Name: Isolatie van basale cellen en Submucosale Gland Duct Cellen van Mouse Luchtpijp (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Leer de isolatie van basale cellen en submucosale klierductcellen uit de luchtpijp van muizen. Deze methode maakt in vivo- en in vitro-onderzoek naar luchtwegregeneratie en stamcelgedrag mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen de globale Stem Cell Research Center FACS erkennen en vooral Jessica Scholes en Felicia Codrea bedanken voor hun hulp bij celsortering. Het werk werd gefinancierd door CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society / COPD Stichting ATS-06-065, The Concern Foundation, De UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology Program / Longkanker SPORE, de Universiteit van Californië kanker Onderzoek Coordinating Committee en de Gwynne Hazen Cherry Memorial Laboratories (BG).

Overzicht van stappen 1. Dissectie van trachea 2. Reiniging luchtpijp en snijden 3. Enzymdigestie en verwerking tot enkele celsuspensie 4. Kleuring voor FACS sortering en 5. Verwerking gesorteerde cellen in vivo en in vitro modellen 1. Dissectie van Luchtpijp <ol><li> Euthanaseren de muis met een intraperitoneale injectie van 0,1 cc mg/0.2 van pentobarbital. </li><li> Snij de buikwand, en verplaats de darmen naar de zijkant om de abdominale aorta vervolgens bloot te leggen en te ontleden. </li><li> Open de kist door te snijden door het diafragma en de voorste borstwand aan beide zijden naar het hart en de longen bloot te leggen. Ga verder snijden in de hals het verwijderen van vet-en speekselklieren aan de luchtpijp bloot te leggen. </li><li> Verwijder de thymus en snijd de longen uit zijn verbindingen onder en achter. Separat de trachea van de slokdarm door met een forceps tussen knip de trachea op haar bovenste gedeelte boven de verbinding met de larynx. Houd vervolgens de luchtpijp met een tang en ontleden het van zijn gehechtheid en blijven naar beneden om het te verwijderen met het hart en de longen en-blok. Weggesneden hart en longen nabij de navel de meeste rechter en linker hoofdbronchi omvatten. </li><li> Plaats de trachea in een kleine petrischaal met verzamelen medium op ijs. </li></ol> 2. Reiniging Trachea en snijden <ol><li> Onder de dissectiemicroscoop, maken gebruik van zeer fijne punt pincet (nr. 5) en Vannas Tübingen schaar (FST 15.003-08 finescience.com) om de luchtpijp te reinigen van alle andere weefsels die eraan verbonden zijn. Dit omvat: lymfeklieren, recurrens, vet, schildklier en de resterende longvaten. Het bovenste deel van de trachea heeft speciale aandacht voor de grote laryngale kraakbeen te verwijderen zonder de grootste stel SMGdat wordt ingediend tussen de cricoid kraakbeen en de eerste tracheale kraakbenige ring (C1) 4. </li><li> Snijd de trachea in het bovenste deel en het onderste deel tussen C4 en C5 en opengesneden beide delen door het lumen van de trachea. </li></ol> 3. Enzym Spijsvertering en Verwerking tot enkele celsuspensie (SCS) <ol><li> Incubeer het onderste deel van de trachea in 1 ml 16 U dispase in een Eppendorf buis bij kamertemperatuur (RT) gedurende 30 min, zoals eerder beschreven 5. Voeg 0,5 mg / ml DNase I in DMEM nog 20 min bij RT. </li><li> Verwijder het verteerde luchtpijpen in de frisse verzamelen medium in een steriele petrischaal, en strip de oppervlakte-epitheel onder de dissectiemicroscoop. Gebruik een pipet om het medium dat de gestripte epitheel aan een 50 ml conische buis brengen. </li><li> Spin down de gestripte epitheel bij 1.000 xg bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en voeg 0,1% trypsine / EDTA en incubeer onder schudden ee buis in een 37 ° C incubator schudden (200 rpm) gedurende 30 minuten. Na de incubatie met een tip 1000 pi, op en neer pipetteren te breken klonten en een enkele celsuspensie te vormen. </li><li> Plaats de bovenste trachea in een conische buis met 1 ml van 0,15% pronase. Vervolgens incuberen bij 4 ° C gedurende 4 uur. </li><li> Voorzichtig vortexen de buis en vervolgens de luchtpijp te plaatsen in verse verzamelen medium en bevestigen onder de dissectiemicroscoop dat er volledige onthechting van het oppervlakte-epitheel (SE). </li><li> Hak de luchtpijp met een fijne schaar om het openstellen van de SMG compartimenten en vervolgens nog een uur in pronase incuberen bij KT met langzame schudden. </li><li> Spin down de tracheaweefsel, verwijder de pronase, voeg 0,1% trypsine / EDTA en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min met schudden als hierboven. </li><li> Passage de gedigereerde cellen klonten en eventueel overgebleven stukjes klieren door 20G, 23G en 26G naalden met een 10 ml spuit. Herhaal de passage meerdere keren met elkaar nld voordataftreden. Nu moet de meeste cellen in een SCS. </li><li> Filter de suspensie door een 40 uM zeef Was vervolgens de zeef en spin down de cellen. Vervolgens reconstitueren de cellen in de juiste hoeveelheid medium, tellen de cellen en zich onmiddellijk aan FACS kleuring en sortering. Laat cellen in 4 ° C of op ijs gedurende enkele uren omdat we vonden dat de levensvatbaarheid ernstig aantast en vermindert het gebied vormen efficiency. </li></ol> 4. Kleuring voor FACS en sorteren <ol><li> Neem voldoende cellen voorbereidende ongekleurd en gekleurd enkele compensatie buizen dan vlek rest van de cellen met primaire antilichamen, en geit Trop2 rat ITGA6, gedurende 15 min bij RT. Daarna wassen met PBS of het verzamelen van medium, remover het supernatant zeer zorgvuldig en breek de cel pellet. </li><li> Vlek met de geschikte secundaire antilichaam Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 min, wassen en verwijderen supernatant en pellet breken. </li><li> Op FACSARIA, na het aanpassen van uw spanning en compensatie, poort van het puin, zeer kleine cellen, wambuizen en dode cellen. Daarna moet de meeste cellen van het SE TROP2 positief terwijl 20-50% van SMG cellen zullen TROP2 + 6. </li><li> Stel uw sorteren poort voor Trop2 + ITGA6 + cellen uit het ZO (basale cellen) en voor Trop2 + cellen (+ /-ITGA6 positieve cellen) van SMG (kanaal cellen). </li></ol> 5. Verwerking voor gesorteerde cellen: in vitro cultuur en in vivo Model 5.1 In vitro bol vormen vijf-negen cultuur <ol><li> Meng 100 pl &quot;Growth Factor verminderd Matrigel&quot; met 100 ul compleet medium 10,11 (zie tabel 1) met tot 50.000 gesorteerde cellen vervolgens dit mengsel zet in de bovenste kamer van een 24-well trans-well. Vervolgens 400 ul volledig medium in onderkamer en incuberen bij 37 ° C. Wijziging medium in Tweede Kamer om de andere dag en voeg extra 100 ul van Matrigelelke week of zoveel eerder als het wordt dun. </li></ol> 5.2 In vivo model <ol><li> Los het gesorteerd celpellet in compleet medium 1:1 gemengd met matrigel bij een concentratie van 5.000-10.000 cellen per 50 ul. </li><li> Verdoof de ontvanger C57/BL6 muizen. Dien Carprofen (5 mg / kg) subcutaenously als analgeticum. Steriliseren en scheren hun rug maak dan een centrale longitudinale incisie in de huid in de bovenrug. De incisie moet groot genoeg zijn om de vetkussentje injectieplaats en de bleb die zich vormt na injectie identificeren. Gebruik de botte kant van de schaar om zakjes tussen de huid en de achterkant van de borstwand aan beide zijden van de toegang en visualisatie te maximaliseren verbreden. </li><li> Identificeer de mediale rand van het schouderblad door op de muis voorpoot omhoog en naar achteren om de scapula bewegende zien. Neem 50 pi van de celsuspensie in een 300 pl BD insulinespuit en injecteren in de vetkussentje net mediaal van de scapula en lateraalde wervels. Je moet in staat zijn om een ​​blaar anders ben je te diep te zien. Herhaal hetzelfde aan de andere kant dan clip of steek de huid incisie. Bekijk muizen en geven Carprofen (5 mg / kg, SC) eenmaal daags gedurende 48 uur. </li><li> Na 3 weken, euthanaseren muizen met pentobarbatol (0,1 mg/0.2 cc, IP), open de huid zoals hierboven beschreven en ontleden de hele vetkussentje aan beide zijden met een veiligheidsmarge om te voorkomen dat niet aan een of weefsel structuur die zou kunnen hebben gevormd en rond verlengd. Fix in PFA en embed in paraffine 12. Uiterst voorzichtig te worden toegepast bij het trimmen en snijden het blok niet te omzeilen of kijken uit over een structuur. De beste praktijk is tot 40 pm trimmen eenmaal knip dan een 4 micrometer slice, het op een glasplaatje te plaatsen en deze onder de microscoop om te controleren of er nog &quot;epitheliale structuren&quot; in dit deel van het blok of niet te onderzoeken. Als er niets gezien, en knip een keer en herhaal deze stap. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Stripping van de muis trachea zal resulteren in een trachea blootgelegd die zichtbaar licht microscopie zoals getoond in figuur 1A. Figuur 1B toont de brightfield aanzicht van een trachea na epitheliale strippen met submucosale klieren worden vrijgesteld van de weefsels en lijken druiventrossen. Pronase verwijdert de ITGA6 epitoop en dit is de reden waarom de TROP2 kanaal cellen kunnen niet worden gescheiden in ITGA6 + en - populaties. Echter, dispase, die ITGA6 epitoop behoudt, verteert de oppervlakte-epitheel en de leiding cellen zelfs met zeer korte incubatietijden en kan daarom niet worden gebruikt om kanaal scheiden van basale cellen 3. Flowcytometrie van de enkele cel suspensies moeten tonen voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing percelen die worden weergegeven in Figuur 2A. Goede scheiding van duct cellen van de rest als de tracheale cellen worden gezien met de Trop2 antilichaam flowcytometrie voor fluorescentie-geactiveerde cel sorting (FACS) zoals in figuur 2B. Bollen zichtbaar moet in de Matrigel na ongeveer 1 week in cultuur en in dichte uiterlijk als getoond in figuur 3. De efficiëntie van dit proces is de orde van 1-2% en enkele cellen nog aanwezig zijn in de Matrigel en vertegenwoordigen waarschijnlijk cellen van de submucosale klier kanalen die niet over het vermogen tot zelfvernieuwing. Injectie van duct stamcellen in de muis vetkussentje resulteert in de vorming van submucosale klier-achtige structuren die worden weergegeven in Figuur 4. Deze worden gezien in de blokken ook zonder H &amp; E kleuring. Deze zijn bolvormig en hebben een centrale lumen. Veel doorsneden moeten worden gemaakt door middel van het vet pad om te voorkomen dat deze epitheliale structuren missen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig1.jpg" /> Figuur 1. Enzymatische digestie van tracheale epitheel. Verwijderen van oppervlakte epitheelcellen wordt met black pijlen, verwijdering van cellen in de submucosale klier kanalen wordt met groene pijlen. Denuded luchtpijpen die zichtbaar door lichtmicroscopie getoond na 30 min dispase spijsvertering en na 4 uur van pronase digestie. <img alt="Figuur 2A" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2A.jpg" /> Figuur 2A. I. Flowcytometrie van de enkele cel suspensies die representatief voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing percelen van muis luchtpijpen na oppervlakte epitheel strippen. ii. Vertegenwoordiger FACS percelen voor TROP2 expressie in het kanaal cellen van de muis luchtpijpen. <img alt="Figuur 2B" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2B.jpg" /> Figuur 2B. I. Flowcytometrie van de enkele cel suspensies van ontdaan oppervlakte-epitheel van de onderste twee derde van de muis trachea met representatieve voorwaartse verstrooiing en aan de zijkant puntgrafieken. ii. Typische FACS perceel van ITGA6 expressie in surface epitheel. iii. Een andere vertegenwoordiger FACS perceel van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing van oppervlakte-epitheel toont terug gating van de basale cel populatie in het groen. iv. Typische ITGA6 en TROP2 expressie brengende cel populatie in het groen. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig3.jpg" /> Figuur 3. Tijdsverloop van de ontwikkeling van bolletjes. A. Duct bollen. Spheres moet zichtbaar zijn in de Matrigel na ongeveer 1 week in de cultuur en bijna alle zijn dicht in verschijning. Enkele cellen die niet tot bolletjes worden ook gezien. (Schaal bar = 50 pm). B. Basal bollen zijn groter en luminale in uiterlijk. Enkele cellen die niet tot bolletjes worden ook gezien. (Schaal bar = 50 pm). <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig4.jpg" /> Figuur 4. Injectie duct stamcellen in de muis vetkussentje resulteert in de vorming van submucosale klier-achtige structuren. Representatieve structurenwordt in vetkussentje en sommige zijn vertegenwoordigd produceren mucine (lichtblauw) met Alcian blue Periodic Acid Schiff kleuring.

<ol><li>Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+functions+of+the+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Contrib.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innate immune functions of the airway epithelium.</a> Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).</li>
<li>Finkbeiner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathology+of+tracheobronchial+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathology of tracheobronchial glands.</a> Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).</li>
<li>Hegab, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Stem%2FProgenitor+Cell+Population+from+Murine+Tracheal+Submucosal+Gland+Ducts+with+Multipotent+Regenerative+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Jeffery, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+features+of+airway+surface+epithelial+cells+and+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).</li>
<li>Rock, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).</li>
<li>Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trop2+identifies+a+subpopulation+of+murine+and+human+prostate+basal+cells+with+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+an+epithelial+stem%2Fprogenitor+cell+hierarchy+in+the+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).</li>
<li>Inayama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+growth+and+differentiation+of+clones+of+tracheal+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells.</a> Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).</li>
<li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells%3A+selection+of+a+proliferative+population%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).</li>
<li>Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Bronchial+Epithelial+Cells+Differentiate+to+3D+Glandular+Acini+on+Basement+Membrane+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).</li>
<li>Ooi, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+a+putative+tumor-initiating+progenitor+cell+population+predicts+poor+prognosis+in+smokers+with+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer.</a> Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Deze techniek kanaal en basale cellen van de luchtwegen isolaat belangrijk voor een beter begrip van de luchtwegen en herstel en regeneratie van de luchtwegen. De hier beschreven technieken zijn een paar kritische stappen. De eerste is de geoptimaliseerde enzymatische vertering periode. De tweede is het creëren van een enkele celsuspensie door middel van seriële passage met steeds hogere gage naalden naar cel knippen te voorkomen, maar te breken celklonten. De derde is de FACS analyse en gating van cellen met geschikte ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Compleet medium 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td></tr><tr><td> Hepes (15 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat (3,6 mm of 0,03%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-glutamine (4 mM) </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-Cl </td></tr><tr><td> Penicilline (100 U / ml) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001 CI- </td></tr><tr><td> Streptomycine (100 ug / m) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001 CI- </td></tr><tr><td> Amfotericine B (0,25 ug / ml) </td><td> Lonza </td><td> 17-836R </td></tr><tr><td> InSulin (10 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Transferrine (5 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> T1147 </td></tr><tr><td> Choleratoxine (0,1 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> C8052 </td></tr><tr><td> Epidermale groeifactor (25 ng / ml) </td><td> BD </td><td> 354001 </td></tr><tr><td> Runder-hypofyse extract (30 ug / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum (5%) </td><td> Visser </td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td> Retinoïnezuur (0,05 uM) </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> Growth Factor Verminderde Matrigel </td><td> BD </td><td> 354230 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Vul media componenten. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td&gt; <td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 10165921001 </td><td> Gebruikt op 0,15%: -O / n bij 4 ° C digestie om de totale tracheale cellen (ALI cultuur) isoleren -4 Uur digestie 4 ° C te isoleren SMG </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> Gebruikt bij 16 eenheden: 30 min bij RT </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> Gebruikt bij 0,5 mg / ml: 20-30 min bij RT </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Enzymen die voor enzymatische afbraak van de trachea.

isolatie van basale cellen en submucosale gland duct cellen van mouse luchtpijp

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

De grote luchtwegen rechtstreeks in contact met de omgeving en dus gevoelig voor schade van toxines en infectieuze agentia die we inademen in 1. De grote luchtwegen vereisen daarom een ​​efficiënt herstelmechanisme ons lichaam beschermen. Dit proces vindt reparatie van stamcellen in de luchtwegen en het isoleren van stamcellen die uit de luchtwegen belangrijk voor het begrijpen van de mechanismen van herstel en regeneratie. Het is ook belangrijk voor het begrijpen van abnormale reparatie die kan leiden tot aandoeningen van de luchtwegen 2. Het doel van deze methode is om een nieuwe stamcelpopulatie isoleren van de muis trachea submucosale klier kanalen en deze cellen plaats in in vitro en in vivo modelsystemen de mechanismen van herstel en regeneratie van de submucosale klieren 3 identificeren. Deze productie toont methoden die kunnen worden gebruikt voor het isoleren en assay het kanaal en basale stamcellen uit de grote luchtwegen 3. Hierdoor kunnen weom ziekten van de luchtwegen, zoals cystische fibrose, astma en chronische obstructieve pulmonaire ziekte te bestuderen. Momenteel zijn er geen methoden voor het isoleren van submucosale klier duct cellen en er zijn geen in vivo modellen voor de regeneratie van submucosale klieren bestuderen.

Hier laten we zien ons protocol voor isolatie van basale en submucosale klier kanaal cellen van de muis luchtpijpen. We tonen ook aan de methode van het injecteren van stamcellen in het dorsale muis vetkussentje om een ​​te creëren<em&gt; In vivo</em&gt; Model van submucosale klier regeneratie.

Isolatie van basale cellen en Submucosale Gland Duct Cellen van Mouse Luchtpijp

De grote luchtwegen staan in direct contact met de omgeving en zijn daarom gevoelig voor beschadiging door toxines en infectieuze agentia die we inademen 1. ...

Het doel van deze methode is om stamcellen te isoleren uit de gangen van de submucosale klieren van de muizentrachea voor onderzoek naar herstel en regeneratie. Eerst wordt de trachea gedisseceerd uit een geëuthanaseerde muis. De trachea wordt vervolgens gereinigd, ingesneden en gedigesteerd.Vervolgens wordt het epitheel mechanisch gestript en verder verteerd om een enkelcel-suspensie te genereren. De cellen worden daarna gekleurd voor FACS-sorting en tot slot verwerkt voor gebruik in in vivo en in vitro assays. Uiteindelijk kan deze methode helpen bij het identificeren van belangrijke signaalpaden die de zelfvernieuwing en differentiatie van epitheelstamcellen in de luchtwegen reguleren.Deze technieken zijn belangrijk omdat ze ons voorzien van in vitro en ex vivo modellen voor herstel en regeneratie van het luchtwagepitheel. Hierdoor kunnen we zowel het normale herstel van de luchtwegen als ziekten van de luchtwegen bestuderen, zoals chronische obstructieve longziekte, cystic fibrosis en astma. We kregen het idee voor deze methode toen we geen specifieke oppervlaktemarkers konden vinden om de basale cellen te scheiden van de ductale stamcellen; daarom besloten we het oppervlakkige epitheel met de basale cellen te verwijderen, zodat de ductale cellen achterbleven. Demonstratie van de procedures voor tracheale dissectie.Luchtweg-epitheelstripping, het maken van een enkelcel-suspensie en FACS-sortering zullen worden uitgevoerd. Een postdoctoraal onderzoeker in mijn lab demonstreert de procedures voor het verwerken van gesorteerde cellen in in vitro- en ex vivo-modellen, samen met onze labmanager. Begin deze procedure door de buikwand van een geëuthanaseerde muis open te snijden.Verschuif de darmen naar de zijkant om de abdominale aorta bloot te leggen en dissekeer deze vervolgens. Open de borstkas door het diafragma en de binnenste borstwand aan beide zijden door te snijden om het hart en de longen bloot te leggen. Snijd verder omhoog in de nek en verwijder het vet en de speekselklieren om de trachea bloot te leggen met behulp van een fijne schaar.Verwijder de thymus en scheid de long van het bindweefsel eronder en erachter. Plaats vervolgens de pincet tussen de trachea en de oesofagus om deze van elkaar te scheiden. Snijd de trachea door aan het bovenste gedeelte, boven de verbinding met de larynx.Houd vervolgens de trachea vast met de pincet en ontleed deze door de aanhechtingen door te snijden. Om de trachea samen met het hart-longblok te verwijderen, snijdt u verder naar beneden en verwijdert u het hart en de longen nabij het hilum, zodat het grootste deel van de rechter- en linkerhoofdbronchi behouden blijft. Plaats de trachea in een kleine Petrischaal met opvangmedium op ijs onder de dissectiemicroscoop.Gebruik een zeer fijne pincet nummer vijf, een veneuze tube en een schaar om al het weefsel dat aan de trachea vastzit te verwijderen. Dit omvat lymfeklieren, vet rond de nervus laryngeus recurrens, de schildklier en de resterende longvaten. Het bovenste gedeelte van de trachea vereist speciale aandacht bij het verwijderen van de grote stukken larynxkraakbeen, zonder de grootste groep submucosale klieren aan te tasten die gelegen is tussen het CRICO-kraakbeen en de eerste tracheale kraakbeenring C one.Snijd vervolgens de trachea tussen C4 en C5 in een bovenste en een onderste gedeelte. Open beide delen via het lumen van de trachea. Breng het onderste gedeelte van de trachea over in microcentrifugebuisjes van 1 ml en het bovenste gedeelte van de trachea in een conische buis van 15 ml voor enzymatische digestie en verwerking tot enkelcel-suspensies.In het volgende deel van de procedure worden de onderste en bovenste delen van de trachea verwerkt om enkelcel-suspensies te genereren. Hoewel deze hier gelijktijdig verwerkt moeten worden, worden de twee methoden sequentieel gedemonstreerd. Om het onderste deel van de trachea te verwerken, voegt u dit toe aan één milliliter van 16 unit dis space in een microcentrifugebuis en incubeert u dit 30 minuten bij kamertemperatuur.Breng de trachea vervolgens over naar een nieuwe buis met 0,5 mg/mL DNAse I in DMM voor nog eens 20 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik na de digestie een fijne pincet om het weefsel over te brengen naar een steriele Petrischaal met vers opvangmedium. Strip vervolgens onder de dissectiemicroscoop het oppervlakte-epitheel door voorzichtig aan de epitheelvellen te trekken om ze te scheiden van het onderliggende basaalmembraan. Gebruik daarna een pipet om het medium met het gestripte epitheel over te brengen naar een kegelvormige buis van 50 mL en centrifugeer bij 1000 G bij 4 °C.Verwijder na het centrifugeren de SNAT en voeg 0,1% tripsin EDTA toe; incubeer de buis gedurende 30 minuten in een schuddende incubator bij 37 °C. Pipetteer na de incubatie herhaaldelijk op en neer met een 1000 µL tip om celklonten op te breken en ervoor te zorgen dat de cellen een enkelcel-suspensie vormen. Plaats de bovenste trachea in een conische buis met 1 mL 0,15% Pronase en incubeer vervolgens vier uur bij 4 °C. Overbreng het onderste deel van de trachea naar een microcentrifugebuis van 1 mL die 1 mL medium bevat met 16 units disc base.Vortex de buis na de incubatie voorzichtig en plaats de trachea vervolgens in vers opvangsmedium. Bevestig onder de dissectiemicroscoop dat het oppervlakte-epitheel volledig is losgelaten. Gebruik een fijne schaar om de trachea fijn te knippen en de compartimenten van de submucosale klieren te openen.Incubeer nog een uur in 0,15% pronase bij kamertemperatuur met langzaam schudden. Centrifugeer het tracheaweefsel na het verwijderen van de pronase. Voeg 0,1% tripsin EDTA toe en incubeer 30 minuten bij 37 °C met schudden.Filter vervolgens de grote brokken met een zeef van 70 micron. Was daarna de zeef met medium. Druk de gedigereerde celklonten en eventuele resterende klompen klierweefsel door naalden van 20 gauge, 23 gauge en 26 gauge met behulp van een spuit van 10 milliliter.Herhaal het passeren meerdere keren met elke naaldmaat voordat u overstapt naar een kleinere maat. De meeste cellen zouden nu in een enkelcel-suspensie moeten zitten. Filtreer de suspensie door een 40 micron zeef, was de zeef vervolgens met medium en centrifugeer de cellen.Resuspendeer vervolgens de cellen in het juiste volume medium, tel de cellen en ga direct over tot kleuring en sortering. Neem voldoende cellen voor het voorbereiden van de ongekleurde en enkelgekleurde compensatiebuisjes. Kleur vervolgens de resterende cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met primaire antilichamen tegen trop tube en I TGA six. Was na de incubatie met PBS of opvangmedium en verwijder het supernatant zeer voorzichtig.Resuspendeer de celpellet in de geschikte secundaire antilichaamkleuring. Incubeer 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Was vervolgens de cellen om de kleurstof te verwijderen en resuspendeer de pellet.De cellen kunnen nu worden gesorteerd middels fluorescentie-geactiveerde cel sortering. Nu de cellen zijn gesorteerd, kunnen ze worden gebruikt om de mechanismen van herstel en regeneratie te onderzoeken door in vitro sfeer-vormende culturen te genereren. Meng 100 µL groeifactor-gereduceerde Matrigel met 100 µL compleet medium dat tot 50.000 gesorteerde cellen bevat.Pipetteer dit mengsel in de bovenkamer van een 24-well transwell-plaat; pipetteer 400 µL compleet medium in de onderkamer en incubeer bij 37 °C. Ververs het medium in de onderkamer om de dag en voeg wekelijks, of eerder indien de laag dun wordt, extra 100 µL Matrigel toe.Sferoïden vormen zich doorgaans na zeven dagen en kunnen gedurende enkele weken worden gekweekt of serieel worden gepassaged. Voor het in vivo model wordt het gesorteerde celpellet gereconstitueerd in volledig medium, één-op-één gemengd met matri gel, bij een concentratie van 5 000 tot 10 000 cellen per 50 µL. Steriliseer en scheer de rug en vervolgens de bovenrug van de ontvanger C 57 black six muis na anesthesie.Maak een centrale longitudinale huidincisie. Gebruik de stompe zijde van het schaarblad om zakjes tussen de huid en de achterzijde van de borstwand aan beide zijden te verbreden. Duw de voorpoot van de muis omhoog en naar achteren om de mediale rand van de scapula te verplaatsen en te identificeren.Inject vervolgens met een insulinespuit van 300 µL 50 µL van de celsuspensie in het vetkussen net mediaal van de scapula en lateraal van de wervelkolom. Er moet een bleb ontstaan; herhaal de injectie aan de andere zijde en zet vervolgens de huidincisie met een clip of hechting. Open na drie weken de huid van de geëuthanaseerde muis zoals voorheen en dissecteer het volledige vetkussen van beide zijden met een veiligheidsmarge.Om te voorkomen dat weefselstructuren die zich mogelijk hebben gevormd en uitgebreid over het hoofd worden gezien, wordt het gedisseceerde vetkussen gefixeerd in PFA en ingebed in paraffine; dit voorkomt dat structuren worden overgeslagen of over het hoofd worden gezien tijdens het snijden van het blok. Trim één keer 40 micron en snijd daarna een plakje van vier micron.Plaats het op een glazen objectglas en onderzoek het vervolgens onder de microscoop om vast te stellen of er epitheelstructuren aanwezig zijn. Als er niets te zien is, trim dan nogmaals en herhaal deze stap. Het strippen van de trachea van de muis, zoals beschreven in deze video, resulteert in een gedenudeerde trachea die zichtbaar is via lichtmicroscopie, zoals getoond in here denuded tracheas.Na 30 minuten digestie worden de verteerde en ontblootte trachea's links getoond. Na vier uur pronase-digestie worden deze rechts getoond. Na het verwijderen van het epitheel komen de submucosale klieren vrij uit de weefsels en lijken ze op trossen druiven.De verwijdering van oppervlakkige epitheelcellen wordt aangegeven met zwarte pijlen. De verwijdering van cellen in de submucosale klier en gangen wordt aangegeven met groene pijlen. Flowcytometrie van de enkelcel-suspensies moet forward scatter- en side scatter-plots laten zien zoals hier weergegeven.Goede scheiding van ductcellen van de rest. Indien de tracheale cellen met het Trop two-antilichaam in flowcytometrie voor fluorescentie-geactiveerde cel sortering moeten worden waargenomen, zouden na ongeveer een week in kweek sferen zichtbaar moeten zijn in de matrigel; deze zijn luminaal wanneer ze afgeleid zijn van basale cellen en hebben een ductaal uiterlijk wanneer ze afgeleid zijn van ductcellen. De efficiëntie van dit proces ligt in de orde van 1 tot 2% en er zullen nog steeds enkelvoudige cellen in de matrigel aanwezig zijn, die waarschijnlijk cellen uit de ducten van de submucosale klier vertegenwoordigen die niet over het vermogen tot zelfvernieuwing beschikken.Basale sferen zijn groter en hebben een luminaal uiterlijk. Injectie van ductale stamcellen in het vetkussen van de muis resulteert in de vorming van submucosale klierachtige structuren die sferisch zijn en een centraal lumen bezitten. Deze zijn in de blokjes zichtbaar, zelfs zonder H&amp;E-kleuring.Er moeten veel dwarsdoorsneden door het vetkussen worden gemaakt om een sectie te verkrijgen die deze epitheliale structuren bevat. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een stamcelpopulatie isoleert uit submaxillaire kliergangcellen; zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 10 uur worden voltooid. Na deze procedure kunnen de kweekcondities worden gewijzigd om verschillende vragen te beantwoorden met betrekking tot sfeerformatie en regeneratieve groeifactoren.

isolation-basal-cells-submucosal-gland-duct-cells-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Pulmonale epitheliale cellen kunnen worden geïsoleerd uit de luchtwegen van muizen en gekweekt bij de lucht-vloeistof interface als een model van gedifferentieerde respiratoire epitheel. Een protocol is beschreven voor het isoleren, kweken en het blootstellen van deze cellen om te mainstream sigarettenrook, om moleculaire reacties studie om deze milieu-toxine.

Isolatie van Mouse Respiratory epitheelcellen en Blootstelling aan Experimentele Cigarette Smoke bij Air Liquid Interface

We beschrijven de snelle isolatie van primaire murine type II alveolaire epitheelcellen (AECII) door flowcytometrische negatieve selectie. Deze AECII vertonen hoge levensvatbaarheid en zuiverheid en zijn geschikt voor diverse functionele en moleculaire studies over hun rol bij luchtwegaandoeningen zoals auto of infectieziekten.

Flowcytometrische Isolatie van primaire Murine Type II alveolaire epitheelcellen voor Functionele en moleculaire studies

Een efficiënte manier om lymfocyten uit muizen genitaal isoleren beschreven. Deze methode maakt gebruik van enzymdigestie en Percoll gradiëntscheiding om efficiënte isolatie. Deze techniek is ook aangepast aan gebruik in andere...

Isolatie van Lymfocyten van Mouse geslachtsorganen Mucosa

Een eenvoudige en betrouwbare techniek voor het visualiseren en kwantificeren luchtwegen trilharen beweeglijkheid en trilharen gegenereerde stroom met behulp van de muis luchtpijp wordt beschreven. Deze techniek kan worden aangepast om te bepalen hoe een groot aantal factoren beïnvloeden cilia motiliteit, zoals farmacologische agentia, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals slijm belasting.

Ex vivo methode voor High Resolution Imaging van Cilia Motility in Knaagdieren luchtwegepithelen

Penseel cellen zijn zeldzame cholinerge chemosensorische epitheelcellen gevonden in de naïeve muis trachea. Vanwege hun beperkte aantallen is de ex vivo-evaluatie van hun functionele rol in luchtweg-immuniteit en-renovatie een uitdaging. We beschrijven een methode voor isolatie van tracheale penseel cellen door flow cytometrie.

Isolatie en kwantitatieve evaluatie van de penseel cellen van muis Tracheas

De traanklier (LG) heeft twee soorten cellen uitdrukken α-Smooth spier actine (αSMA): Myo cellen (MECs) en pericyten. MECs zijn van ectodermale oorsprong, gevonden in vele klier weefsels, terwijl pericyten zijn vasculaire gladde spiercellen van endodermal oorsprong. Dit protocol isoleert MECs en pericyten van muizen LGs.

Isolatie van Myo cellen van volwassen muizen traan en submandibulaire klieren

Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie voor weefseldissociatie en cellulaire fractioneringsbenaderingen die verrijking van levensvatbare epitheelcellen uit proximale en distale gebieden van de menselijke long mogelijk maken. Hierin worden deze benaderingen toegepast voor de functionele analyse van longepitheelvoorlopercellen door het gebruik van 3D organoïdencultuurmodellen.

Isolatie en verrijking van menselijke longepitheelvoorlopercellen voor organoïde cultuur

Hier presenteren we een protocol om muizendarmmesenchym te isoleren, inclusief telocyten. Deze kunnen worden gebruikt voor verschillende toepassingen, zoals co-cultuur met muis of van de mens afgeleide organoïden, om de groei te ondersteunen en de situatie in het oorspronkelijke weefsel beter weer te geven.

Isolatie van muizendarmmesenchym resulterend in een hoge opbrengst van telocyten

Hier wordt een reproduceerbare, betaalbare en robuuste methode gepresenteerd voor de isolatie en uitbreiding van primaire bronchiale epitheelcellen voor biobanking op lange termijn en het genereren van gedifferentieerde epitheelcellen door cultuur op de lucht-vloeistofinterface.

Het isoleren van bronchiale epitheelcellen uit gereseceerd longweefsel voor biobanking en het opzetten van goed gedifferentieerde lucht-vloeistof interfaceculturen

Hier beschrijven we een in vitro model voor het isoleren en differentiëren van luchtwegepitheelcellen van muizen, waarbij we ons richten op hun acclimatisatie aan chronisch sigarettenrookextract (CSE). Het model kan worden gebruikt om de multi-omics-impact van CSE uitgebreid te karakteriseren, wat mogelijk inzicht geeft in de cellulaire reacties onder chronische blootstelling aan rook.

In vitro model voor het bestuderen van differentiatie en veranderingen van multi-omics op muizen luchtwegepitheelcellen gestimuleerd met sigarettenrookextract

Dit protocol beschrijft een methode om de productie van stikstofoxide (NO) te kwantificeren in luchtwegepitelculturen die gedifferentieerd zijn bij het lucht-vloeistofinterface (ALI) door nitriet te meten in apicale secreties met behulp van een trijodide-gebaseerde chemiluminescentie-assay.

Meting van stikstofmonoxideproductie in muizen-tracheale epitheelcelculturen, onderscheiden aan de lucht-vloeistofgrens

Leer de isolatie van basale cellen en submucosale klierductcellen uit de luchtpijp van muizen. Deze methode maakt in vivo- en in vitro-onderzoek naar luchtwegregeneratie en stamcelgedrag mogelijk.

Isolatie van basale cellen en Submucosale Gland Duct Cellen van Mouse Luchtpijp

Meer video's verkennen