Name: Muis Sperma Cryopreservatie en herstel met behulp van de I · Cryo Kit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Leer cryopreservatie van muizensperma met de I·Cryo kit voor reproductieve biologie. Deze methode archiveert genetisch gemodificeerde muizenlijnen via IVF met verbeterde embryonale ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het hier gepresenteerde onderzoek werd ondersteund door Charles River. De auteurs zijn het meest dankbaar voor de genetisch gemanipuleerde modellen en Services groep en de Embryologie personeel voor verzorging van dieren en hormoon injectie.

1. Muis sperma cryopreservatie <ol><li> Voor elke regel te zijn gecryoconserveerd, bereiden de volgende voordat u begint. <ol><li> Een goed van een 4-goed schotel met 240 l van de kit CPA </li><li> 15 sperma cryopreservatie rietjes als volgt <ol><li> Sluit de 0,25 ml rietjes tot het 1 ml spuiten met de katoenen stekker die het dichtst bij de spuit. In elke stro, load 8 cm (ongeveer 160 pl) van IVF medium, dan 1 cm van de lucht. Label de rietjes met de naam van de lijn te behouden. </li></ol></li></ol></li><li> LN 2 moet 15 cm diep in het schuim doos. Sluit het deksel. </li><li> Euthanaseren twee mannelijke muizen van elke regel te worden gecryopreserveerd. Muizen moet tussen 10 en 60 weken oud. Verwijder de twee caudale epididymides samen met de zaadleider van elke muis. </li><li> Plaats de epididymides in de vooraf bereide CPA-bevattende goed van een 4-goed schotel (stap 1.1). </li><li> Maak 5-7 sneetjes die in elke bijbal en voorzichtigknijp elke zaadleider om sperma te duwen. </li><li> Schud de CPA en de bijbal mengsel met de hand zachtjes bij kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten. Dit zal toelaten om te zwemmen zaadcellen uit. </li><li> Met behulp van de vooraf bereide stro, aspiratie 5 mm (ongeveer 10 ul) van sperma suspensie en vervolgens 1 cm van de lucht. </li><li> Herhaal dit proces met maximaal een totaal van 15 rietjes. Laden en seal rietjes binnen 10 minuten voor de beste zaadcellen overleven. </li><li> Verhit voorzichtig afdichting aan beide zijden van het stro. Leg de rietjes in de bevriezing bus met het sperma kolom eerste. </li><li> Bevestig de 1 ml pipet geleverd als onderdeel van de kit om de bus aan het handvat uit te breiden. Plaats de container in LN 2 in het schuim doos door het gat in het deksel. Laat de bus verticaal zweven in de LN 2 voor 10 minuten. </li><li> Dompel de bus in de LN2. Het sperma is nu gecryopreserveerd en kan worden verplaatst naar de lange termijn LN 2-opslag. </li><li> De bus mag niet worden gebruikt voorde volgende regel totdat het wordt opgewarmd tot kamertemperatuur. </li></ol> 2. Muis superovulatie <ol><li> Algemeen, een gebruik jonge vrouwelijke muizen van dezelfde achtergrond als het sperma donoren. </li><li> Muizen moet worden ~ 12 g (3-4 weken oud). </li><li> Voer een intraperitoneale injectie met 5-10 IE drachtige merrie serum gonadotropin (PMSG). </li><li> Wacht 46 tot 48 uur. </li><li> Voer een intraperitoneale injectie met 5-10 IE humaan choriongonadotrofine (hCG). </li><li> Oogst eicellen 14-16 uur na de hCG-inspuiting zoals hieronder beschreven. </li></ol> 3. Muis sperma herstel en IVF <ol><li> Voor IVF, voor elke stro te worden ontdooid, de voorbereiding van de volgende en voor minstens een uur equilibreren in een 37 ° C CO 2 incubator. <ol><li> Sperma incubatie gerecht: een 35 mm petrischaal, met een 90 ul druppel sperma behandeling medium (STM) bedekt met olie. </li><li> Cutting gerecht: Voor eicel collectie van maximaal 10 superovulated vrouwtjes, een 35 mm petrischaal met 3 ml van IVF medium. </li><li> IVF goed: Voor elke groep van vijf gesuperovuleerde vrouwen voor IVF, een putje van een 4 goed schotel met 500 pi van IVF medium (indien u gebruik maakt van 10 gesuperovuleerde vrouwen, bijvoorbeeld, moet u twee putten...) </li><li> Wassen gerecht: een 35 mm petrischaal met 3 ml van kalium-simplex geoptimaliseerd medium (KSOM) voor het wassen elk putje van de 4-goed gebruikt IVF schotel </li><li> Cultuur gerecht: een 35 mm petrischaal met 50 ul druppels KSOM medium bedekt is met olie voor embryo cultuur uit elk putje van de IVF-schotel. </li></ol></li><li> Verwijder een stro van LN 2 en plaats in een 37 ° C waterbad gedurende 2-3 minuten. </li><li> Verwijder het stro van het waterbad en veeg om het overtollige water te verwijderen. Maak de eerste snede dicht bij de eerste kolom lucht het dichtst bij de katoen stekker. Snijd de stro in de IVF-medium zal er nog steeds een luchtkolom zien voordat het sperma kolom. </li><li> Knip dan de uiteinde van het rietje in de sWEEDE luchtkolom, zorg ervoor om te voorkomen dat het snijden van de zaadcellen kolom. Snij bij een 45 hoek - dit maakt het veel gemakkelijker om het sperma zuigen. </li><li> Zuig het sperma schorsing van het distale uiteinde van het rietje met een 200 ul pipet. </li><li> Plaats het sperma suspensie in het centrum van de STM laten vallen en incubeer de schotel voor 45-60 minuten in een 37 ° C 5% CO 2 incubator. </li><li> Tijdens het sperma incubatie, ontleden de eileiders van de gesuperovuleerde vrouwen in de snij-schotel. Gebruik een 30 g naald of pincet aan elke eileider scheuren, het loslaten van de cumulus-complexen eicel (COC&#39;s). Vermijd vet en bloed in de IVF-medium als vuile media zorgt voor een extra wasstappen. </li><li> Zodra alle eileiders zijn gescheurd, overdracht van de combinatie-OAC&#39;s van vijf vrouwtjes aan elke IVF putten. Het aantal van COC&#39;s geproduceerd door superovulatie is zeer afhankelijk van soort. </li><li> Verzamel 10 tot 15 ul van sperma uit de periferie van de STM te laten vallen en bemesten een IVF ook ongeveer 14-16 uur na de hCG injectie. Herhaal dit voor elke bemesting goed gebruikt. Uiteindelijke spermaconcentratie zal ongeveer 1 miljoen / ml. </li><li> Coculture sperma en eicellen gedurende 4-6 uur in een 37 ° C 5% CO 2 incubator. </li><li> Was de embryo&#39;s met KSOM een minimum van 2 keer en cultuur in KSOM druppels voor ontwikkeling in een 37 ° C 5% CO 2 incubator. </li><li> IVF werd berekend als twee cellig stadium embryo&#39;s uit eicellen van het totaal gebruikte na een nacht cultuur. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Sperma van 5 Charles River muis inteeltstammen was bevroren. Bescherming van ratio&#39;s zijn berekend door het ingevroren sperma beoordeling waarden door vers sperma beoordeling waarden. Bescherming verhoudingen van beweeglijkheid van de zaadcellen was 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% voor C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, en BALB / cAnNCrl, respectievelijk. Bescherming van ratio&#39;s voor een snelle progressieve motiliteit was 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% in C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas<html> CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, en BALB / cAnNCrl, respectievelijk (afb. 1). De IVF-tarieven met ingevroren-ontdooide zaadcellen waren 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% en 26,2% in C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, en BALB / cAnNCrl, respectievelijk (Fig 2) . Over een periode van 1,5 jaar werden 49 GM muis lijnen gearchiveerd door sperma cryopreservatie. Deze lijnen werden later met succes teruggevonden (zoals gedefinieerd door levende jongen geboren) door IVF in 4 vrouwelijke stammen (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 en 129Sv) (afb. 3). <img alt="Figuur 1." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig1.jpg" /> Figuur 1. De bescherming Ratio van de beweeglijkheid van de zaadcellen en de snelle progressieve motiliteit in Muizen <img alt="Figuur 2." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig2.jpg" /> Figuur 2. In Vitro Fertilisatie met Frozen-ontdooid sperma in Muizen 3713fig3.jpg &quot;/&gt; Figuur 3. In vitro fertilisatie met Frozen-ontdooid sperma in GM Muizen

<ol><li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li>
<li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li>
<li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa%3A+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks%2C+mutagenesis+screens%2C+and+mouse+backcrosses%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li>
<li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li>
<li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li>
<li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li>
<li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li>
<li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserving%2C+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li>
</ol>

De auteurs zijn medewerkers van Charles River, de maker van deze kit.

Sinds 1990 is de basis sperma invriezen protocol met behulp van 18% raffinose en 3% afgeroomde melk is betrouwbaar gebleken in vele stammen van muizen en een groot aantal van de muis lijnen zijn gecryopreserveerd 1,2,3,4,5,6,7. De belangrijkste oorzaken van schade aan zaadcellen tijdens het invriezen en ontdooien proces zijn geassocieerd met ijsvorming 8,9 en reactieve zuurstof species 10. Suppletie met vrije radicalen, zoals aminozuren, en reductiemiddelen, zoals monothioglycerol, in het bevriezen medium werd onderzocht en bewezen dat IVF-tarief aanzienlijk te verhogen met ingevroren-ontdooid sperma in inteeltstammen inclusief de C57BL / 6 11,6. In het huidige protocol, ontwikkelden we een nieuwe I • Cryo-kit voor de muis sperma cryopreservatie door het optimaliseren van de basis-CPA met commercieel verkrijgbare anti-oxidanten en ijs blokkers en door het wijzigen van het sperma invriezen en IVF procedure. Bescherming verhoudingen van beweeglijkheid van de zaadcellen(&gt; 60%) en een snelle progressieve motiliteit (&gt; 45%) werden gezien voor het sperma van vijf inteelt muizenstammen bevroren met de I • Cryo kit. De 2-cellig stadium embryo ontwikkeling tarief met ingevroren-ontdooid sperma in vijf muizen inteeltstammen werd aanzienlijk verbeterd in vergelijking met die met basis CPA 11,6. Bij het gebruik van de kit, creëert de gebruiker een geconcentreerde sperma schorsing door bevriezing sperma van 2 mannen voor elke lijn. Door alleen het bevriezen 15 rietjes het proces is snel, eenvoudig en neemt minder opslagruimte voor korte of lange-termijn opslag. De meeste tijden, kan de muis lijnen worden teruggevorderd door ontdooien slechts 1 of 2 rietjes.

<table><tbody><tr><td>CPA</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Bijgeleverd bij kit</td></tr><tr><td>STM</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Bijgeleverd bij kit</td></tr><tr><td>IVF-medium</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Bijgeleverd bij kit</td></tr><tr><td>0,25 ml plastic rietje</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Bijgeleverd bij kit</td></tr><tr><td>Sperma-invriescontainer</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Bijgeleverd bij kit</td></tr><tr><td>Houder en beker</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Bijgeleverd bij kit</td></tr><tr><td>Minerale olie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Moet getest zijn op embryo's</td></tr><tr><td>KSOM-medium</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petrischaal</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Warmte-sealer</td><td>ABTEC</td><td>TISH-200</td><td></td></tr><tr><td>4-wells multidish</td><td>Nalge Nunc international</td><td>73521-424</td><td></td></tr><tr><td>Pipetteerapparaat</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetpuntjes</td><td>Diverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C + 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Diverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LN&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; bewaarsysteem</td><td>Diverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C waterbad</td><td>VWR international</td><td>89032-196</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Intervet Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>EMD Millipore</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>1cc spuit m. 26G 3/8 naald</td><td>BD Biosciences</td><td>BD309625</td><td></td></tr><tr><td>Micro-dissectieschaar</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>30 gauge &amp;frac12; naald</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6802</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135, RS-5110, RS-5005</td><td></td></tr></tbody></table>

muis sperma cryopreservatie en herstel met behulp van de i · cryo kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Duizenden nieuwe genetisch gemodificeerde (GM) stammen van muizen zijn gemaakt sinds de komst van transgenese en knock-out-technologieën. Veel van deze waardevolle dieren bestaan ​​alleen als levende dieren, zonder back-up plan in geval van nood. Cryopreservatie van embryo&#39;s kan deze back-up te bieden, maar is kostbaar, kan een langdurige procedure worden, en over het algemeen vereist een groot aantal dieren voor succes. Sinds de ontdekking dat muis sperma met succes kan worden ingevroren met een basis cryoprotectief agent (CPA), bestaande uit 18% raffinose en 3% afgeroomde melk, is sperma cryopreservatie uitgegroeid tot een aanvaardbare en kosteneffectieve procedure voor het archiveren, verspreiden en herstel van deze waardevolle stammen . Hier laten we zien een nieuw ontwikkelde I • Cryo-kit voor de muis sperma cryopreservatie. Sperma van vijf veel gebruikte stammen van inteelt muizen werden ingevroren met behulp van deze kit en vervolgens hersteld. Een betere bescherming verhoudingen van beweeglijkheid van de zaadcellen (&gt;60%) en een snelle progressieve motiliteit (&gt; 45%) in vergelijking met de controlegroep (basis CPA) werden gezien voor sperma ingevroren met deze kit in 5 inteelt muizenstammen. Twee cellig stadium embryo ontwikkeling na IVF met de herstelde sperma was consistent verbeterd in alle vijf onderzochte muizenstammen. Over een periode van 1,5 jaar werden 49 GM muis lijnen gearchiveerd door sperma cryopreservatie met de I • Cryo-kit en later teruggevorderd door IVF.

Hier laten we zien de nieuw ontwikkelde I • Cryo-kit voor de muis sperma cryopreservatie. Twee-cellig stadium embryo ontwikkeling met ingevroren-ontdooid sperma werd steeds verbeterd in 5 muizenstammen met het gebruik van deze kit. Over een periode van 1,5 jaar werden 49 genetisch gemodificeerde muis lijnen gearchiveerd door sperma cryopreservatie met de I • Cryo-kit en later met succes teruggevorderd door IVF.

Muis Sperma Cryopreservatie en herstel met behulp van de I · Cryo Kit

Sinds de komst van transgenese en knockout-technologieën zijn er duizenden nieuwe genetisch gemodificeerde (GM) muizenstammen gecreëerd. Veel van deze ...

Het algemene doel van deze procedure is het cryopreserveren van muizensperma. Dit wordt bereikt door eerst sperma van muizen-EPI's te verzamelen met behulp van cryopreservatie-rietjes. De rietjes worden vervolgens ingevroren in vloeibare stikstof, waar ze worden bewaard totdat ze worden hersteld door ze ontdooien in warm water.De herwonnen muizenzaadcellen worden uiteindelijk gebruikt voor in vitro fertilisatie. Het belangrijkste voordeel van deze kit ten opzichte van bestaande methoden is dat de kit alle benodigde materialen bevat voor de cryopreservatie en het herwinnen van muizenzaad. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het hanteren en laden van de straws. Begin met het klaarmaken van 15 straws voor cryopreservatie van zaad per lijn muizen die cryopreserveerd moet worden.Verbind eerst elk rietje van 0,25 milliliter met een spuit van één milliliter, waarbij de katoenen prop het dichtst bij de spuit moet zitten. Vul vervolgens acht centimeter IVF-medium in elk rietje, gevolgd door één centimeter lucht. Label tot slot elk van de 15 rietjes met de naam van de lijn die voor elke te cryopreserveren lijn bewaard moet worden.Vul een putje van een plaat met vier putjes met 240 µL cryobeschermingsmiddel. Bevestig een pipet van één milliliter aan het handvat van de vriescontainer om het handvat te verlengen. Vul tot slot de bij de kit geleverde schuimgeïsoleerde doos met 15 cm vloeibare stikstof en sluit het deksel om de euthanasie te voltooien.Twee vruchtbare volwassen mannelijke muizen. Verwijder voor elke lijn die cryogeperserveerd en chirurgisch behandeld moet worden de caudale EPI's. Plaats de muis in rugligging en open de ventrale lichaamswand.Trek voorzichtig aan de vast deferens en verwijder eventueel overtollig vet. Lokaliseer vervolgens de epididymis en verwijder deze intact samen met een klein stukje van de vast deferens. Plaats de EPI's onder een dissectiemicroscoop in een well van de voorbereide four-well dish die is gevuld met CPA.Maak vijf tot zeven longitudinale incisies in elke epididymis. Knijp vervolgens voorzichtig in elk segment met een pincet. Om de zaadcellen naar buiten te duwen, wordt het mengsel van CPA en epididymis drie tot vijf minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd.Schud de schaal tijdens de incubatie voorzichtig twee tot drie keer met de hand. Hierdoor kunnen de zaadcellen door aspiratie naar buiten zwemmen. Vul elk voorbereid rietje met vijf millimeter van de spermasuspensie, gevolgd door één centimeter lucht.Voor het invriesproces is het belangrijk dat alle straws gelijkmatig zijn gevuld. Verhit na het vullen van alle 15 straws voorzichtig beide uiteinden van elke straw om deze te verzegelen. Om de overleving van het sperma te garanderen, moet het proces voor alle 15 straws binnen 10 minuten worden voltooid.Zodra alle straws zijn voorbereid, worden deze in de spermacolom van de vriescontainer geplaatst. Plaats eerst de container in de schuimbox en laat deze verticaal drijven in de vloeibare stikstof. De container moet 10 minuten lang verticaal drijven, anders wordt de vriesnelheid van het sperma beïnvloed.Dompel de canister vervolgens onder in de vloeibare stikstof. Het sperma is hiermee cryopreserveerd en gereed voor langdurige opslag in vloeibare stikstof. Ongeveer 60 uur voor een geplande sperma-terugwinning.Volg het schriftelijke protocol voor de superovulatie van vrouwtjes vóór IVF. Bereid voor elk te ontdooien rietje alle media voor en laat deze ten minste één uur equilibreren bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Deze materialen omvatten een Petrischaal van 35 mm met een druppel van 90 µL spermabehandelingsmedium, bedekt met olie.Gebruik een Petri-schaal van 35 millimeter met drie milliliters IVF-medium als snijschaal en bereid voor elke vijf superovulatie-vrouwtjes een IVF-schaal, bestaande uit één putje van een vier-putjes-plaat gevuld met 500 microliters IVF-medium. Bereid voor elke IVF-schaal een wasschaal, bestaande uit een Petri-schaal van 35 millimeter met drie milliliters KSOM, en een embryo-cultuurschaal, bestaande uit een Petri-schaal van 35 millimeter met druppels van 50 microliter KSOM-medium bedekt met olie. Wanneer alle benodigde materialen zijn klaargemaakt, haal dan snel een straw uit de opslag en plaats deze gedurende twee tot drie minuten in een waterbad van 37 degree Celsius.Droog het rietje af. Maak vervolgens een schuine snede in de luchtkolom onder de wattenprop. Maak aan het andere uiteinde van het rietje nog een schuine snede over een andere luchtkolom.Voorkom dat de spermacolonne wordt onderbroken. Aspireer nu de spermasuspensie aan het uiteinde van het rietje met een 200 µL pipet en breng deze aan in het midden van de druppel met spermabehandelingsmedium. Incubeer de schaal vervolgens gedurende 45 tot 60 minuten.Isoleer tijdens de incubatie van het sperma de ucs van de superovulatie-behandelde vrouwtjes en breng deze over naar de snijschaal. Gebruik een naald van 30 gauge of een pincet om elke eileider open te scheuren, zodat de cumulus-cyt complexen vrijkomen. Breng de C Cs van vijf vrouwtjes over naar elke IVF.Doe dit met een minimale hoeveelheid medium. Voorkom het overbrengen van vet en bloed, aangezien vervuild medium de fertilisatie-efficiëntie remt. Verzamel na de incubatie 10 tot 15 µL van de spermiesuspensie aan de rand van de STM-druppel en breng de suspensie over naar één IVF-druppel.Kweek de cellen nu gedurende vier tot zes uur samen voor de bevruchting. Breng de embryo's na de bevruchting door ten minste 2K SOM-wassingen in de wasschaal. Kweek ze vervolgens verder.De embryo's in KSOM tot het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt. Sperma van vijf ingeteelde muizenstammen van Charles River werd ingevroren. De beschermingsratio's voor sperm motility en rapid progressive motility varieerden van 81% tot 47% over de vijf stammen van dat sperma.De IVF-percentages met ontdooide bevroren sperma varieerden in verschillende stammen van 26 tot 88% over een periode van anderhalf jaar. In totaal werden 49 genetisch gemodificeerde muizenlijnen gearchiveerd door middel van cryopreservatie van sperma en later hersteld via IVF in vier verschillende vrouwelijke stammen: C57BL/6, BC DBA/1 en 129SV. Zodra de techniek voor cryopreservatie van sperma onder de knie is, kan deze in 30 minuten worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast.Voor deze procedure is het belangrijk om de canister verticaal te vullen met vloeibare stikstof.

mouse-sperm-cryopreservation-and-recovery-using-the-icryo-kit

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video-artikel stellen we een stap-voor-stap demonstratie over hoe het verzamelen en hamster eicellen cryopreserve met een hoge post-dooi overleving. Dezelfde procedure kan ook worden toegepast om met succes vorst en dooi muis embryo's in verschillende stadia van pre-implantatie ontwikkeling.

Verzamelen en Cryopreservatie van Hamster Eicellen en muis embryo&#39;s

Dit is een high-throughput sperma cryopreservatie protocol voor zebravis. Sperma gecryopreserveerde gebruik van dit protocol is een gemiddelde van 25% in de daaropvolgende vruchtbaarheid vitro fertilisatie en is stabiel gedurende vele jaren.

Een high-throughput-methode voor zebravis sperma cryopreservatie en In Vitro Bevruchting

Een ethyleen-glycol-gebaseerde methode voor verglazing muis embryo's wordt beschreven. Is het voordelig om andere methoden in zijn eenvoud en lage embryonale toxiciteit, en kan dus worden breed toepasbaar voor vele stammen van muizen, met inbegrip van inteelt en gen-gemodificeerde muizen.

Invriezen van embryo&#39;s door Mouse Ethyleen Glycol-Based Vitrificatie

De vergelijkende soort aanpak maakt het mogelijk gedrag neurowetenschappers te verkennen verschillende neurobiologische factoren die samenhangen met specifiek gedrag gezien als kenmerk van een specifiek dier model. Door gebruik te maken van natuurlijk voorkomende verschillen in gedrag tussen nauw verwante soorten, werkt deze techniek niet nodig invasieve technieken om de expressie van het gedrag te manipuleren.

Met behulp van een vergelijkende Soorten aanpak van de neurobiologie van Paternal antwoorden Onderzoek

In this video, we demonstrate an ultra-rapid cryo vitrification method for preserving biological samples. The method entails the use of a combination of cryoprotectants to protect the biological tissue from freezing damage by preventing intracellular ice crystal formation.

Vitrification-based Cryopreservation: An Ultra-rapid Cooling Technique to Preserve Biological Specimens at Very Low Temperatures for Long-term Storage

MicroSecure Vitrification werd ontwikkeld als een niet-commercieel, aseptisch gesloten vitrificatieapparaatsysteem dat voldoet aan de FDA-normen voor goede fabricage- en weefselverwerkingspraktijken. Vanwege de terugtrekking van hydrofobe embryo-strohalmen met pluggen uit de industrie, werd de vitrificatieprocedure aangepast om een binnenste afdichting op te nemen vóór de standaard interne katoenen plug.

Gewijzigd MicroSecure Vitrificatie: Een veilige, eenvoudige en zeer effectieve cryopreservatie Procedure for Human Blastocysten

Het belangrijkste doel van deze studie was aan te passen de naald ondergedompeld verglazing (NIV) procedure om te cryopreserve hele zebrafish teelballen. Daarnaast is de herhaalbaarheid van de methode in vijf verschillende zebrafish stammen was getest.

Cryopreservatie van zebravis testis van hele Testes Needle ondergedompeld Ultra snelle koeling

Protocollen voor Europese aal rijping en sperma cryopreservatie hebben verbeterd in de afgelopen jaar. Dit artikel beschrijft het beste protocol beschikbaar met behulp van humaan choriongonadotrofine (hCG) voor inducerende rijping en methanol als cryoprotectant.

Voor de verwerking en behandeling van mannelijke Europese aal (Anguilla anguilla) voor hormonale rijping en sperma cryopreservatie

Hier presenteren we een aangepaste methode voor cryopreservatie van eencellige embryo's, evenals een protocol dat het gebruik van gevriesontdooide embryo's en elektroporatie koppelt voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen.

Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

Dit protocol beschrijft een semi-geautomatiseerde route om de efficiëntie en capaciteit van de verwerking en cryopreservatie van sperma van bedreigde koraalsoorten te verbeteren, met als doel de genetische diversiteit veilig te stellen en de inspanningen voor rifherstel te ondersteunen.

Een semi-geautomatiseerde workflow voor de cryopreservatie van koraalsperma ter ondersteuning van biobanking en aquacultuur

Leer cryopreservatie van muizensperma met de I·Cryo kit voor reproductieve biologie. Deze methode archiveert genetisch gemodificeerde muizenlijnen via IVF met verbeterde embryonale ontwikkeling.

Muis Sperma Cryopreservatie en herstel met behulp van de I · Cryo Kit

Meer video's verkennen