Het beoordelen van Teratogene Veranderingen in een zebravis model van foetale blootstelling aan alcohol

Het algemene doel van deze procedure is om de effecten van blootstelling aan ethanol op de ontwikkeling van de zebravis te bestuderen. Dit wordt bereikt door de zebravissen tijdens de vroege ontwikkeling eerst bloot te stellen aan doses ethanol in normaal embryo-water. Vervolgens wordt de ethanol verwijderd en krijgen de vissen de kans om zich te ontwikkelen tot het gewenste tijdstip.

Vervolgens worden zowel de grove fysieke veranderingen als wijzigingen in de genexpressie geanalyseerd in behandelde embryo's vergeleken met controle-embryo's. Ten slotte worden de embryo's gemanipuleerd met mRNA, morpholino's of geneesmiddelen om vast te stellen of de door ethanol geïnduceerde ontwikkelingsdefecten kunnen worden beïnvloed. Uiteindelijk tonen een combinatie van kwantitatieve PCR en in situ hybridisatie aan dat de effecten van ethanol op ontwikkelende zebravissenembryo's gekoppeld zijn aan veranderingen in de genexpressie.

Vervolgmanipulatie van genexpressieniveaus kan ethanol-geïnduceerde ontwikkelingsdefecten verbeteren of voorkomen. De technieken die we vandaag demonstreren, breiden onze kennis uit over de aard van het foetaal alcoholsyndroom en dienen ter conservering van ontwikkelingsprocessen bij vertebraten. De demonstratie van het behandelen van embryo's met ethanol zal worden gegeven door Steph Erhardt, een technicus in mijn laboratorium.

Kweek ze vanuit wild-type paringen tot het koepelstadium bij 28 °C in embryo-water. Verdeel de embryo's van een clutching over het gewenste aantal schaaltjes, met tussen de 10 en 50 embryo's per schaaltje. Voeg een ethanoloplossing van 0,2 tot 2,5% volume/volume in viswater toe aan de embryo's en plaats ze voor maximaal 24 uur na de gewenste blootstellingsduur terug in de incubator.

Vervang de ethanol die water bevat door vers embryo-water voor een specifieke ontwikkelingsperiode om mRNA te verzamelen voor kwantitatieve PCR. Plaats H-gematchte embryo's in eppendorfbuisjes. Verwijder het viswater en voeg lysisbuffer met TCEP toe.

Gebruik een gemotoriseerde pulverisator om de embryo's fysiek te dissociëren en plaats ze vervolgens in de centrifuge voor een langzame spin. Breng de opgeloste stof over naar een pre-clear kolom en centrifugeer daarna de kolom. Dit dient om gedissocieerde grote fragmenten te verwijderen.

Gebruik een RNA-isolatiekit om het RNA te extraheren. Synthetiseer vervolgens cDNA met standaardmethoden voor qPCR- of microarray-analyse om embryo's voor te bereiden op in situ hybridisatie en antilichaamkleuring. Fixeer embryo's van 6 tot 24 uur post-fertilisatie gedurende een nacht bij 4 °C in 4% paraformaldehyde, gevolgd door drie wasstappen in PBS plus 0,1% Tween.

Verwijder de choon met twee scherpe pincetten onder de microscoop. Verplaats de embryo's vervolgens naar methanol via een reeks vloeistofwisselingen met een toenemende methanolconcentratie en een afnemende PBT-concentratie. Nadat de embryo's naar 100% methanol zijn overgebracht, worden ze bewaard bij -20 °C om het kraakbeen te kleuren.

Laat de embryo's uitgroeien tot vijf of zes dagen na fertilisatie. Fixeer ze gedurende de nacht in 4% paraformaldehyde bij vier graden Celsius. Was ze vervolgens drie keer met PBT om te bepalen welke genexpressieniveaus zijn veranderd door blootstelling aan ethanol.

Voer QPCR uit door eerst primers te ontwerpen om de primers te valideren. Test deze op drie biologische monsters. Deze biologische controlemonsters kunnen van elke leeftijd zijn, zolang het gen van belang op die specifieke leeftijd tot expressie komt.

Zodra de primers zijn geverifieerd, wordt het eerder geprepareerde cDNA gebruikt om qPCR uit te voeren, waarbij monsters in triplo worden geanalyseerd en een controlemonster voor een zebravis wordt opgenomen; wij gebruiken de primers voor gap dh. Normaliseer de resultaten ten opzichte van de gap DH-niveaus. Bereken vervolgens het relatieve niveau van genexpressie met behulp van de 2⁻ΔΔCt-methode.

Variatie op twee delta delta CT die het verschil in het experimentele type ten opzichte van het wildtype weergeeft. Voor in C twee hybridisatieconstructen. Met riboprobes gelabeld voor het gen van belang.

Incubeer deze vervolgens met embryo's van dezelfde leeftijd onder standaardcondities en detecteer het hybridisatiepatroon met alkalische fosfatase; beeld de monsters af met een dissectiemicroscoop om de morfogene ontwikkeling te beoordelen, zoals bijvoorbeeld de vorm. Beeld levende embryo's af om de interoculaire afstand en de lichaamslengte te bepalen. Fixeer de embryo's eerst in paraformaldehyde. Verzamel vervolgens beelden om de effecten van de alcoholbehandeling op de ontwikkelende kraakbeenstructuren in de larvekleuring te onderzoeken.

Fixeer de zebravis met lc en blauw gedurende enkele uren tot overnacht om de embryo's te fixeren en te klaren vóór de beeldvorming. Analyseer celsterfte in levende embryo's door deze gedurende één uur te incuberen in 5 mg/mL aine orange in PBS. Was de embryo's drie keer met PBS, monteer de embryo's vervolgens op objectglazen, beeld de monsters af met een confocale microscoop en gebruik Z-stacks om composieten te maken.

Nadat de genen zijn geïdentificeerd waarvan de expressie is afgenomen door blootstelling aan ethanol, injecteert u 25 tot 200 picograms per nanoliters capped mRNA van een gen van belang in het één- tot tweecelstadium. Laat de eitjes herstellen in een op 28 degree Celsius verwarmde incubator totdat ze het dome-stadium bereiken en behandel ze vervolgens zoals eerder beschreven met ethanol. Voor genen waarvan de expressie is toegenomen als gevolg van blootstelling aan ethanol, voert u een knockdown uit door picogram- tot nanogram-hoeveelheden antisense morphos te injecteren in embryo's in het één- tot tweecelstadium.

Dit protocol is vergelijkbaar met dat voor gecapt mRNA. Indien u een mRNA-splicing morphino injecteert, meet dan de efficiëntie met R-T-P-C-R om de hoeveelheden gespliceerde en ongespliceerde transcripten te vergelijken om de dosisafhankelijke genactiviteit te analyseren, titreer de geïnjecteerde morphino en laat de embryo's uitgroeien tot een gewenst stadium voordat u ze behandelt met ethanol. Blootstelling van zebravisembryo's aan ethanol resulteert in een reeks ontwikkelings- en genetische defecten die gerelateerd zijn aan de fenotypen die bij andere vertebraten worden gevonden.

Abnormale ontwikkeling van axiale weefsels, waaronder Noor, leidt tot een verkorte en incidenteel onderbroken noord, wat gedeeltelijk leidt tot de latere abnormaliteiten in somieten zoals hier getoond. Terwijl de onbehandelde controles een sterke chevronvorm hebben, krijgen de met ethanol behandelde somieten het U-vormige uiterlijk dat wordt gezien bij verminderde sonic hedgehog-signalering. Zoals hier te zien is.

Een ander gevolg van blootstelling aan ethanol, mogelijk stroomafwaarts van vroege ontwikkelingsvertraging en daaropvolgende Noor-defecten, is een verkorte embryolengte. Deze bevinding is vergelijkbaar met het aanhouden van de prepubertaire fase en de kleine gestalte die wordt waargenomen bij kinderen die tijdens de ontwikkeling zijn blootgesteld aan ethanol, wat suggereert dat het zebravismodel relevant is voor het begrijpen van dit menselijke geboortedefect. In diermodellen is aangetoond dat ernstige blootstelling aan ethanol leidt tot uitgesproken fenotypes van het foetaal alcoholsyndroom, waaronder synthia en opia.

Bij zebravissen neemt de intraoculaire afstand of IOD af op een ethanol-dosisafhankelijke wijze, wat consistent is met de aard van de menselijke aangeboren afwijking. Opia wordt alleen waargenomen bij zeer hoge doses, maar lagere doses veroorzaken wel een significante afname van de IOD, wat suggereert dat dit diermodel een vergelijkbaar defect in de ontwikkeling van de midline van het gezicht vertoont. In deze figuur worden de vroege genexpressieniveaus van six3b en glee1 vergeleken in onbehandelde en met ethanol behandelde embryo's.

Beide genen vertoonden verminderde expressieniveaus in de met ethanol behandelde monsters. Met behulp van NC twee hybridisatie werden de expressiepatronen voor six three B en gooID geanalyseerd, zoals weergegeven. Hier vertoonden beide genen een afname in ruimtelijke expressie in met ethanol behandelde embryo's in vergelijking met onbehandelde controles.

Omdat beide genen tot expressie komen in weefsels die bestemd zijn om craniofaciale middenlijnweefsels te worden, is hun vermindering acht uur na bevruchting consistent met de vermindering van IOD later in de ontwikkeling. Zodra genen die beïnvloed worden door ethanol zijn geïdentificeerd, zijn er mechanismen waarmee hun expressie kan worden verhoogd of verlaagd. In dit voorbeeld werd mRNA geïnjecteerd voor sonic hedgehog, een ligand dat de niveaus van glee one verhoogt, wat de grove defecten als gevolg van verminderingen in glee one en ethanol-behandelde embryo's herstelde.

Injectie van six three B kon het door ethanol veroorzaakte fenotype echter niet herstellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de genetische en ontwikkelingsdefecten die door ethanol in een ontwikkelend zebravissenembryo worden veroorzaakt, kunt onderzoeken. De hier gebruikte technieken kunnen ook worden toegepast door onderzoekers die de toxiciteit van andere wateroplosbare verbindingen in het ontwikkelende embryonale stadium van vertebraten willen bestuderen.