Analytische technieken voor het testen van stikstofoxide biologische activiteit

Het algemene doel van het volgende experiment is om te demonstreren hoe nauwkeurig en specifiek metabolieten van stikstofmonoxide in biologische monsters kunnen worden gedetecteerd. Dit wordt bereikt door bloedmonsters onmiddellijk na het verzamelen te verwerken om verlies van metabolieten of vorming van artefacten te voorkomen. Gelijktijdig wordt een snelle en efficiënte weefseloogst uitgevoerd om de effecten van een hypoxische omgeving op metabolieten van stikstofmonoxide te minimaliseren.

Aortische ringen worden verzameld en opgehangen in een orgaanbad om hun endotheelfunctie te beoordelen. Bovendien worden biochemische analyses gebruikt om de nitraatniveaus, nitrietniveaus en de relatieve niveaus van nitro thiols en andere nitro-gebonden producten in het weefsel te kwantificeren. Met behulp van deze analyses kan een juiste vergelijking van experimentele en controledieren waardevolle informatie genereren over de productie en het metabolisme van stikstofmonoxide.

Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze multi-systeem aanpak boven enkele methoden of analyses is dat dit een breder beeld zou kunnen geven van de biochemie van stikstofmonoxide in meerdere orgaansystemen. Zo kunnen we beginnen te begrijpen welke van deze metabolieten een prognostische of diagnostische waarde kunnen hebben, en hoe het repertoire van metabolieten van stikstofmonoxide de vorming en beschikbaarheid van endotheel stikstofmonoxide weerspiegelt. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, aangezien elke stap in het proces cruciaal is voor het behoud van de integriteit van het monster.

Sommige van deze stappen zijn niet duidelijk uit de methodensectie in een typische publicatie vanwege de fijne details van monsterverzameling en weefselextractie. Het demonstreren van deze procedure zal Dr. Hong Jing zijn. Een senior onderzoekswetenschapper in mijn laboratorium Voor dit protocol is er een persoon of experimenteel dier beschikbaar voor bloedafname voor experimentele dieren waarvan de weefsels ook worden onderzocht.

Verzamel eerst volbloed door een naald van 25 gauge in de inferieure vena cava in te brengen. Zodra 500 tot 1000 microliters zijn verzameld, perfuseer het dier vrij van resterend bloed door fysiologisch buffer door de apex van de linkerventrikel te infunderen en laat volledige bloedvervanging toe terwijl bloed en buffer via de inferieure ven cva uitgaan. Veneus bloed moet onmiddellijk na de verzameling in centrifugebuizen van 1,5 milliliter worden verzameld die NEM en EDTA bevatten.

Centrifugeer het bloed gedurende zeven minuten bij 14.300 RCF. Aspireer het plasma van de RBC-pellet met een pipet en breng het over in een aparte buis. Bereid de geïsoleerde plasmamonsters voor op HPLC door eerst een een-op-een volume van koud methanol toe te voegen aan 50 microliter van het plasmamonster.

Vortex de mix gedurende drie tot vijf seconden totdat het troebel is. Centrifugeer vervolgens het mengsel gedurende zeven minuten bij 14.300 RCF. Om de plasma-eiwitten te bezinken, verzamel je het supernatant in een aparte buis van 1,5 milliliter en bewaar het bij vier graden Celsius tot het kan worden geanalyseerd.

Om het plasma voor chemiluminescentie-analyse voor te bereiden, neem je het resterende plasmavolume, dat ongeveer 200 tot 400 microliter moet zijn en verdeel het in twee volumes. Bereid de helft van het plasma voor door een 10% volume van 5% aangezuurd sulfide toe te voegen en 10 minuten te wachten. Dit monster is nu klaar voor CLD-analyse.

Bereid een andere helft van het plasma voor door na vijf minuten een 10% volume van 2% kwikchloride toe te voegen. Voeg bij kamertemperatuur een 10% volume van aangezuurd sulfonamide toe. Wacht nog eens 10 minuten en injecteer dit monster in de CLD zoals het plasma.

De RBC-pellet kan worden voorbereid voor HPLC en CLD voor beide analyses. Begin door één deel celpellet te mengen met vier delen hypotone lysisoplossing. Vortex het mengsel grondig voor CLD-analyse.

De voorbereiding voor de cellen is hetzelfde als voor plasma. Begin door een gelijk volume methanol toe te voegen. Vortex het mengsel vervolgens krachtig gedurende drie tot vijf seconden, gevolgd door centrifugeren gedurende zeven minuten bij 14.300 RCF.

Pipet nu het supernatant af en bewaar het bij vier graden Celsius tot het kan worden geanalyseerd door HPLC om de weefselniveaus van stikstofmonoxide metabolieten te bepalen. Bij weefsels van interesse van experimentele dieren, moet het bloed eerst worden geoogst en voorbereid zoals beschreven in de vorige sectie, het oogsten van de weefsels moet zoals gebruikelijk worden uitgevoerd met speciale aandacht voor snelheid en efficiëntie zodat de weefsels niet hypoxisch worden. Zodra het is verzameld, homogeniseer de weefselmonsters in een verhouding van een tot vijf van N-E-M-E-D-T-A bevattende PBS.

Bereid vervolgens de gehomogeniseerde weefsels voor op HPLC en CLD-analyse zoals beschreven in de vorige secties voor RBC's. Nadat een volwassen muis is verdoofd met dathyleether en is bevestigd dat deze niet reageert op een teenprik, voer een thoracotomie uit. Een middenlijnsnede wordt gemaakt van het borstbeen tot in de regio van het schaambeen om de thoracale en abdominale holtes bloot te leggen.

Perfuseer vervolgens het dier met geoxygeneerde Krebs Alite-buffer. Gebruik een spuit met een naald van 25 gauge om de buffer in de apex van de linkerventrikel te injecteren. De rechter atrium wordt opengesneden om een uitlaat voor het bloed te bieden.

Na de perfusie, isoleer de abdominale aorta door de lever, longen en andere weefsels die de aorta kunnen bedekken weg te snijden en te verwijderen. Houd het hart vast met een pincet en snijd de aorta op een zachte manier van de achterste wand van het dier af. Plaats het hart en de aorta in een petrischaal gevuld met ijs.

Koude Krebs-buffer in de schaal. Snijd voorzichtig het vet en de adventitia van de aorta weg en reinig ze. Vermijd het beschadigen van het endotheel in het vat tijdens het schoonmaken.

Houd de stofwisseling van de aorta's langzaam om hypoxie te voorkomen door het om de vijf minuten over te brengen naar vers ijskoud geoxygeneerd buffer. Gebruik nu een scalpel om de aorta in segmenten