Dissectie en Cultuur van de muis Dopaminerge en het striatum Explantaten in drie-dimensionale Collageen Matrix Assays

Het algemene doel van deze procedure is het kweken van dopaminerge en striatale explantaten om de ontwikkeling van de mesostriatale en nigrostriatale banen te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst het striatum en het dopaminerge middenbrein uit E 14.5 muisembryo's micro-dissecteerbaar te maken. De tweede stap bestaat uit het uitsnijden van explantaten van de juiste grootte uit het gedissecteerde weefsel.

Vervolgens worden de explantaten in een collageengel geplaatst, dicht bij elkaar. De laatste stap is om deze explantaten gedurende een periode van twee tot drie dagen te cultiveren om axonale uitgroei mogelijk te maken. Ten slotte wordt immunohistochemie voor specifieke neuronale markers gebruikt om attractieve of repulsieve axonale reacties aan te tonen en te kwantificeren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals gedissocieerde of twee DX-explantaatculturen, is dat de collageenmatrix een driedimensionaal substraat biedt voor de exonen dat de extracellulaire omgeving nabootst. Bovendien maakt de collageenmatrix de vorming mogelijk van relatief stabiele gradiënten van eiwitten die worden afgegeven door X-explantaten of cellen die in de nabijheid zijn geplaatst. De procedure zal worden gedemonstreerd door Ava Smith en Francesca, eveneens twee promovendi uit mijn laboratorium.

Om deze procedure te starten, worden de muizenembryo's van E 14.5 uit de baarmoeder van de moeder gedisseceerd. Bewaar deze in L 15-medium op ijs tot ze nodig zijn. Plaats vervolgens een embryo onder de microscoop en isoleer de hersenen uit het embryo.

Verwijder vervolgens het cephalon door langs het mediale deel van elke cephalische blaas te snijden. Verwijder daarna de meningeale schede. Maak een dorso-ventrale snede net rostraal van de mediale cephalische flexuur.

Maak vervolgens een tweede dorsaal-ventrale snede net naast de cephalische flexuur. Maak daarna een transversale snede langs de dorsale middellijn met een microdissectiemes om het onderliggende ventrale middenhersenweefsel bloot te leggen. Wees voorzichtig om het ventrale middenhersenweefsel niet te beschadigen, aangezien dit de dopaminerge neuronen bevat.

Maak vervolgens twee rostrale coddle-insnijdingen, lateraal en parallel aan de ventrale middenlijn, om het dorsale midbrain-weefsel te verwijderen. Verdeel daarna het resterende ventrale midbrain-weefsel in X explanten met een microdissectiemes aan het uiteinde van de opslag. Bewaar de X explanten in L 15-medium met 5% FBS op ijs tot gebruik.

Breng nu de cephalische blaasjes van de zalm, die eerder tijdens de dissectie van de middenhersenen zijn verkregen, over naar de microscoop. Verwijder de thalamus door tussen de thalamus en het satu te snijden met een pincet. Maak vervolgens een mediaal-laterale snede rostraal van het striatum om de rostrale structuren, zoals de bulbus olfactorius, te verwijderen.

Herhaal deze stap vervolgens voor het weefsel dat zich caudaal ten opzichte van het striatum bevindt. Positioneer daarna de resterende coupes om een coronaal aanzicht van het striatum te verkrijgen. Het striatum is herkenbaar als een iets transparanter deel van het weefsel.

Isoleer vervolgens het striatum en snijd dit vervolgens in implantaten met een microdissectiemes. Vermijd het iets donkerdere weefsel dicht bij de middenlijn, dat migrerende neuronen van de laterale en mediale ganglion eminence bevat. Voeg een druppel bereid collageen toe aan een dekglasje in de put van een vier-puts schaaltje.

Bewaar dit gedurende 30 minuten in de incubator bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Het collageen zal tijdens deze incubatie gelatineren. Nadat het collageen is gegelatiniseerd, gebruikt u een pipet met een 200 µL tip om de dopaminerge of sal-explantaten over te brengen naar het collageen.

Verplaats vervolgens de explantaten met een naald naar elkaar toe, zodat ze zich vlakbij elkaar bevinden. Houd een afstand tussen hen van ongeveer de diameter van één explantaat. Verwijder daarna het overtollige medium.

Voeg 20 µL van het voorbereide collageen toe bovenop het explantaat. Dit zal er vaak toe leiden dat de explantaten verschuiven. Positioneer de explantaten opnieuw met behulp van een naald.

Laat het collageen 15 minuten uitharden bij kamertemperatuur. Plaats het vervolgens gedurende 30 minuten in de incubator op 37 °C met 5% koolstofdioxide. Nadat het collageen is gestold, voegt u 400 µL explanmedium toe en laat u dit twee tot drie dagen groeien in de incubator op 37 °C.

Om de preparaten voorzichtig te fixeren, voegt u 4% paraformaldehyde toe en bewaart u deze gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was ze na één uur drie keer in PBS bij kamertemperatuur, telkens gedurende 15 minuten.

Verwijder vervolgens de PBS en incubeer de monsters gedurende twee uur in blokkeringsbuffer. Incubeer ze daarna een nacht bij vier graden Celsius met de primaire antistoffen en blokkeringsbuffer. Was ze de volgende dag vijf keer in PBS bij kamertemperatuur, telkens gedurende één uur. Incubeer ze vervolgens met de secundaire antistoffen die geconjugeerd zijn aan de juiste fluorofoor.

Vier uur in blokkeringsbuffer gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Vanaf deze stap moeten de explantaten worden afgedekt met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te minimaliseren. Was ze gedurende de nacht in PBS bij vier graden Celsius, gevolgd door meerdere wasbeurten de volgende dag.

Monteer vervolgens de explantaten op het microscoopOBJECTGLAS met behulp van een langdurig anti-fade montagemedium, waarbij de zijde met het explantaat naar beneden is gericht. Plaats zeer voorzichtig een dekglas op het montagemedium om te voorkomen dat er luchtbellen onder het glas opgesloten raken. Neem daarna digitale beelden van de x explantaten op met een epifluorescentiemicroscoop.

Verdeel met behulp van deze afbeeldingen elk X-explantaat in kwadranten om een proximaal kwadrant en een distaal kwadrant te genereren. Meet daarna de lengte van de 20 langste neurieten die uit het X-explantaat groeien, zowel in het proximale als in het distale kwadrant. Gebruik de gemiddelde lengte van de 20 langste neurieten om de proximaal-distale ratio voor elk individueel explantaat te berekenen.

Een proximaal-distale ratio groter dan één wijst op axonale attractie, terwijl een ratio kleiner dan één wijst op axonale repulsie. Hier wordt een middenhersenen-explant getoond, gekleurd met anti-tyrosinehydroxylase-antilichamen, waarin de axonale uitgroei zichtbaar is.

De stippellijn geeft de aangrenzende explantaten aan. De pijlen hier geven individuele neurieten en groeikegels aan. Hier is een voorbeeld van de kwantificering van de proximaal-distale ratio.

Deze zijn verdeeld in gelijke kwadranten. Het proximale kwadrant is gericht naar de aangrenzende X-explantaten, terwijl het distale kwadrant ervan afgewend is. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u dopaminerge en strato-explantaten samen kunt kweken om de ontwikkeling van de mesiale en nigrale pathways te onderzoeken en om de moleculaire mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij de vorming van deze pathways.