnacht spoelen worden de roosters nog drie tot vijf uur gespoeld in dubbel gedestilleerd water, waarna de raft-roosters worden gedroogd. Buig vervolgens drie zijden van de raft, ongeveer 0,5 centimeter met gelijke tussenpozen, en autocleave de raft-roosters.Nadat de collageengel is bereid, wordt trypsine toegevoegd aan de twee fibroblasten, waarna de trypsine wordt geneutraliseerd met medium. Breng de fibroblasten over naar een conisch buisje van 50 milliliter en tel de cellen om te bepalen hoeveel rafts gemaakt kunnen worden. Nadat de cellen vier minuten zijn gecentrifugeerd bij 244 ×g bij kamertemperatuur, wordt het medium van het fibroblastpellet afgezogen en worden de cellen geresuspendeerd in een passende hoeveelheid reconstitutiebuffer DMEM en collageen voor het berekende aantal rafts.Voeg het collageen als laatste toe om te voorkomen dat de gel te snel stolt. Zodra het collageen is toegevoegd, mengt u de oplossing snel maar voorzichtig om te voorkomen dat er luchtbellen in de gel terechtkomen. Als het gelmengsel te geel is, voeg dan een paar druppels filtergesteriliseerde oplossing toe.Voeg één normale natriumhydroxide toe. Meng voorzichtig totdat de gel een roodoranje kleur krijgt, wat duidt op de juiste pH. Pipetteer nu langzaam drie milliliters van het collageen-fibroblastmengsel langs de wand van elke well van een six-well kweekplaat, waarbij wordt voorkomen dat er bellen ontstaan, en incubeer de plaat vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 °C om de gel te laten stollen.Zodra de gel gestold is, worden drie milliliter E-medium met EGF bovenop de gestolde collageengel gevoegd en wordt de plaat teruggeplaatst in de incubator. Nadat de keratinocyten van een lage passage zijn gegroeid tot een confluentie van ongeveer 70%, worden de keratinocyten getrypsiniseerd, waarna het trypsine wordt geneutraliseerd met E-medium met EGF. De cellen worden geteld om te bepalen hoeveel rafts er gemaakt kunnen worden.Resuspendeer na het centrifugeren van de cellen de pellet in één milliliter eed met EGF voor elke berekende raft-cultuur. Verwijder nu het medium uit de collageengel-cultures door de zeswellplaat op zijn zijkant te kantelen en voeg vervolgens twee milliliter verse eed met EGF toe aan elke gel. Voeg daarna voorzichtig één milliliter geresuspendeerde keratinocyten toe aan de twee milliliter eed die reeds in elke well aanwezig is.Pipetteer de keratinocyten samen met de twee milliliters medium voorzichtig en laat dit druppelsgewijs op de collageenplug vallen. Plaats de plaat gedurende twee tot vier dagen in de incubator bij 37 °C om de cellen tot confluentie te laten groeien. De cellen zijn klaar wanneer het medium één dag na vervanging geel verkleurt; plaats op dag vier een steriel metalen raft-rooster met de gebogen zijden naar beneden in een schaal van 10 centimeter met behulp van een steriele pincet.Zuig het medium uit één collageengel en schuif vervolgens een steriele spatel met een op-en-neergaande beweging langs de rand van de gel om deze los te maken van de wanden van de put. Het verplaatsen van de collageenplug van de zes-puts plaat naar het rooster is het moeilijkste deel van deze procedure. Let erop dat u de spatel voorzichtig onder de plug schuift zonder deze te splijten, en leg deze plat op het rooster zonder luchtbellen tussen de plug en het rooster te creëren.Gebruik vervolgens een spatel om eventuele delen die tijdens deze procedure zijn omgevouwen glad te strijken. Om de gel te verwijderen, kantelt u de plaat lichtjes, plaatst u de spatel onder de gel en tilt u deze op. Leg de collageengel op het metalen rooster zonder bellen te vormen tussen het rooster en de gel.Om een lucht-vloeistofinterface te creëren, voegt u langzaam EED zonder EGF toe aan de bodem van de kweekschaal, zodat het raster van de rafts het medium raakt, maar de collageengel niet. Incubeer de rafts vervolgens bij 37 °C. Terwijl de lucht-vloeistofinterface wordt gehandhaafd, oogst u de rafts na 14 dagen. Zoals in deze figuur te zien is, zijn rafts gemaakt van HPV 31-geïmmortaliseerde primaire menselijke keratinocyten (Hfk 31) merkbaar dikker vergeleken met rafts gemaakt van normale menselijke huidkeratinocyten (Hks).Zo zijn HPV-eiwitten in staat om differentiërende cellen actief te houden in de celcyclus. Hier werd een immunohistochemische analyse uitgevoerd op dwarsdoorsneden van organotypische raft-culturen, gegenereerd uit zowel HK 30 als normale HKS, met gebruik van een antilichaam tegen cytokeratine 10 of K 10 in het groen. K 10 werd niet tot expressie gebracht in de basale laag, hier aangegeven door de pijlen, maar werd uitsluitend aangetroffen in de suprabasale lagen, die bestaan uit progressief differentiërende cellen.In deze figuur wordt de expressie van het HPV-eiwit E1 en E4 getoond, waarbij E4 een laat eiwit is dat beperkt is tot de bovenste lagen van het epitheel en hier in het groen wordt weergegeven, zoals verwacht. Er is geen kleuring waargenomen in raft-culturen van normale hks, net als in de vorige figuur.De pijlen geven opnieuw de basale laag van het epitheel aan na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de kankerbiologie om de pathogenese van humane papillomavirussen te bestuderen met behulp van een systeem dat epitheliale differentiatie in vivo nabootst. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u organotypische raftculturen maakt van primaire keratinocyten of gevestigde epitheliale cellijnen.

generation-organotypic-raft-cultures-from-primary-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video describes the detailed protocol for generating in vitro 3D organotypic skin reconstructs to study melanoma progression. This skin model mimics both the architecture and multicellular complexity of organs in vivo.

Generation of Organotypic Full Skin Reconstructs: A Procedure to Establish 3D Skin Model Using Human Skin Samples

This video describes the isolation of keratinocytes—the most prominent cells of human skin's epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

This video describes a detailed protocol for producing genetically modified primary human keratinocytes recombinant retrovirus. This method can be used to manipulate gene expression in keratinocytes.

Genetic Modification of Primary Human Keratinocytes: A Method for Genetically Manipulating Keratinocytes Using Recombinant Retroviruses

This video protocol describes a cassette-based in vitro culture technique to generate human organotypic skin using epidermal keratinocytes and devitalized human dermis. They mimic the function and physiology of their in vivo tissue counterparts.

Organotypic 3D Skin Culture: A Cassette-based In Vitro Culture Technique to Regenerate Human Epidermis on Acellular Dermis

Het doel van dit artikel is om een uitgebreid en gedetailleerd protocol te geven over hoe genetisch gemodificeerde humane organotypische huid te genereren uit epidermale keratinocyten en gedevitaliseerde humane dermis.

Generatie van genetisch gemodificeerde Organotypische Skin Culturen behulp gedevitaliseerde Human Dermis

De menselijke huid fungeert als een eerste lijn van verdediging tegen de externe omgeving. Presenteren we een methode voor het isoleren van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid. Deze geïsoleerde keratinocyten zijn nuttig in talrijke experimentele opstellingen en een zeer geschikt model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen in cutane biologie in vitro.

Generatie en kweken van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een sferoïde huidmodel voor 3D organotypic melanoom die zowel de architectuur recapituleert en meercellige complexiteit van een orgel/tumor in vivo maar tegelijkertijd herbergt systematische experimentele interventie.

Een 3D Organotypic melanoom sferoïde huidmodel

Hier presenteren we een protocol om efficiënt isoleren primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid weefsels. Deze methode vereenvoudigt de conventionele procedure met behulp van de Y-27632 van de Inhibitor van de omwenteling ROCK in het medium van de inoculatie spontaan epidermale cellen uit dermale cellen scheiden.

Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel

Wij stellen voor een protocol dat laat zien hoe geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige keratinocyten en fibroblasten differentiëren en genereren een 3D huid organoid, met behulp van deze keratinocyten en fibroblasten. Dit protocol bevat een extra stap van het genereren van een gehumaniseerd muizen model. De techniek die hier gepresenteerd zal dermatologische onderzoek verbeteren.

Generatie van 3D huid Organoid van koord bloed afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier beschrijven we een protocol voor de systematische teelt van epidermale sferoïden in 3D-suspensiecultuur. Dit protocol heeft uitgebreide toepassingen voor gebruik in een verscheidenheid van epitheelweefseltypes en voor het modelleren van verscheidene menselijke ziekten en voorwaarden.

Het opzetten van een epidermale sferoïde cultuursysteem met hoge doorvoer om keratinocytstamcelplasticiteit te modelleren

Dit protocol schetst de kweek van vers verkregen (passage 0) keratinocyten voor gebruik in beeldvorming van levende cellen.

Genereren van primaire culturen voor beeldvorming van levende cellen van keratinocyten

Leer organotypische raftculturen genereren van primaire humane keratinocyten voor virologisch onderzoek. Deze methode bootst epitheeldifferentiatie in vivo na en biedt inzicht in virus:gastheer-interacties.

Genereren van organotypische Raft Culturen van primaire humane keratinocyten

Meer video's verkennen