Name: Kwantificering van schimmelkolonisatie, Sporogenesis, en de productie van mycotoxinen Met behulp van Kernel Bioassays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Leer hoe u schimmelkolonisatie, sporogenese en mycotoxineproductie kwantificeert met kernel bioassays. Deze gestandaardiseerde methode onderzoekt zaad-fungus interacties voor gewasbescherming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Brandon Hassett en Carlos Ortiz bedanken voor hun technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de NSF subsidies IOB-0544428, IOS-0951272, en IOS-0925561 Dr Michael Kolomiets, en door de USDA Nationaal Instituut voor Voedsel-en Landbouworganisatie (NIFA), AFRI Plantenveredeling en onderwijs Grant # 2010 tot 85.117 -20.539 naar Drs. Seth Murray, Thomas Isakeit, en Michael Kolomiets.

1. Maïs Kernel Bioassay <ol><li> Twee weken vóór, kweken de schimmels op Potato Dextrose Agar (PDA) bij 28 ° C. </li><li> Selecteer kernels met een vergelijkbare grootte en vorm, bij voorkeur plat leggen zodat ze gelijk met de onderkant van bioassay flacons, en plaats in 50 ml Falcon buizen. Geselecteerd Kernels moet tegelijkertijd zijn geproduceerd in dezelfde omgeving vergelijkbare zaad leeftijd en metaboliet samenstelling te verzekeren. </li><li> Oppervlakte sterilisatie korrels door schudden buizen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met 70% ethanol, 1 minuut met steriel water en 10 minuten met 6% natriumhypochloriet. Spoel, drie keer, gedurende 5 minuten per keer, met steriel water en tegelijkertijd schudden. Pat kernels droog op geautoclaveerd handdoeken. </li><li> Om infectie van Aspergillus flavus vergemakkelijken, een kleine wond op het embryo-zijde met een 18 G naald om de diepte van 0,5 cm. Echter, in onze ervaring een grotere wond is nodig voor Fusarium verticillioides infectie. Therefore gebruik een scheermes om in de embryo-snijdt op een diepte van 0,5 mm. </li><li> Bereid inoculum suspensie door schrapen gekweekte platen in ongeveer 5 ml autoclaaf 0,01% Tween-20 oplossing sporen bevrijden en verwijderen mycelium door filtratie door zwaartekracht tenminste 4 lagen autoclaaf kaasdoek. Bereken spore concentratie met hemocytometer en aan te passen tot 10 6 sporen / ml voor A. flavus of F. verticillioides. Bij gebruik van andere soorten pathogeen of gastheer, is het belangrijk om concentraties van inoculum evalueren passende infectie. </li><li> Maak een vochtige kamer in een plastic container (29,2 cm x 18,7 cm x 8,3 cm) bekleed met vijf vellen papier handdoeken en 100 ml steriel water. Kamer is niet water-of luchtdichte en extra water moet worden toegevoegd het hele experiment te houden papieren handdoeken vochtig. </li><li> Plaats vier pitten in een autoclaaf 20 ml glazen scintillatieflesje en registreren hun massa. Inoculeren met 200 ul sporensuspensie,cap, en vortex gelijkmatig laag kernels met vering. Draai caps vrij zodat de lucht-uitwisseling en plaats ze in vochtige kamer. </li></ol> Opmerking: zaden of schimmels andere dan de in deze methoden de hoeveelheid entmateriaal vereiste verschillend kunnen zijn en moet experimenteel bepaald worden. <ol start="8"><li> Incubeer pitten onder een 12-h-light/12-h-dark fotoperiode bij 28 ° C gedurende 7 dagen of totdat de gewenste. </li></ol> 2. Conidia Enumeratie <ol><li> Na de infectie periode, voeg 5 ml van geautoclaveerd 0,01% Tween-20 tot scintillatieflesjes met besmette kernels en vortex goed voor 1 minuut. </li><li> Een breed boring pipet onmiddellijk verdunnen overdracht twee 200 ul fracties van sporensuspensie in 2,0 ml Eppendorf buizen die 1,8 ml 0,01% Tween-20 (of verdun nodig afhankelijk infectie). </li><li> Telling tweemaal per 200 ul aliquot een hemocytometer 4Vergelijk niveaus van conidia tussen de behandelingen. </li></ol> 3. Aflatoxine Kwantificering <ol><li> Voeg korrels uit een monster 50 ml blender cup met 20 ml 80% methanol en 0,05 g NaCl, deksel mengsel op hoge snelheid 1 min. </li><li> Plaats een vouwfilter over een schone collectie vat en giet-extract in de filter. </li><li> Breng 10 ml van filtraat over in een schone kuip, voeg 20 ml gedestilleerd H 2 O, en meng goed. </li><li> Filter monster door een 1,5 um glas microvezel filter in een schone beker. </li><li> Breng 1 ml van de gefiltreerde extract tot afla Test kolom en, met behulp van perslucht, dwingen het gefiltreerde extract door de kolom met een snelheid van 1-2 druppels / seconde tot geleegd. </li><li> Was twee keer per kolom met 1 ml gedestilleerd H 2 O en passeren kolom bij 1-2 druppel / seconde tot lucht komt door. </li><li> Elueer kolom met 1 ml van 100% HPLC-kwaliteit methanol bij een 1-2 druppel / seconde snelheid verzameld in een glazen cuvet. </li><li> Toevoegen1 ml afla Test Developer eluaat en meng goed. Plaats cuvet in gekalibreerd fluorometer en lees op 60 sec. </li></ol> Let op: Bij gebruik van de Aflatest FGIS protocol, de meting van de fluorometer wordt berekend op basis van een eerste 50 gram van het monster geëxtraheerd in 100 ml. Als je kijkt naar de verdunning van het monster met water, de 1 ml toegepast op een kolom is 0,166 gram van het monster. Dus, bij het wijzigen van het protocol, moet u rekening houden met de verschillen in de steekproefgrootte en de eerste extractie-oplossing. Bijvoorbeeld, 2 gram korrels geëxtraheerd in 20 ml 80% methanol. Dit is 0,1 g / ml. Wanneer 1 ml van dit monster wordt gemengd met 2 ml water, het percentage van het monster in de vloeistof is nu 0,033 g / ml. Indien dit monster wordt een fluorometer lezing van 100 ppb, wordt de werkelijke concentratie van het gedeelte van het monster in 0.166, dat is ppb = (0,166 gram X 100 ppb) / 0,1 gram), of 166 ppb. Voor alternatieve aflatoxine kwantificeerbaarcatie methodes, zie referentie 7. 4. Fumonisine B1 (FB1) Analyse <ol><li> Wanneer schimmel groeit op maïskorrels, extraheren monsters overnacht bij 10 ml acetonitril / water (50/50, v / v) bij kamertemperatuur zonder schudden. Vervolgens mengen extract (2 ml) met gedeïoniseerd water (6 ml) en dit mengsel toe te passen (8 ml) rechtstreeks op het C-18 vaste fase extractie. </li><li> Voordat monster voorwaarde het C-18 vaste fase extractie kolom te spoelen met 2 ml acetonitril gevolgd door 2 ml water. </li><li> Na het laden van het monster wordt de kolom gewassen met 2 ml water, gevolgd door 2 ml acetonitril / water (15/85, v / v). Voorbeeld voor HPLC-analyse (met FB1) geëlueerd met 2 ml acetonitril / water (70/30, v / v). </li><li> Derivatiseren FB1 met o-phthaldehyde (OPA) ofwel 0,1 ml kolomeluaat een flacon 0,1 ml boraatbuffer (0,05 M boorzuur acid/0.05 M natriumboraat [50/50, v / v], pH 8,5) en 0,1 ml OPA (0,1 mg / ml in acetonitrile met 0,5% - mercaptoethanol). </li><li> Stop de reactie na 10 minuten door toevoegen van 0,5 ml acetonitrile/0.01 M boorzuur (40/60, v / v). </li><li> Analyseer FB1 op een Shimadzu HPLC LC-20AT systeem uitgerust met een analytische Zorbax ODS kolom (4.6 150 mm) en een variabele golflengte Shimatzu RF-10Axl fluorescentie (excitatie 335 nm / emissie 440 nm). </li><li> Een lineaire gradiënt gebruikt (solvent A: acetonitrile/0.1 M natriumfosfaat (40/60), pH 3,3; oplosmiddel B: acetonitril / 0,1 M natriumfosfaat (60/40), pH 3.3) en het verloop programma is als volgt: 100% A tot 100% B in 10 min 100% B gedurende 5 minuten. </li><li> Analyseer FB1 normen door middel van HPLC en de maximale oppervlakte metingen worden gebruikt om standaard curve te genereren. Vervolgens kwantificeren FB1 niveau in een monster door vergelijking piekoppervlakken met FB1 standaardcurve. </li></ol> 5. Ergosterol Analyse <ol><li> De cultuur van de schimmel op maïskorrels gedurende 7-14 dagen. </li><li> Na de incubatieperiode, voeg 10 ml chloroform: methanol (2:1, v / v) in elke flacon. Eenmaal toegevoegd, goed schudden monsters en flacons in het donker incuberen bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. </li><li> Na 24 uur, centrifugeren van de monsters en het verzamelen van de bovenstaande vloeistof en filtreer deze over 0,45 um nylon membraan. </li><li> Breng het monster direct in een Shimadzu HPLC LC-20AT-systeem uitgerust met een 4,6 U ODS-C18 kolom (200 A, 250 ± 4,6 mm) en een Shimadzu SPD-20A UV / VIS-detector ingesteld om toezicht te houden op 282 nm. </li><li> Gebruik methanol (100%) bij een stroomsnelheid van 1,5 ml / min als mobiele fase. Bepaal kwantificering van ergosterol in monsters door vergelijking piekoppervlakken van monsters met een standaard curve gegenereerd van HPLC-kwaliteit ergosterol. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Na inoculatie en incubatie in een vochtige kamer voor twee tot drie dagen, moet de groei van schimmels beginnen te verschijnen op de kernels. Zeven dagen na de behandeling, de vegetatieve groei op behandelde planten moet duidelijk zichtbaar zijn, while mock controles moeten niet-geïnfecteerde (Figuur 1B, bovenaan). Perioden van langere incubatietijd bevorderlijk zijn voor meer overvloedige vegetatieve groei (Figuur 1B, onder). Onder de omstandigheden beschreven (figuur 2G), A. flavus wild-type NRRL 3357 weergegeven maximale waarde van de kolonisatie aflatoxine accumulatie en conidia productie 8, 6 en 8 dagen respectievelijk (figuur 2 AC). Wanneer echter mycotoxinen en conidiation vergeleken per eenheid ergosterol, werden de grootste waarden gemeten bij 4 en 6 dagen respectievelijk (figuur 2, DE). Figuur 2F vat deze schimmelbiomassa-afhankelijke maximale waarde waarnemingen. Interessant is dat tussen de 4-6 dagen na de inenting, de pitten ondergaan nucleïnezuur degradatie, door de ogen van totaal RNA van monsters op het tijdsverloop (figuur 2H, onder). Verschillende studies, ook de onze, hebben examined F. verticilliodies infectie op maïskorrels 2,8,9,10,11,12 en met succes gebruikt 7-13 dagen de tijd-punten voor waarnemingen. Met behulp van de hierin beschreven werkwijzen, fumonisine niveaus variëren van 3,500-8,000 ng / g kernel 4,13 en ergosterol niveaus variëren van 5.000-10.000 ng / g kernel 14,13. Figuur 3 laat zien vertegenwoordiger pieken voor fumonisine (boven) en ergosterol (onder ) van HPLC chromatogrammen. Meting van ergosterol kan ook worden uitgevoerd via absorbantiespectra 15. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig1.jpg" /> Figuur 1. Stroomdiagram voor de kwantificering van schimmel biomassa, sporogenesis en mycotoxineproductie en representatieve resultaten voor de vegetatieve groei van de kernel bioassays. A) Stroomschema waarin de beschreven methode voor kwantificering van fundamentele biologische parameters die worden gebruikt om schimmelinfecties te pathogenese beoordelen maïskorrels. B) Representatieveresultaten voor kernel bioassays. Top, A. flavus (NRRL3357) vegetatieve groei op de maïskorrels in de B73 genetische achtergrond. Zaden werden geïnoculeerd met 200 ul van 10 6 sporen / ml en foto werden 7 dagen na enting. Bottom, F. verticillioides ingeënt pitten in B73 achtergrond 13 dagen na infectie. Korrels werden geïnoculeerd met 200 ul van 10 6 sporen / ml. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig2.jpg" /> Figuur 2. Aspergillus flavus kernel bioassay tijdsverloop. B73 korrels werden geïnoculeerd met 200 ul van 10 6 sporen / ml Aspergillus flavus conidiale suspensie en gedurende 2-8 dagen (G). Alle waarden werden bepaald uit het droge gewicht gemiddeld 4 korrels (n = 3-4; gemiddelde ± SE). A) kolonisatie (gebaseerd op ergosterol), (B) aflatoxine, en (C) conidiation gekwantificeerd met behulp van methoden beschreven. E) aflatoxine en (F) conidiation weergegevenals functie van schimmelbiomassa gemeten in h ergosterol. F) Maximale waarden voor ergosterol, aflatoxine accumulatie, en conidiation als functie van schimmel biomassa - maximale waarden voor elke hoeveelheid waargenomen werd ingesteld op 100%. (H) 1 pg per laan van totaal RNA van tijdsverloop. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig3.jpg" /> Figuur 3. Vertegenwoordiger High Performance Liquid Chromatography (HPLC) chromatogrammen voor fumonisine B1 (boven) en ergosterol (onder) geïsoleerd van kernels die besmet zijn met Fusarium verticillioides (M3125).

<ol><li>Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxylipins+as+developmental+and+host-fungal+communication+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals.</a> Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).</li>
<li>Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+a+maize+9-lipoxygenase+results+in+increased+resistance+to+fungal+pathogens+and+reduced+levels+of+contamination+with+mycotoxin+fumonisin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).</li>
<li>Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+oxylipin-mediated+cross-talk+in+the+Aspergillus+-+seed+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem.</a> Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).</li>
<li>Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+lipoxygenase+ZmLOX3+increases+susceptibility+of+maize+to+Aspergillus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).</li>
<li>Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+lipids+and+oxylipins+are+crucial+signals+in+modulating+mycotoxin+production+by+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Toxin+Rev%22%5BJournal%5D)">Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi.</a> Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).</li>
<li>Mukherjee, M., Kim, J. -E., Park, Y. -S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+G+protein+signaling+in+F.+verticillioides+mediate+differential+host-pathogen+responses+on+non-viable+versus+viable+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels.</a> Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).</li>
<li>Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+rapid+methods+for+the+analysis+of+mycotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins.</a> Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).</li>
<li>Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+Fusarium+moniliforme+within+asymptomatic+maize+kernels+and+kernels+associated+with+equine+leukoencephalomalacia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia.</a> Plant Dis. 76, 144-148 (1992).</li>
<li>Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fumonisin+concentrations+in+kernels+of+transgenic+Bt+maize+hybrids+and+nontransgenic+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids.</a> Plant Dis. 83, 130-138 (1999).</li>
<li>Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusarium+verticillioides+GAP%21%2C+a+gene+encoding+a+putative+glycolipid-anchored+surface+protein%2C+participates+in+conidiation+and+cell+wall+structure+but+not+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence.</a> Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).</li>
<li>Shim, W. -B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Fumonisin+B1+biosynthesis+in+maize+germ+and+degermed+kernels+by+Fusarium+verticillioides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Protect%22%5BJournal%5D)">Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides.</a> J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).</li>
<li>Shim, W. -B., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fumonisin+B1+biosynthesis+and+conidiation+in+Fusarium+verticillioides+by+a+cyclin-like+%28C-type%29+gene%2C+FCC1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Micrbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1.</a> Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).</li>
<li>Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).</li>
<li>Shin, J. -H., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PPR1+and+PPR2%2C+genes+encoding+regulatory+subunits+of+protein+phosphatase+2A+in+Fusarium+verticillioides%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides.</a> Phytopathol. 99, S119(2009).</li>
<li>Breivik, O. N., Owades, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+Semimicrodetermination+of+Ergosterol+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast.+Agric.+and+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast.</a> Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Ik heb niets te onthullen.</p

<p class="jove_content"&gt; De hier beschreven methoden zijn uitvoerig getest en bewezen robuust te zijn bij het genereren van meetbare resultaten voor schimmelkolonisatie, sporogenesis, en de productie van mycotoxinen. Bovendien moeten deze technieken voor zaden van andere planten die gevoelig zijn voor besmetting met schimmels mycotoxigenic (bijvoorbeeld pinda&#39;s, tarwe, katoen, pistachenoten, enz.). Voor de bevoegde plant-pathogeen interactie analyses, is het noodzakelijk dat de zaden worden in leven gehouden. Een kleine wond op het embry...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalog # </td></tr><tr><td> Potato Dextrose Agar </td><td> Fisher Scientifc </td><td> S71659A </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientifc </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Plastic incubatie container </td><td> Sterilite </td><td> 1713LAB06 </td></tr><tr><td> Blender </td><td> Vicam </td><td> 20200 </td></tr><tr><td> 24 cm vouwfilter Papers </td><td> Vicam </td><td> 31240 </td></tr><tr><td> 1,5 urn glas microvezel </td><td> Vicam </td><td> 31955 </td></tr><tr><td> Afla testzuil </td><td> Vicam </td><td> G1024 </td></tr><tr><td> Afrla Test Ontwikkelaar </td><td> Vicam </td><td> 32010 </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Vicam </td><td> 35016 </td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> Fisher Scientifc </td><td> AC14952-0025 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Fisher Wetenschappentifc </td><td> AC39769-0025 </td></tr><tr><td> C-18 vaste fase extractie kolom (Prep september SPE C18 kolom) </td><td> Fisher Scientifc </td><td> 60108-304 </td></tr><tr><td> O-ftalaldehyde (OPA) </td><td> Sigma Chemical Co </td><td> 79760-5g </td></tr><tr><td> Boorzuur </td><td> Fisher Scientifc </td><td> BP168-500 </td></tr><tr><td> Natriumboraat </td><td> Fisher Scientifc </td><td> RDCS0330500 </td></tr><tr><td> Mercaptoethanol </td><td> Fisher Scientifc </td><td> 45-000-231 </td></tr><tr><td> Shimadzu HPLC LC-20AT (pomp) </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc </td><td> LC-20AT </td></tr><tr><td> Zorbax ODS kolom (4.6x150mm) </td><td> Agilent Technologies </td><td> 443905-902 </td></tr><tr><td> Shimatzu RF-10Axl fluorescentiedetector </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc </td><td> RF-10AXL </td></tr><tr><td> Natriumfosfaat </td><td> Fisher Scientifc </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> FB1 normen </td><td> Sigma Chemical Co </td><td> F1147-1 mg </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> VWR </td><td> MK444410 </td></tr><tr><td> 13 mm spuitfilter met 0,45 um nylon membraan (HPLC) </td><td> Pall Life Science </td><td> 4426 </td></tr><tr><td> Ergosterol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 45480-50G-F </td></tr><tr><td> Scintillatieflesjes </td><td> VWR </td><td> 66021-602 </td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Vicam </td><td> G1124 </td></tr></tbody></table>

kwantificering van schimmelkolonisatie, sporogenesis, en de productie van mycotoxinen met behulp van kernel bioassays

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Het rotten van granen door zaad-infecteren schimmels vormt een van de grootste economische uitdagingen voor graanproductie de hele wereld, niet aan ernstige risico&#39;s te vermelden mens en dier. Onder de productie van graan, maïs is waarschijnlijk de meest getroffen gewas, als gevolg van pathogenen geïnduceerde verliezen in graan integriteit en de mycotoxine zaad besmetting. De twee meest voorkomende en problematisch mycotoxinen voor maïs telers en levensmiddelen en diervoeders processors zijn aflatoxine en fumonisine, geproduceerd door Aspergillus flavus en Fusarium verticillioides, respectievelijk. Recente studies in de moleculaire plant-pathogeen interacties hebben aangetoond belofte in het begrijpen van specifieke mechanismen in verband gebracht met plantaardige reacties op schimmelinfecties en verontreiniging met mycotoxinen 1,2,3,4,5,6. Omdat veel labs gebruikt kernel assays van planten-pathogeen interacties te bestuderen, is er behoefte aan een gestandaardiseerde methode voor het kwantificeren verschillende biologische parameters, zodatde resultaten van verschillende laboratoria kan worden cross-geïnterpreteerd. Voor een robuuste en reproduceerbare middelen voor kwantitatieve analyses op zaden, hebben we in-lab kernel testen en de daarop volgende methoden om schimmelgroei, biomassa en verontreiniging met mycotoxinen te kwantificeren. Vier gesteriliseerd maïskorrels worden geïnoculeerd in glazen flacons met een schimmel suspensie (10 6) en gedurende een vooraf bepaalde periode. Monsterflesjes worden vervolgens geselecteerd voor de telling van conidia van hemocytometer, ergosterol biomassa op analyse van hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC), aflatoxine kwantificering met een AflaTest fluorometer methode en fumonisine kwantificering van HPLC.

De verwoesting van de graangewassen door zaad-infecterende schimmels heeft ertoe geleid dat tal van onderzoeksinspanningen om beter te begrijpen plant-pathogeen interacties. Om zaad-schimmel interacties in een laboratorium te bestuderen, ontwikkelden we een robuuste methode voor de kwantificering van de schimmel reproductie, biomassa en verontreiniging met mycotoxinen met behulp van kernel bioassays.

Kwantificering van schimmelkolonisatie, Sporogenesis, en de productie van mycotoxinen Met behulp van Kernel Bioassays

Het rotten van granen door zaadinfecterende schimmels vormt een van de grootste economische uitdagingen voor de wereldwijde graanproductie, om nog maar niet te spreken van de ernstige risico's ...

Het algemene doel van deze procedure is om de biosynthese van mycotoxinen, bederf en groei nauwkeurig te kwantificeren om moleculaire interacties tussen zaden en schimmels te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst een bioassay met granen op te zetten. Vervolgens worden de kedia geteld, waarna de mycotoxinen worden gekwantificeerd.Ten slotte wordt de schimmelbiomassa gemeten. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de effecten van de zaadphysiologie op de reproductieve ontwikkeling en het secundaire metabolisme van mycotoxigene schimmels aantonen, door de kwantificering van de biomassa en secundaire metabolieten met behulp van sporentellings-technieken gekoppeld aan high performance liquid chromatography. Het belangrijkste voordeel van het propageren van deze techniek is het standaardiseren van methoden over meerdere laboratoria, zodat resultaten van verschillende laboratoria onderling geïnterpreteerd kunnen worden.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van moleculaire interacties tussen zaden en microben, zoals de wijze waarop pathogene schimmels het lipidemetabolisme van planten kapen als virulentiestrategie. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ervaren, omdat verschillende stammen van angi verschillende groeipatronen en ontwikkelingspatronen vertonen. Daarom is het essentieel dat u de condities voor uw specifieke schimmel-zaadinteractie optimaliseert, twee weken voordat u de maze uitvoert.Kernen bioassay-cultuur. De schimmelpathogenen op aardappel-dextrose-agar of PDA bij 28 °C. Wanneer u klaar bent om te beginnen, selecteert u kernen met een vergelijkbare leeftijd, vorm en grootte, en plaatst u deze in buisjes van 50 ml. Oppervlak.Steriliseer de zaden door 70% ethanol toe te voegen en de buisjes vijf minuten bij kamertemperatuur te schudden. Schud vervolgens één minuut met steriel water en 10 minuten met 6% natriumhypochloriet. Spoel drie keer met steriel water onder tussenbeurtse schudding gedurende vijf minuten per keer.Dep vervolgens de korrels droog met autoclavehanddoeken om ze te infecteren met aspergillus flavus. Gebruik een naald van 18 gauge om een kleine wond van 0,5 centimeter diep aan te brengen aan de embryozijde van elke korrel. Voor een fusarium vertices-infectie gebruikt u een scheermesje om een snede van 0,5 millimeter diep te maken.Bereid de inoculum suspensie voor door vijf milliliter geautoclaveerde 0,1% tween 20-oplossing toe te voegen aan de gekweekte platen, en gebruik een celspreider om de sporen los te schrapen. Verwijder het mycelium door de oplossing via zwaartekracht te filteren door ten minste vier lagen geautoclaveerde kaasdoek. Gebruik een hemocytometer om de sporeconcentratie te berekenen en stel deze af naar zes sporen per milliliter.Voor beide schimmelsoorten. Creëer een vochtigheidskamer in een plastic container door deze te bekleden met vijf vellen keukenpapier en 100 milliliters steriel water toe te voegen. Plaats vervolgens vier korrels in elke autoclaaf.Plaats de glazen installatieflesjes van 20 milliliter. Weeg deze en noteer de massa. Voeg 200 microliters sporensuspensie toe aan elke dop van het flesje en vortex deze om de korrels gelijkmatig met de suspensie te bedekken.Draai vervolgens de doppen los om een vrije luchtuitwisseling mogelijk te maken en plaats de vials in de bevochtigingskamer. Incubeer de kernels gedurende zeven dagen, of tot het gewenste resultaat is bereikt, onder een fotoperiode van 12 uur licht en 12 uur donker bij 28 °C. Voeg na de infectieperiode vijf milliliter geautoclaveerd 0,01% Tween 20 toe aan de simulatievials met geïnfecteerde kernels en vortex grondig gedurende één minuut. Verdun de sporenсусpensie onmiddellijk met een brede VRE-pipetpunt door twee afzonderlijke aliquots van 200 µL over te brengen naar twee milliliter eppendorf tubes die 1,8 milliliter 0,01% Tween 20 bevatten.Gebruik een hemocytometer om elk aliquot twee keer te tellen. Om aflatoxine te kwantificeren, voegt u de kernen van één enkel monster toe aan een blenderbeker van 50 milliliter met 20 milliliter 80%methanol en 0,05 gram natriumchloride. Sluit de beker en blend op hoge snelheid gedurende één minuut.Plaats een bevochtigd filterpapier over een schoon opvangvat en giet het extract door het filter. Overbreng 10 milliliters filtraat naar een schoon vat. Voeg 20 milliliters gedestilleerd water toe en meng goed.Filter het monster door een glasvezelfilter van 1,5 micron in een schoon bekertje. Breng één milliliter van het gefiltreerde extract aan op een ALE-testkolom en pers het gefiltreerde extract met perslucht door de kolom met een snelheid van één tot twee druppels per seconde. Was de kolom twee keer met één milliliter gedestilleerd water door dit met een snelheid van één tot twee druppels per seconde door de kolom te leiden totdat er lucht doorheen komt.Elueer de kolom met één milliliter 100% HPLC-grade methanol bij een snelheid van één tot twee druppels per seconde, opgevangen in een Glass Q Vet. Voeg één milliliter ale test developer toe aan de EIT en meng goed. Plaats de Q VET in een gekalibreerde fluorimeter en lees na 60 seconden af. Voor acin B one of FB one analyse voegt u 10 milliliter van een 50 50 oplossing van acetonide trial in water toe aan elk kernel bioassay monster en extraheert u dit gedurende de nacht bij kamertemperatuur zonder agitatie.Meng het extract met zes milliliter gedeïoniseerd water en breng dit aan op een C 18 vaste-fasekolom die is voorbehandeld met twee milliliter acetonitril, gevolgd door twee milliliter water. Was na het laden van de monsterkolom de kolom met twee milliliter water, gevolgd door twee milliliters acetonitril in water. Elueer de FB 1 die het monster bevat voor HPLC-analyse met twee milliliter acetonitril in water.Derivatiseer de FB 1 door één milliliter van de kolom-EIT over te brengen naar een vial met 0,1 milliliter boraatbuffer en 0,1 milliliter aldehyde en incubeer dit gedurende 10 minuten. Stop de reactie door 0,5 milliliter van een oplossing van acetonitril en 0,01 molair boorzuur toe te voegen. Analyseer FB 1 via HPLC met behulp van een lineaire gradiënt van acetonitril en 0,1 molair natriumfosfaat.Vergelijk de monsters met een standaardcurve van één FB om de sterolcultuur te analyseren, de schimmel op maïs gedurende zeven tot 14 dagen. Voeg na de incubatieperiode 10 milliliters chloroformmethanol toe aan elk vial. Schud de monsters goed en incubeer de vials vervolgens 24 uur in het donker bij kamertemperatuur.Centrifugeer de monsters bij 5.000 RPM gedurende drie minuten. Filtreer vervolgens het supernatant door een nylon membraan van 0,45 micron. Injecteer het monster direct in een HPLC-kolom en elueer met 100% methanol bij een stroomsnelheid van 1,5 milliliter per minuut.Kwantificeer de monsters door de piekgebieden te vergelijken met een standaardcurve die is gegenereerd met HPLC-grade of goole. Na inoculatie en incubatie in een bevochtigingskamer gedurende twee tot drie dagen, zou schimmelgroei zichtbaar moeten worden op de korrels, zoals hier getoond.Vegetatieve groei na behandeling op geïnoculeerde korrels moet duidelijk zichtbaar zijn, terwijl de mock-controles niet geïnfecteerd mogen zijn; langere incubatieperioden bevorderen een weelderigere vegetatieve groei. Deze figuur laat zien dat een flavus wild type NR RL 3 3 5 7 maximale waarden vertoonde voor kolonisatie, aflatoxine-accumulatie en kedia-productie op respectievelijk vier, zes en acht dagen. Wanneer mycotoxine-contaminatie en tion echter per eenheid rol werden vergeleken, werden de hoogste niveaus respectievelijk op vier en zes dagen waargenomen.Hier worden de representatieve resultaten voor fumonisine en rol getoond uit HPLC-chromatogrammen, gebruikmakend van de methoden die in deze video worden gedemonstreerd. De fumonisinegehaltes variëren van 3 500 tot 8 000 nanogram per gram kern en de rol-gehaltes variëren van 5 000 tot 10 000 nanogram per gram kern. Zodra de bio-assays op de kernen zijn voltooid, kunnen mycotoxinen en fungal biomassa allebei binnen twee tot vier dagen worden gemeten, afhankelijk van het aantal experimentele monsters.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de methoden in een zo steriel mogelijke omgeving uit te voeren. Andere methoden zoals fytohormonenanalyse, lipidomics, proteomics, transcriptomics of andere interactomics kunnen worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke genen, eiwitten en hormoonpaden betrokken zijn bij deze belangrijke interacties tussen verschillende koninkrijken.

quantification-fungal-colonization-sporogenesis-production-mycotoxins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De studie van de ontwikkelingsprocessen van de ascosporen in Gibberella zeae, een procedure voor de collectie onder steriele omstandigheden wordt gefilmd om het hoogste niveau van informatie voor protocol beschrijving te genereren. Dit moet de reproduceerbaarheid van het experiment, een cruciaal aspect bij het volledige genoom expressie profiel testen worden uitgevoerd.

Gibberella zeae Ascospore Productie en collectie voor microarray experimenten.

Eiwitextractie voor proteomische analyses in schimmelsoorten vereist een hoge mate van standaardisatie te worden bereikt op basis van de minimale informatie over een proteomics experiment (MIAPE) richtlijnen. We presenteren een video-protocol, dat een procedure voor het minimaliseren van experimentele vooringenomenheid tijdens toxine inductie en eiwit-extractie uit...

Toxine Inductie en eiwitextractie uit Fusarium Spp. Cultures for Proteoom Studies

Seksuele kruisen en isolatie van recombinante nakomelingen zijn belangrijke onderzoeksinstrumenten voor de filamenteuze...

Seksuele ontwikkeling en Ascospore Lozing in Fusarium graminearum</em

Hier beschrijven we een protocol om te bepalen van pulmonaire schimmel last in muizen met invasieve aspergillose door kwantificering van Gomori van gemodificeerde methanamine zilver kleuring in histologische secties. Gebruik van deze methode resulteerde in vergelijkbare resultaten met minder dieren in vergelijking met de beoordeling van schimmel last van kwantitatieve PCR van longkanker schimmel DNA.

Histologische kwantificering te bepalen van de schimmel last long in experimentele aspergillose

Hier presenteren we een protocol om Aspergillus flavus groei en productie van aflatoxine in maïs kernels uiting van een antischimmel eiwit te analyseren.  Met behulp van een stam GFP-uiten A. flavus bewaakt we de infectie en de verspreiding van de schimmel in volwassen kernels in real-time. De bepaling is snel, betrouwbaar en reproduceerbaar.

Remming van de groei van de Aspergillus flavus en aflatoxine productie in transgene maïs uiten van de α-amylase Inhibitor van Lablab purpureus L.

We beschrijven een aangepaste methode op basis van agar die is ontworpen om de antischimmeleffecten van plantaardige producten te kwantificeren. Zowel volatiele als niet-volatiele bijdragen aan de antischimmelactiviteit kunnen via dit protocol worden beoordeeld. Bovendien kan de werkzaamheid tegen schimmels worden gemeten in belangrijke ontwikkelingsstadia in één experimentele opstelling.

Meten van vluchtige en niet-vluchtige antischimmelactiviteit van Biocontrol-producten

We presenteren een labelvrij live beeldvormingsprotocol met behulp van microscopietechnieken voor doorgegeven licht om beelden vast te leggen, groeikinetiek van de filamenteuze schimmel A. nidulans in zowel ondergedompelde culturen als vaste media te analyseren en te kwantificeren. Dit protocol kan worden gebruikt in combinatie met fluorescentiemicroscopie.

Kwantitatieve analyse van de groeisnelheid van Aspergillus nidulans met behulp van live microscopie en open-source software

Hier presenteren we een protocol op basis van het meelworm (Tenebrio molitor)-aassysteem dat werd gebruikt voor het isoleren en selecteren van entomopathogene schimmels (EPF) uit bodemmonsters. Een effectieve conidia-getalformule (ECN) wordt gebruikt om een hoge stresstolerante EPF te selecteren op basis van fysiologische kenmerken voor microbiële bestrijding van plagen in het veld.

Isolatie en selectie van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters en evaluatie van schimmelvirulentie tegen insectenplagen

Dit protocol is bedoeld om gedetailleerde procedures te bieden voor het verzamelen, fixeren en onderhouden van mycoheterotrofe plantenmonsters, waarbij verschillende microscopietechnieken worden toegepast, zoals scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie, licht-, confocale en fluorescentiemicroscopie om schimmelkolonisatie te bestuderen in plantenweefsels en zaden ontkiemd met mycorrhizaschimmels.

Microscopietechnieken voor het interpreteren van schimmelkolonisatie in mycoheterotrofe plantenweefsels en symbiotische kieming van zaden

Dit manuscript beschrijft een geoptimaliseerd inoculatieprotocol dat gebruik maakt van losse maïsbladomhulsels voor reproduceerbare cytologische, fysiologische en moleculaire studies van maïsinteracties met schimmelpathogenen van planten. De bladomhulsels vergemakkelijken real-time observatie van cellulaire interacties tussen de levende plant en de schimmel in niet-gefixeerde weefsels.

Losse maïsomhulsels voor levende beeldvorming van infectie door schimmelpathogenen van bladmaïs

Leer hoe u schimmelkolonisatie, sporogenese en mycotoxineproductie kwantificeert met kernel bioassays. Deze gestandaardiseerde methode onderzoekt zaad-fungus interacties voor gewasbescherming.

Kwantificering van schimmelkolonisatie, Sporogenesis, en de productie van mycotoxinen Met behulp van Kernel Bioassays

Meer video's verkennen