Name: Dissectie en Cultuur van de muis Dopaminerge en het striatum Explantaten in drie-dimensionale Collageen Matrix Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Leer de dissectie en cultuur van dopaminerge en striatale explantaten uit muizenembryo's in een collageenmatrix. Deze methode maakt kwantificering van axonale groei en geleiding in driedimensionale omstandigheden mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De matrix van collageen test is ontwikkeld en verbeterd door het werk van vele verschillende onderzoeksgroepen de afgelopen twee tot drie decennia. De aanpak hier beschreven voor de dopaminerge en het striatum explantaten veel baat hebben bij deze studies. Daarnaast zou de auteurs willen Asheeta Prasad bedanken voor haar hulp bij het opzetten van striatale explant culturen. Werk in het lab werd gefinancierd door het Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award), Nederland Organisatie van gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMw-VIDI-en ZonMW-TOP), de Europanian Unie (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222999) (in RJP), en Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (Toptalent, tot ERES).

1. Voorbereiding van de Rat Tail Collageen <ol><li> Verzamelen 6-10 volwassen rat staart (het is mogelijk om de staart bewaren bij -20 ° C tot gebruik). </li><li> Laat de staarten in 95% ethanol gedurende de nacht bij kamertemperatuur (RT). </li></ol> Dissectie van de rat staarten (in weefselkweek kap): (Houd tools in 70% ethanol als u niet met hen en zorg ervoor dat alle oplossingen, tools en glaswerk tijdens de gehele procedure steriel zijn) <ol start="3"><li> Om pezen te halen bij de staart, afgesneden het puntje van de staart. Houd brede uiteinde van de staart met een pincet. Gebruik een andere tang te houden, buigen en de staart in de buurt van de andere tang te breken. Trek uit elkaar en de pezen zullen achtergelaten worden (Figuur 1A, B). </li><li> Verzamel de pezen in steriele H 2 O en na het verzamelen van alle pezen verplaats ze naar een nieuwe petrischaal met steriele H 2 O. </li><li> Neem 2-3 pezen en rasp ze met behulp van 2 paar vooreekhoorntjesbrood in een nieuwe petrischaal met steriele H 2 O. Verwijder de niet-peesweefsel, zoals aderen (peesweefsel is glanzend en reflecterende; Figuur 1C). Na het verwijderen van alle niet-peesweefsel, elke staart levert ongeveer 100-150 mg van pezen. </li><li> Breng de pezen 300 ml steriele 3% azijnzuur en roeren langzaam overnacht bij 4 ° C. </li><li> Een extra 200 ml steriele 3% azijnzuur en roeren langzaam overnacht bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer de azijnzuuroplossing die de pezen ~ 2700 g gedurende 120 minuten bij 4 ° C tot pellet niet-opgeloste pezen en niet peesweefsel. </li><li> Tijdens centrifugeren bereiden dialysebuis: <ul><li> gesneden stukken van 40 cm </li><li> koken in 500 uM EDTA gedurende 5 min </li><li> koel in de steriele H 2 O </li></ul></li><li> Leg een knoop in een uiteinde van de dialysebuis en vullen de buis met het supernatant van de gecentrifugeerde pees oplossing op ijs in weefselkweek kap met behulp van een automatische pipette en een 25 ml pipet. Vermijd het produceren van bubbels. Knoop het andere einde van de slang en opslaan buis van steriele aluminiumfolie op ijs tot alle buisstukken gevuld (figuur 1D). </li><li> Bereid 10 l van de steriele 0,1 x MEM, pH 4,0, in de weefselkweek kap. Voeg floater om stukken van de slang en voeg deze aan de pre-gekoelde 0,1 x MEM oplossing in een 10 l beker. Dialyze nacht bij 4 ° C onder langzaam roeren. Deze dialyse verwijdert overtollige zuur terwijl de pH-waarde laag is. </li><li> Plaats een nieuwe pre-gekoelde 10 l 0,1 x MEM en roer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Herhaal de vorige stap door het vervangen met een nieuwe pre-cooled 10 l 0,1 x MEM en roer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Aliquot collageenoplossing in steriele 50 ml. Winkel aliquots bij 4 ° C. Houd 6-12 maanden, alleen omgaan met het collageen voorraad in de weefselkweek kap. </li><li> Het is belangrijk om te testen of de gezuiverd collageen moet worden verdund (in 0,1 X MEM) om optimale resultaten te verkrijgen in het collageen matrix assay. Daarom is het genereren van een collageen verdunningsreeks (onverdund collageen, 1:1, 1:2 en 1:5 verdund) en het uitvoeren van collageen matrix assays zoals hieronder beschreven om de optimale collageen verdunning te bepalen. </li></ol> 2. Dissectie van de dopaminerge middenhersenen 7,8 <ol><li> Ontleden E14.5 muis embryo&#39;s uit de baarmoeder van de moeder en houden L15 medium op ijs totdat het nodig is. </li></ol> Alle volgende sectie stappen uitgevoerd in L15 medium op ijs. <ol start="2"><li> Ontleden van de hersenen. </li><li> Verwijder de grote hersenen door te snijden langs de mediale deel van elk telencephalic blaasje (gebruik de telencephalic blaasjes voor striatale explantaten). </li><li> Verwijder de meningeale schede. </li><li> Maak een dorsoventral cut net rostraal van de mesencephalic buiging. </li><li> Maak nog een dorsoventral cut net caudaal van de mesencephalic buiging. </li><li> Maak een rostrocaudal snede langs de dorsale middellijn met een microdissection mes om de onderliggende ventrale middenhersenen weefsel bloot te leggen. Wees voorzichtig dat u de ventrale middenhersenen weefsel raken, want het bevat de dopaminerge neuronen (figuur 2). </li><li> Maak twee rostrocaudal sneden laterale en parallel aan de ventrale middellijn aan dorsale middenhersenen weefsel te verwijderen. </li><li> Verdeel de resterende ventrale middenhersenen weefsel in explantaten met een microdissectie mes. </li><li> Bewaar de explantaten in L15 medium bevattende 5% FBS op ijs tot gebruik. </li></ol> 3. Dissectie van het striatum Alle ontleding stappen uitgevoerd in L15 medium op ijs. <ol><li> Gebruik telencephalic blaasjes ontleed tijdens de middenhersenen dissectie. </li><li> Verwijder de thalamus door te snijden tussen de thalamus en het striatum behulp van een tang. </li><li> Maak een mediolaterale snede rostraal van de striatum te rostrale structuren te verwijderen, zoals de bulbus olfactorius. Herhaal deze stap voor weefsel caudaal gelegen aan het striatum. </li><li> Positiede resterende segment naar een transversale weergave van het striatum verkrijgen (Figuur 2). </li><li> De striatum kunnen worden herkend als een minder dicht (meer transparant) van weefsel. Ontleden van het striatum en snijd deze in explantaten met een microdissectie mes. Vermijd de iets donkerder weefsel in de buurt van de middellijn, die migratie van neuronen van de laterale en mediale ganglion eminentie bevat. </li><li> Bewaar de explantaten in L15 medium bevattende 5% FBS op ijs tot gebruik. </li></ol> 4. Vergadering Collageen Matrix Assays Voorbereiding van het collageen (alle stappen op het ijs, gebruik gekoeld pipetpunten) <ol><li> Meng 860 pi verdund collageen met 100 ul 10x MEM en 40 ul 1 M natrium (NaHCO 3) te houden op ijs. Als op dit punt het collageen opwarmt, zal stollen. </li><li> Voeg een druppel 20 ul (ongeveer 5 mm diameter) bereide collageen een dekglaasje in een putje van een 4-well Nunc schotelen laat in een CO2 incubator staan ​​bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 30 min (omgevingstemperatuur O 2 concentratie voldoende). Tijdens deze incubatie de collageen verstijfselen. </li></ol> Setup co-cultuur in collageen-gel <ol start="3"><li> Na het collageen is ontsloten, gebruik dan een pipet met een 200 ul tip om een ​​dopaminerge of striatale explant over te dragen aan het collageen. </li><li> Verplaats de explantaten dicht bij elkaar met behulp van een naald. Elkaar gehouden kunnen op een afstand van ongeveer de diameter van een explantaat (~ 200-300 urn) (Figuur 2). </li><li> Overtollig medium en voeg 20 pl bereid collageen bovenop de explantaten. Dit zal veroorzaken vaak explantaten te bewegen. Plaats de explantaten behulp van een naald, zoals beschreven in 4.4. </li><li> Laat de collageen stollen gedurende 15 minuten bij RT gevolgd door 30 min bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Na het collageen heeft, voeg 400 ul van explant medium en 2-3 dagen in een CO2 incubator bij 37 ° C groeien en 5% CO2. </li></ol> 5. Analyse door immunohistochemie en kwantificering Immunohistochemie <ol><li> Om explantaten vast voorzichtig toevoegen 400 ul 8% paraformaldehyde (PFA) in PBS 400 ul medium (waarbij verdunning van het PFA 4%) en laten staan ​​gedurende 1 uur bij RT. </li><li> Was 3x 15 min in PBS bij KT. </li><li> Incubeer in blokkeringsbuffer (BB, PBS + 1% FBS + 0,1% Triton X-100) gedurende 2 uur. </li><li> Incubeer &#39;s nachts met primaire antilichaam in BB bij 4 ° C. Voor dopaminerge axonen gebruik van anti-tyrosine hydroxylase antilichamen (1:1000) 7, voor het striatum axonen anti-DARPP32 antilichamen (1:500) 9 en voor het visualiseren van alle axonen anti-βIII tubuline (1:3000) 7. </li><li> Was 5x 1 uur in PBS bij RT. </li><li> &#39;S nachts Incubeer met secundaire antilichaam geconjugeerd aan het juiste fluorofoor (1:500) in BB op 4° C. Vanaf deze stap op het risico op blootstelling van de explantaten voor licht (bijv. ze te bedekken met aluminiumfolie). </li><li> Was nacht in PBS bij 4 ° C gevolgd door verschillende wassen tijdens de volgende dag. </li><li> Monteer explantaten op objectglaasjes met Verleng Antifade reagens montage medium. Voeg een druppel ~ 10 pi van een microscoopglaasje. Neem de dekglaasje en voorzichtig te plaatsen op de daling van montage medium met de explant kant naar beneden. Vermijd het vangen van alle lucht onder de dekglaasje door zeer voorzichtig verlagen van het op de daling van de montage-medium. </li></ol> Kwantificering door het berekenen van P / D-verhouding <ol start="9"><li> Verwerven digitale beelden van de explantaten met een epifluorescentiemicroscoop (figuur 3). </li><li> Met deze beelden verdelen elke explantaat in kwadranten met een proximaal kwadrant (dat wil zeggen van het explantaat dichtst bij de aangrenzende explantaat) en een distaal kwadrant (deel van het explantaat verst van de aangrenzende toelichting genererennt) (Figuur 2, 4). </li><li> Meet de lengte van 20 langste neurieten die uit het explantaat zowel de proximale en distale kwadranten. </li><li> Gebruik de gemiddelde lengte van de 20 langste neurieten naar de P / D ratio te berekenen voor elke individuele explant. AP / D ratio&gt; 1 geeft aan axon attractie, terwijl een ratio &lt;1 duidt axon afstoting. </li><li> In sommige gevallen de dichte groei van neurieten voorkomt de beoordeling van afzonderlijke neurite lengte. In deze gevallen kan kwantificering uitgevoerd door de afstand tussen de rand van het explantaat en de leidende voorkant van axongroei in de proximale en distale kwadranten. </li></ol> 6. Afbeeldingen slechts ter illustratie Na een succesvolle cultuur van dopaminerge en het striatum explantaten een groot aantal axonen zijn zichtbaar met behulp van helder veld microscopie of gevisualiseerd door anti-βIII tubuline immunocytochemie (niet afgebeeld). Een subset van deze axonen zijn dopaminerge of s<html> triatal axonen als gevisualiseerd met behulp van immunocytochemie (figuur 3). Door het verdelen van de explantaten in kwadranten zoals beschreven en het bepalen van P / D ratio&#39;s, kan een vermeende axon aantrekkelijke of afstotende effect gekwantificeerd worden (figuur 3E). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig1.jpg" /> Figuur 1. Foto&#39;s ter illustratie van de vervaardiging van collageen uit rattenstaart pezen. A) uit elkaar trekken van de rattenstaart onthult de pezen. B) Pezen zijn zichtbaar als touw-achtige bundels. C) De pezen zijn gemakkelijk te uit aderen onderscheiden door hun glanzend witte verschijning. D) Na oplossen van de pezen in azijnzuur wordt de oplossing overgebracht naar dialysebuis. Om de opgeloste collageen koud te houden, worden buisjes geplaatst op steriele aluminiumfolie op ijs. e 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg &quot;/&gt; Figuur 2. Schematische aanduiding van de verschillende stappen van de procedure. Geschikte gebieden van de hersenen worden ontleed en gesneden explantaten te genereren. Een middenhersenen en striatum explantaat gepositioneerd in de nabijheid van een collageenmatrix en liet men gedurende 48-72 uur kweken bij 37 ° C. Axonen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentie immunohistochemie en een P / D-ratio wordt berekend aan chemotropic reacties te kwantificeren. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig3.jpg" /> Figuur 3. Vertegenwoordiger resultaten laten zien axon groei in een collageen matrix cultuur. A) middenhersenen explant gekleurd met anti-tyrosine hydroxylase antilichaam onthullen axon uitgroei. Gestippelde lijn geeft aangrenzende explant. B) vergroting van een met individuele neurieten en groei kegels (pijlen). C) striatale explant gekleurd met anti-DARPP32. D) Vergroting van C met individuele neurieten. E) VoorbeeldP / D-verhouding kwantificering. Explantaten zijn in gelijke kwadranten. Het proximale kwadrant wordt naar de aangrenzende explantaat terwijl het distale kwadrant is afgelegen gericht. Schaal balken geven de 100 micrometer.

<ol><li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+connected+in+the+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li>
<li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li>
<li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li>
<li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li>
<li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li>
<li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li>
<li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation%2C+channeling%2C+rostral+growth%2C+and+intracortical+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li>
<li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li>
<li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li>
<li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

De matrix van collageen-test hier beschreven is gebruikt en verbeterd door veel verschillende laboratoria in de afgelopen decennia aan een verscheidenheid van axon begeleiding moleculen en neuronale systemen te onderzoeken (zie bijvoorbeeld referenties 5-8). Deze studies hebben aangetoond dat deze test is een krachtig instrument voor het bestuderen van de effecten en de regulatie van axon begeleiding moleculen die afgescheiden wordt door verschillende (tussen) doel weefsels. Er moet echter w...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Foetaal Calf Serum </td><td> BioWhittaker </td><td> 14 801F </td><td></td></tr><tr><td> Glutamine (200 mm) </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> VWR International </td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-mercapto </td><td> Merck </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Media (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz&#39;s L-15 Medium </td><td> Gibco </td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Verleng Gold Antifade Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> Dialysebuis </td><td> Spectrum Labs </td><td> 132660 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-tyrosine hydroxylase </td><td> Pel-Freez </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td> Konijn anti-Darpp32 (H-62) </td><td> Santa-Cruz </td><td> Sc-11365 </td><td></td></tr><tr><td> Muis anti-βIII tubuline </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor gelabelde secundaire antilichamen </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissectie en cultuur van de muis dopaminerge en het striatum explantaten in drie-dimensionale collageen matrix assays

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dopaminesysteem (mdDA) neuronen project via de mediale voorhersenen bundel naar verschillende gebieden in de grote hersenen, waaronder het striatum 1. Omgekeerd, medium stekelige neuronen in het striatum die aanleiding geven tot de striatonigrale (directe) route innerveren de substantia nigra 2. De ontwikkeling van deze axon stukken is afhankelijk van de combinatorische acties van een overvloed aan axon groei en begeleiding signalen met inbegrip van moleculen die zijn vrijgegeven door neurieten of door (tussen) doel de regio&#39;s 3,4. Deze oplosbare factoren kunnen worden bestudeerd in vitro door het kweken mdDA en / of striatum explantaten een collageenmatrix met een driedimensionale substraat voor het nabootsen axons de extracellulaire omgeving zorgt. Bovendien is de collageenmatrix maakt de vorming van relatief stabiele gradiënten van eiwitten vrijgegeven door andere explantaten of cellen die in de nabijheid (zie bijvoorbeeld referenties 5 en 6). Hier beschrijven werkwijzen voor het purultieme controle van rattenstaart collageen, microdissectie van dopaminerge en het striatum explantaten, hun cultuur in collageen gels en de daarop volgende immunohistochemische en kwantitatieve analyse. Ten eerste, de hersenen van E14.5 muizenembryo&#39;s zijn geïsoleerd en dopaminerge en het striatum explantaten zijn gemicrodissecteerde. Deze explantaten worden vervolgens (co) gekweekt in collageengels op dekglaasjes 48 tot 72 uur in vitro. Vervolgens axonale projecties zijn gevisualiseerd met behulp van neuronale markers (bijvoorbeeld tyrosine hydroxylase, DARPP32 of βIII tubuline) en axongroei en aantrekkelijke of afstotende axon antwoorden worden gekwantificeerd. Deze neuronale voorbereiding is een handig hulpmiddel voor in vitro studies van de cellulaire en moleculaire mechanismen van mesostriatal en striatonigrale axongroei en begeleiding tijdens de ontwikkeling. Met deze assay, is het ook mogelijk om andere (tussen) doelen voor dopaminerge en striatum axonen beoordelen of specifieke moleculaire signalen testen.

Explantaten de dopaminesysteem en striatum worden gebruikt in een collageenmatrix test voor het<em&gt; In vitro</em&gt; Analyse van mesostriatal en striatonigrale traject ontwikkeling. In deze test axonale uitgroei en begeleiding kan worden gemanipuleerd en gekwantificeerd. Het kan ook worden aangepast voor het beoordelen van andere regio&#39;s of moleculaire signalen.

Dissectie en Cultuur van de muis Dopaminerge en het striatum Explantaten in drie-dimensionale Collageen Matrix Assays

Midbrain-dopamineneuronen (mdDA) projecteren via de mediale forebrain bundle naar verschillende gebieden in het telencefalon, waaronder het striatum1. ...

Het algemene doel van deze procedure is het kweken van dopaminerge en striatale explantaten om de ontwikkeling van de mesostriatale en nigrostriatale banen te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst het striatum en het dopaminerge middenbrein uit E 14.5 muisembryo's micro-dissecteerbaar te maken. De tweede stap bestaat uit het uitsnijden van explantaten van de juiste grootte uit het gedissecteerde weefsel.Vervolgens worden de explantaten in een collageengel geplaatst, dicht bij elkaar. De laatste stap is om deze explantaten gedurende een periode van twee tot drie dagen te cultiveren om axonale uitgroei mogelijk te maken. Ten slotte wordt immunohistochemie voor specifieke neuronale markers gebruikt om attractieve of repulsieve axonale reacties aan te tonen en te kwantificeren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals gedissocieerde of twee DX-explantaatculturen, is dat de collageenmatrix een driedimensionaal substraat biedt voor de exonen dat de extracellulaire omgeving nabootst. Bovendien maakt de collageenmatrix de vorming mogelijk van relatief stabiele gradiënten van eiwitten die worden afgegeven door X-explantaten of cellen die in de nabijheid zijn geplaatst. De procedure zal worden gedemonstreerd door Ava Smith en Francesca, eveneens twee promovendi uit mijn laboratorium.Om deze procedure te starten, worden de muizenembryo's van E 14.5 uit de baarmoeder van de moeder gedisseceerd. Bewaar deze in L 15-medium op ijs tot ze nodig zijn. Plaats vervolgens een embryo onder de microscoop en isoleer de hersenen uit het embryo.Verwijder vervolgens het cephalon door langs het mediale deel van elke cephalische blaas te snijden. Verwijder daarna de meningeale schede. Maak een dorso-ventrale snede net rostraal van de mediale cephalische flexuur.Maak vervolgens een tweede dorsaal-ventrale snede net naast de cephalische flexuur. Maak daarna een transversale snede langs de dorsale middellijn met een microdissectiemes om het onderliggende ventrale middenhersenweefsel bloot te leggen. Wees voorzichtig om het ventrale middenhersenweefsel niet te beschadigen, aangezien dit de dopaminerge neuronen bevat.Maak vervolgens twee rostrale coddle-insnijdingen, lateraal en parallel aan de ventrale middenlijn, om het dorsale midbrain-weefsel te verwijderen. Verdeel daarna het resterende ventrale midbrain-weefsel in X explanten met een microdissectiemes aan het uiteinde van de opslag. Bewaar de X explanten in L 15-medium met 5% FBS op ijs tot gebruik.Breng nu de cephalische blaasjes van de zalm, die eerder tijdens de dissectie van de middenhersenen zijn verkregen, over naar de microscoop. Verwijder de thalamus door tussen de thalamus en het satu te snijden met een pincet. Maak vervolgens een mediaal-laterale snede rostraal van het striatum om de rostrale structuren, zoals de bulbus olfactorius, te verwijderen.Herhaal deze stap vervolgens voor het weefsel dat zich caudaal ten opzichte van het striatum bevindt. Positioneer daarna de resterende coupes om een coronaal aanzicht van het striatum te verkrijgen. Het striatum is herkenbaar als een iets transparanter deel van het weefsel.Isoleer vervolgens het striatum en snijd dit vervolgens in implantaten met een microdissectiemes. Vermijd het iets donkerdere weefsel dicht bij de middenlijn, dat migrerende neuronen van de laterale en mediale ganglion eminence bevat. Voeg een druppel bereid collageen toe aan een dekglasje in de put van een vier-puts schaaltje.Bewaar dit gedurende 30 minuten in de incubator bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Het collageen zal tijdens deze incubatie gelatineren. Nadat het collageen is gegelatiniseerd, gebruikt u een pipet met een 200 µL tip om de dopaminerge of sal-explantaten over te brengen naar het collageen.Verplaats vervolgens de explantaten met een naald naar elkaar toe, zodat ze zich vlakbij elkaar bevinden. Houd een afstand tussen hen van ongeveer de diameter van één explantaat. Verwijder daarna het overtollige medium.Voeg 20 µL van het voorbereide collageen toe bovenop het explantaat. Dit zal er vaak toe leiden dat de explantaten verschuiven. Positioneer de explantaten opnieuw met behulp van een naald.Laat het collageen 15 minuten uitharden bij kamertemperatuur. Plaats het vervolgens gedurende 30 minuten in de incubator op 37 °C met 5% koolstofdioxide. Nadat het collageen is gestold, voegt u 400 µL explanmedium toe en laat u dit twee tot drie dagen groeien in de incubator op 37 °C.Om de preparaten voorzichtig te fixeren, voegt u 4% paraformaldehyde toe en bewaart u deze gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was ze na één uur drie keer in PBS bij kamertemperatuur, telkens gedurende 15 minuten.Verwijder vervolgens de PBS en incubeer de monsters gedurende twee uur in blokkeringsbuffer. Incubeer ze daarna een nacht bij vier graden Celsius met de primaire antistoffen en blokkeringsbuffer. Was ze de volgende dag vijf keer in PBS bij kamertemperatuur, telkens gedurende één uur. Incubeer ze vervolgens met de secundaire antistoffen die geconjugeerd zijn aan de juiste fluorofoor.Vier uur in blokkeringsbuffer gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Vanaf deze stap moeten de explantaten worden afgedekt met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te minimaliseren. Was ze gedurende de nacht in PBS bij vier graden Celsius, gevolgd door meerdere wasbeurten de volgende dag.Monteer vervolgens de explantaten op het microscoopOBJECTGLAS met behulp van een langdurig anti-fade montagemedium, waarbij de zijde met het explantaat naar beneden is gericht. Plaats zeer voorzichtig een dekglas op het montagemedium om te voorkomen dat er luchtbellen onder het glas opgesloten raken. Neem daarna digitale beelden van de x explantaten op met een epifluorescentiemicroscoop.Verdeel met behulp van deze afbeeldingen elk X-explantaat in kwadranten om een proximaal kwadrant en een distaal kwadrant te genereren. Meet daarna de lengte van de 20 langste neurieten die uit het X-explantaat groeien, zowel in het proximale als in het distale kwadrant. Gebruik de gemiddelde lengte van de 20 langste neurieten om de proximaal-distale ratio voor elk individueel explantaat te berekenen.Een proximaal-distale ratio groter dan één wijst op axonale attractie, terwijl een ratio kleiner dan één wijst op axonale repulsie. Hier wordt een middenhersenen-explant getoond, gekleurd met anti-tyrosinehydroxylase-antilichamen, waarin de axonale uitgroei zichtbaar is.De stippellijn geeft de aangrenzende explantaten aan. De pijlen hier geven individuele neurieten en groeikegels aan. Hier is een voorbeeld van de kwantificering van de proximaal-distale ratio.Deze zijn verdeeld in gelijke kwadranten. Het proximale kwadrant is gericht naar de aangrenzende X-explantaten, terwijl het distale kwadrant ervan afgewend is. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u dopaminerge en strato-explantaten samen kunt kweken om de ontwikkeling van de mesiale en nigrale pathways te onderzoeken en om de moleculaire mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij de vorming van deze pathways.

dissection-culture-mouse-dopaminergic-striatal-explants-three

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze test evalueert het vermogen van een signaalmolecuul, hier botmorfogenetisch proteïne 7 (BMP7), om commissural axonen te heroriënteren. Een explant van embryonale dorsale ruggenmerg is gekweekt grenst aan een totaal van COS-cellen afscheiden van de kandidaat groeifactoren. Geheroriënteerd commissural axonen groeien binnen de explantatie worden gevisualiseerd door immunohistochemie.

Het testen van het vermogen van diffundeerbare signaalmoleculen om Embryonale Spinal Commissural Axonen Heroriënteer

Laten we zien hoe te ontleden en cultuur chick E4 statoacoustic ganglion en E6 ruggenmerg explantaten. Explantaten worden gekweekt onder serum-vrije omstandigheden in 3D collageen gels voor 24 uur. Neurieten responsiviteit is getest met de groei factor-aangevuld medium en met eiwit-gecoate kralen.

Dissectie en Cultuur van Chick Statoacoustic Ganglion en Spinal Cord Explantaten in Collageen Gels voor neurietuitgroei Assays

This video outlines a method for cultivating dopaminergic neurons from mouse embryonic brain tissue. The process includes treating the midbrain with a proteolytic enzyme, detaching the cells, and culturing them on polymer-coated coverslips in a nutrient-rich medium with antibiotics for their growth and long-term viability.

Culturing and Maintaining Dopaminergic Neurons from Mouse Embryonic Brain Tissue

The video demonstrates the process of isolating and culturing dopamine neurons from the midbrain of mouse embryos. The isolated ventral midbrain floors are dissociated using enzymes. The resulting dopamine neurons are harvested and transferred into micro-islands inside multi-well plates. The cells are incubated with a dopamine neuron medium to maintain the cells at a high density inside the micro-islands.

Isolation and Culture of Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gelijktijdig opwekken van neurale precursoren celculturen, hetzij als hechtende monolagen of neurosferen, uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van individuele volwassen muizen.

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

Dopaminerge neuronen spelen een essentiële regulerende rol in de hersenen. Hun verlies wordt geassocieerd met de ziekte van Parkinson. In deze video laten we zien hoe je primaire culturen van centrale dopaminerge neuronen kunt genereren vanuit embryonaal muizen mesencephalon. Dergelijke culturen zijn nuttig om de extreme kwetsbaarheid van deze neuronen voor verschillende stressfactoren te bestuderen.

Primaire Cultuur van de Muis dopaminerge neuronen

Inzicht in de complexe werkingen van de hersenen vereist geavanceerde onderzoeksinstrumenten. Hier demonstreren we een nieuwe op zijde-collageen gebaseerd 3D-geengineerd model van zenuwweefsel dat lijkt op een hersen-achtige architectuur. Het model kan worden gebruikt om de assemblage van neuronale netwerken, axongeleide, cel-cel interacties en elektrische activiteit te bestuderen.

Engineered 3D Silk-collageen-gebaseerde model van de gepolariseerde zenuwweefsel

Bij de ziekte van Parkinson (PD), substantia nigra (SNC) dopaminerge neuronen degenereren, waardoor motorische stoornissen. Hier melden wij een protocol voor het kweken van ventrale middenhersenen neuronen van een muis tot expressie eGFP gedreven door een tyrosine hydroxylase (TH) promotor sequentie, het oogsten van individuele fluorescerende neuronen uit de culturen, en het meten van hun transcriptoom met behulp van RNA-seq.

Betrouwbare identificatie van de levens- dopaminerge neuronen in de middenhersenen Cultures Met behulp van RNA Sequencing en TH-promotor-driven eGFP Expression

In dit verslag zijn de voordelen van organotypic culturen en gedissocieerde primaire culturen van muis-afgeleide dorsal root ganglia gemarkeerd om te onderzoeken van een breed scala van mechanismen die zijn gekoppeld aan neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, neuroinflammation, en reactie op virale infectie.

Volwassen muis DRG Explant en losgekoppeld van cel modellen om te onderzoeken Neuroplasticiteit en reacties op milieu beledigingen, met inbegrip van de virale infectie

Hier presenteren we een protocol voor 3D-cultuur systemen bij het zelf monteren van peptide steigers ter bevordering van de differentiatie van dedifferentiated menselijke articulaire chondrocyten in kraakbeen-achtig weefsel.

Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers

Hier bieden wij een methode voor het analyseren van het gedrag van de groeiende axonen in 3D-matrices, het nabootsen van hun natuurlijke ontwikkeling.

Generatie van 3-D collageen-based hydrogels om axonale groei en gedrag te analyseren tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel

Leer de dissectie en cultuur van dopaminerge en striatale explantaten uit muizenembryo's in een collageenmatrix. Deze methode maakt kwantificering van axonale groei en geleiding in driedimensionale omstandigheden mogelijk.

Dissectie en Cultuur van de muis Dopaminerge en het striatum Explantaten in drie-dimensionale Collageen Matrix Assays

Meer video's verkennen