Muis Sperma Cryopreservatie en herstel met behulp van de I · Cryo Kit
12 december 2011
Hier laten we zien de nieuw ontwikkelde I • Cryo-kit voor de muis sperma cryopreservatie. Twee-cellig stadium embryo ontwikkeling met ingevroren-ontdooid sperma werd steeds verbeterd in 5 muizenstammen met het gebruik van deze kit. Over een periode van 1,5 jaar werden 49 genetisch gemodificeerde muis lijnen gearchiveerd door sperma cryopreservatie met de I • Cryo-kit en later met succes teruggevorderd door IVF.
Het algemene doel van deze procedure is het cryopreserveren van muizensperma. Dit wordt bereikt door eerst sperma van muizen-EPI's te verzamelen met behulp van cryopreservatie-rietjes. De rietjes worden vervolgens ingevroren in vloeibare stikstof, waar ze worden bewaard totdat ze worden hersteld door ze ontdooien in warm water.
De herwonnen muizenzaadcellen worden uiteindelijk gebruikt voor in vitro fertilisatie. Het belangrijkste voordeel van deze kit ten opzichte van bestaande methoden is dat de kit alle benodigde materialen bevat voor de cryopreservatie en het herwinnen van muizenzaad. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het hanteren en laden van de straws. Begin met het klaarmaken van 15 straws voor cryopreservatie van zaad per lijn muizen die cryopreserveerd moet worden.
Verbind eerst elk rietje van 0,25 milliliter met een spuit van één milliliter, waarbij de katoenen prop het dichtst bij de spuit moet zitten. Vul vervolgens acht centimeter IVF-medium in elk rietje, gevolgd door één centimeter lucht. Label tot slot elk van de 15 rietjes met de naam van de lijn die voor elke te cryopreserveren lijn bewaard moet worden.
Vul een putje van een plaat met vier putjes met 240 µL cryobeschermingsmiddel. Bevestig een pipet van één milliliter aan het handvat van de vriescontainer om het handvat te verlengen. Vul tot slot de bij de kit geleverde schuimgeïsoleerde doos met 15 cm vloeibare stikstof en sluit het deksel om de euthanasie te voltooien.
Twee vruchtbare volwassen mannelijke muizen. Verwijder voor elke lijn die cryogeperserveerd en chirurgisch behandeld moet worden de caudale EPI's. Plaats de muis in rugligging en open de ventrale lichaamswand.
Trek voorzichtig aan de vast deferens en verwijder eventueel overtollig vet. Lokaliseer vervolgens de epididymis en verwijder deze intact samen met een klein stukje van de vast deferens. Plaats de EPI's onder een dissectiemicroscoop in een well van de voorbereide four-well dish die is gevuld met CPA.
Maak vijf tot zeven longitudinale incisies in elke epididymis. Knijp vervolgens voorzichtig in elk segment met een pincet. Om de zaadcellen naar buiten te duwen, wordt het mengsel van CPA en epididymis drie tot vijf minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd.
Schud de schaal tijdens de incubatie voorzichtig twee tot drie keer met de hand. Hierdoor kunnen de zaadcellen door aspiratie naar buiten zwemmen. Vul elk voorbereid rietje met vijf millimeter van de spermasuspensie, gevolgd door één centimeter lucht.
Voor het invriesproces is het belangrijk dat alle straws gelijkmatig zijn gevuld. Verhit na het vullen van alle 15 straws voorzichtig beide uiteinden van elke straw om deze te verzegelen. Om de overleving van het sperma te garanderen, moet het proces voor alle 15 straws binnen 10 minuten worden voltooid.
Zodra alle straws zijn voorbereid, worden deze in de spermacolom van de vriescontainer geplaatst. Plaats eerst de container in de schuimbox en laat deze verticaal drijven in de vloeibare stikstof. De container moet 10 minuten lang verticaal drijven, anders wordt de vriesnelheid van het sperma beïnvloed.
Dompel de canister vervolgens onder in de vloeibare stikstof. Het sperma is hiermee cryopreserveerd en gereed voor langdurige opslag in vloeibare stikstof. Ongeveer 60 uur voor een geplande sperma-terugwinning.
Volg het schriftelijke protocol voor de superovulatie van vrouwtjes vóór IVF. Bereid voor elk te ontdooien rietje alle media voor en laat deze ten minste één uur equilibreren bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Deze materialen omvatten een Petrischaal van 35 mm met een druppel van 90 µL spermabehandelingsmedium, bedekt met olie.
Gebruik een Petri-schaal van 35 millimeter met drie milliliters IVF-medium als snijschaal en bereid voor elke vijf superovulatie-vrouwtjes een IVF-schaal, bestaande uit één putje van een vier-putjes-plaat gevuld met 500 microliters IVF-medium. Bereid voor elke IVF-schaal een wasschaal, bestaande uit een Petri-schaal van 35 millimeter met drie milliliters KSOM, en een embryo-cultuurschaal, bestaande uit een Petri-schaal van 35 millimeter met druppels van 50 microliter KSOM-medium bedekt met olie. Wanneer alle benodigde materialen zijn klaargemaakt, haal dan snel een straw uit de opslag en plaats deze gedurende twee tot drie minuten in een waterbad van 37 degree Celsius.
Droog het rietje af. Maak vervolgens een schuine snede in de luchtkolom onder de wattenprop. Maak aan het andere uiteinde van het rietje nog een schuine snede over een andere luchtkolom.
Voorkom dat de spermacolonne wordt onderbroken. Aspireer nu de spermasuspensie aan het uiteinde van het rietje met een 200 µL pipet en breng deze aan in het midden van de druppel met spermabehandelingsmedium. Incubeer de schaal vervolgens gedurende 45 tot 60 minuten.
Isoleer tijdens de incubatie van het sperma de ucs van de superovulatie-behandelde vrouwtjes en breng deze over naar de snijschaal. Gebruik een naald van 30 gauge of een pincet om elke eileider open te scheuren, zodat de cumulus-cyt complexen vrijkomen. Breng de C Cs van vijf vrouwtjes over naar elke IVF.
Doe dit met een minimale hoeveelheid medium. Voorkom het overbrengen van vet en bloed, aangezien vervuild medium de fertilisatie-efficiëntie remt. Verzamel na de incubatie 10 tot 15 µL van de spermiesuspensie aan de rand van de STM-druppel en breng de suspensie over naar één IVF-druppel.
Kweek de cellen nu gedurende vier tot zes uur samen voor de bevruchting. Breng de embryo's na de bevruchting door ten minste 2K SOM-wassingen in de wasschaal. Kweek ze vervolgens verder.
De embryo's in KSOM tot het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt. Sperma van vijf ingeteelde muizenstammen van Charles River werd ingevroren. De beschermingsratio's voor sperm motility en rapid progressive motility varieerden van 81% tot 47% over de vijf stammen van dat sperma.
De IVF-percentages met ontdooide bevroren sperma varieerden in verschillende stammen van 26 tot 88% over een periode van anderhalf jaar. In totaal werden 49 genetisch gemodificeerde muizenlijnen gearchiveerd door middel van cryopreservatie van sperma en later hersteld via IVF in vier verschillende vrouwelijke stammen: C57BL/6, BC DBA/1 en 129SV. Zodra de techniek voor cryopreservatie van sperma onder de knie is, kan deze in 30 minuten worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast.
Voor deze procedure is het belangrijk om de canister verticaal te vullen met vloeibare stikstof.
Overzicht
Deze studie presenteert de I•Cryo kit voor effectieve cryopreservatie van muizenzaad, waarbij een verbeterde embryo-ontwikkeling bij meerdere muizenstammen wordt aangetoond. De kit vergemakkelijkt het archiveren van genetisch gemodificeerde muizenlijnen via cryopreservatie van sperma en daaropvolgende winning via IVF.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Reproductieve biologie
- Cryopreservatietechnieken
- In vitrofertilisatie (IVF)
Achtergrond
- Cryopreservatie van muizensperma is essentieel voor genetisch onderzoek.
- Bestaande methoden kunnen tekortschieten in efficiëntie en gebruiksgemak.
- De I•Cryo-kit is bedoeld om het cryopreservatieproces te stroomlijnen.
- Een succesvol herstel van sperma is cruciaal voor de resultaten van IVF.
Doel van de studie
- Om de effectiviteit van de I•Cryo-kit bij de cryopreservatie van muizensperma te evalueren.
- Om de impact van gecryopreserveerd sperma op de embryonale ontwikkeling te beoordelen.
- Om genetisch gemodificeerde muislijnen te archiveren voor toekomstig onderzoek.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van sperma uit de epididymis van muizen met behulp van cryopreservatiestro's.
- Invriezen van sperma in vloeibare stikstof voor langdurige bewaring.
- Ontdooien van sperma voor gebruik in IVF-procedures.
- Evaluatie van de spermobiliteit en IVF-succespercentages over verschillende stammen heen.
Belangrijkste resultaten
- Verbeterde embryo-ontwikkeling waargenomen in 5 muizenstammen met gebruik van de I•Cryo kit.
- 49 genetisch gemodificeerde muizenlijnen succesvol gearchiveerd en hersteld.
- Spermamobiliteitscijfers varieerden van 81% tot 47% tussen de stammen.
- IVF-percentages varieerden van 26% tot 88% met bevroren-ontdooid sperma.
Conclusies
- De I•Cryo-kit verhoogt de efficiëntie van de cryopreservatie van sperma aanzienlijk.
- Het succesvol herstellen van genetisch gemodificeerde lijnen ondersteunt het nut ervan in onderzoek.
- Verdere optimalisatie van de methode kan de verwerkingstijd verkorten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Cryopreservatie van muizensperma biedt een kostenefficiënte en schaalbare oplossing voor het archiveren van genetisch gemodificeerde stammen, waardoor de afhankelijkheid van levende dierkolonies wordt verminderd en de risico's op verlies van lijnen worden beperkt. De I•Cryo-kit vergroot het vertrouwen in de voorspelbaarheid van stamconservering door de motiliteit van het sperma na ontdooiing en de ontwikkeling van embryo's via IVF te verbeteren in meerdere ingedrukte achtergronden. Dit ondersteunt strategisch portfoliomanagement in preklinisch onderzoek door betrouwbare langetermijnopslag en herstel op aanvraag van waardevolle ziektemodellen mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele validatie van genetische modellen mogelijk door de terugwinbaarheid van sperma voor IVF-gebaseerde fenotypische screening te garanderen.
- Operationele waarde: Vermindert de last van dierhouderij en de kosten die gepaard gaan met het onderhouden van levende kolonies van modellen met een lage doorvoersnelheid of induceerbare modellen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerde spermabron voor consistente IVF-assays, wat bijdraagt aan een reproduceerbare evaluatie van het effect van verbindingen op de bevruchting en de vroege embryonale ontwikkeling.
- Operationele waarde: Vergemakkelijkt de gereedheid van assays door het gebruik van cryogebankte sperma, waardoor variabiliteit door verschillen tussen mannetjes of tussen batches bij de inzameling van verse monsters wordt geëlimineerd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Handhaaft de genetische integriteit van ziektemodellen over tijd, wat longitudinale studies en experimentele continuïteit over generaties heen mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Ondersteunt samenwerking tussen meerdere locaties door de distributie van cryopreserveerd sperma in plaats van levende dieren mogelijk te maken, waardoor de transportcomplexiteit en zorgen over biosafety worden verminderd.
Integratie van pipeline en workflow
De methode is geïntegreerd in de discovery-workflow, vanaf de vroege modelgeneratie tot aan de preklinische validatie, en dient als brug tussen genetische manipulatie en functionele fenotypering via IVF.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten door het mogelijk maken van herstel van cryopreserveerd sperma voor IVF, waardoor genetische modificaties op de fertiliteit en vroege embryogenese kunnen worden beoordeeld.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde IVF-gebaseerde assays mogelijk met ontdooid sperma, wat de reproduceerbaarheid bij het evalueren van de spermafunctie, capacitatie en fertilisatiecompetentie verbetert.
- Analytics: Genereert kwantitatieve resultaten zoals spermamotiliteit (% progressief), rapid progressive motiliteit en embryo-ontwikkelingspercentages, die dienen als basis voor go/no-go beslissingen over de stabiliteit van het model.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt genetische modificatie met ontwikkelingsuitkomsten door IVF met cryopreserveerd sperma mogelijk te maken, wat biomarker-gekoppelde fenotypische screening in preimplantatie-embryo's ondersteunt.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar cryobanking-platform voor de voortdurende archivering en het herstel van GM-lijnen, waardoor redundante herderivatie-inspanningen tussen projecten worden verminderd.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in modelbehoud door een verbeterde motiliteit en embryo-ontwikkeling aan te tonen ten opzichte van basis CPA-methoden.
- Operationele waarde: Standaardiseert de cryopreservatie-workflow via kit-gebaseerde componenten, waardoor gebruikersvariabiliteit en trainingstijd worden verminderd.
- Strategische waarde: Verlaagt de langetermijnkosten voor het behoud van stammen en vermindert het risico op onomkeerbaar verlies van lijnen als gevolg van fokproblemen, genetische drift of een uitbraak van pathogenen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van GM-lijnen voor archivering mogelijk op basis van strategische waarde, met vertrouwen in de toekomstige herstelbaarheid.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist technische vaardigheid in spermaverzameling, het hanteren van straws en hittesealing om de integriteit van het monster te waarborgen.
- Afhankelijk van toegang tot opslag in vloeibare stikstof en gecontroleerde ontdooiapparatuur (waterbad van 37°C) voor consistente prestaties na het ontdooien.
- Vraagt om gestandaardiseerde IVF-media en superovulatieprotocollen voor betrouwbare fertilisatie en embryo-kweekresultaten.
- Prestaties kunnen variëren per genetische achtergrond, waardoor stam-specifieke optimalisatie van incubatie- en wasstappen noodzakelijk is.
- Beperkt door de noodzaak van vruchtbare vrouwtjes en IVF-expertise voor spermaherwinning, wat de directe toepassing beperkt tot assays op basis van natuurlijke paring.
