Name: Dissectie van volwassen muis Utricle en Adenovirus-gemedieerde Ondersteunende-cel infectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Leer de dissectie van volwassen muis utricle en adenovirus-gemedieerde infectie van ondersteunende cellen. Deze methode biedt een waardevol model voor het bestuderen van haarcelregeneratie en overleving in het binnenoor.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de afdeling van de intramurale onderzoek aan het National Institute on Doofheid en Andere Communicatie Wanorde. Extra ondersteuning werd verleend door het NIDCD, toont 5R01 DC007613.

1. Utricle Dissection en Cultuur <ol><li> Euthanaseren van een volwassene (4 weken oud of ouder) muis met behulp van een goedgekeurd protocol en te onthoofden. </li><li> Knip de uitwendige gehoorgang aan beide zijden van het hoofd en trek de huid naar de neus. Halveren het hoofd van achter naar voren en verwijder de hersenen van beide zijden om de benige labyrint te onthullen. </li><li> Knip de schedel uit de buurt van het benige slakkenhuis en de benige labyrint (inclusief de bulla) om een ​​weefselkweek kap uitgerust met een dissectie microscoop te dragen (Let op: Adenovirus werk moet worden uitgevoerd in een klasse II biologische veiligheids-kast). </li><li> In de kap, breng elke slakkenhuis met een 35mm weefselkweek schotel met steriel dissecteren media (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (figuur 1a). </li><li> Als de auditieve bulla nog intact (het is mogelijk om de bulla verwijderen tijdens de bruto ontleding door uw miniatuur tussen bulla en de top vanhet slakkenhuis), gebruik maken van twee tang (een # 3 en een # 5) aan de bulla (Figuur 1B) te breken. </li><li> Identificeer de bezienswaardigheden van het benige slakkenhuis voorbereiding: top, basis, gehoorbeentjes, ovaal en ronde ramen, VIIIe zenuwwortel, halfcirkelvormige kanalen (zie figuur 1 C, D). </li><li> Plaats het binnenoor in de schaal met de mediale zijde naar boven, zodanig dat de ovaal en ronde ramen en de top bevinden zich op de bodem van de schaal en de VIIIe zenuwwortel naar boven wijst. Houd de preparatie met een tang # 3 in het gebied van de halfcirkelvormige kanalen (figuur 1D). </li><li> Met behulp van een scalpel uitgerust met een # 11 mes, sneed de top van het slakkenhuis net apicaal van de zenuwwortel (figuur 1D). </li><li> Draai de voorbereiding, zodat het gemaaide deel wordt naar boven. Gebruik de voorste halfrond kanaal als een handvat voor het opmaken van (figuur 1E) te stabiliseren. </li><li> Met behulp van # 5 tang, verwijder het slakkenhuis in het modiolus naar benedende basis. Op het punt waar de haak gebied van de cochlea gaat naar beneden, met een fijne sonde (de helft van een gebroken # 55 tang) tot de laatste benige plank van de benige lamina spiraal (figuur 1F) op te heffen, het openbaren van de sacculus. Net onder de sacculus is de stijgbeugel voetplaat, dat is een belangrijke mijlpaal. De utricle is direct naast de stijgbeugel voetplaat (figuur 1G), en het is omgeven door bot. Gebruik de sonde naar de been weg chip voldoende licht ongeveer 1/3 van de utricle. Verwijder voorzichtig de utricle met behulp van # 55 tang (figuur 1H). Deze procedure zal meestal resulteren in het verwijderen van de gepigmenteerde epitheel dak als de utricle wordt getrokken uit de benige voorbereiding. Indien de utricle verwijderd met het dak epitheel intact, het dak worden verwijderd met een pincet # 55. </li><li> Utricles voor adenovirus infectie (of live-imaging experimenten) moeten de otoconia verwijderd tijdens de dissectie (voorafgaand aan de infectie).In dit geval gebruik maken van een luer-lock spuit die gevuld is met het ontleden van media en voorzien van een kleine naald (meestal 26-28 meter). Houd de utricle aan de rand met behulp van # 55 tang (figuur 1 I). Breng de naald in de buurt van de utricle met de afschuining van de naald naar beneden. Gebruik een stroom van het ontleden van media op te blazen uit de otoconia (Figuur 1J). Als alternatief kan otoconia worden verwijderd door borstelen ze af met behulp van een wimper tool (Ted Pella, Inc # 113). Utricles die niet gaan adenovirale infectie ondergaan zijn normaal gekweekte vrij zwevend in 24-well kultuur platen met de otoconia intact (zie hieronder voor post-fix otoconia verwijderen, dat is makkelijker). </li><li> Zodra alle utricles worden ontleed, wijzigt u de ontleden media om steriele voedingsbodems: DMEM F12 (Gibco # 11320), aangevuld met 5% FBS en 50 U / ml penicilline G (Sigma). </li><li> Utricles gekweekt bij 37 ° C en 5% CO2. Als culturen worden maintaINED voor meer dan 48 uur, moet de helft van de voedingsbodems worden veranderd om de dag. Culturen kunnen worden gehandhaafd voor een week of langer. </li></ol> 2. Adenovirus Infectie van Ondersteunende cellen Belangrijk: Werken met adenovirus vereist Biosafety Level 2 (BSL2) procedures en certificaten. Neem contact op met uw Institutionele bioveiligheid Officer voor begeleiding en opleiding op het BSL2 procedures. <ol><li> Ontleden utricles zoals hierboven in de dissectie media (geen serum). Verwijder otoconia als hierboven. </li><li> Als u klaar bent om te besmetten, over te dragen een utricle (haarcellen boven) in elk putje van een Nunc mini-tray (Fisher # 12-565-68) met 15 ul serum-vrij DMEM F12 (dit is belangrijk, omdat serum kunnen inactiveren het virus) . Deze overdracht is makkelijker met een 1,5 mm microcurette (# 10082-15 van Fine Science Tools). </li><li> De Ad-GFP serotype 5 met de virale verwijderd E1 en E3 genen en de humane CMV promoter de transgENE (GFP). Dit virus werd verkregen van Vector BioLabs (Philadelphia, PA <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). Stock virussen zijn aangebracht aan titers van 1,0-4,0 x 10 10 pfu / ml. Voeg 0.5-2 ul voorraad virus aan elk putje met een utricle (figuur 1 liter). De werkelijk gebruikte hoeveelheid varieert, afhankelijk van het virus en voorraad titer. We algemeen infecteren elk utricle met 1.0-4.0 × 10 7 PFU. </li><li> Cultuur de utricles in virus-bevattende media bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 2 uur. Na 2 uur, terug over te dragen van de utricles om de 24-en weefselkweek plaat met cultuur media met serum. De cultuur van de utricles nacht bij 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Utricles kan worden de volgende dag voor levende beeldvorming experimenten, of ze kunnen worden vastgesteld haarcellen immunochemische (zie hieronder). Virale transgenexpressie toeneemt in de tijd, dus als transgenexpressie is laag bij 24 uur na infectie kan hijgunstig kweekcellen eens 24 uur in serum-bevattende media. Als je ziet haar cel toxiciteit, vermindering van de hoeveelheid virus. </li></ol> 3. Utricle Fixatie, otoconia verwijderen, en Immunochemie <ol><li> Aan het einde van de kweekperiode vast utricles in 4% paraformaldehyde voor een 3 uren bij kamertemperatuur (een schommelbeweging platform) of overnacht bij 4 ° C. Wash utricles (3 keer, 15 minuten elk) in 0,1 M (1X) fosfaat Sorensen de buffer van pH 7,4. Deze stappen worden uitgevoerd in een 24-well kultuur plaat. </li><li> Otoconia verwijderen: Opmerking: otoconia moet worden verwijderd voordat adenovirus infectie (zie stap 1.11 hierboven). Echter, utricles niet worden geïnfecteerd worden gekweekt en vast met de otoconia nog intact. In dit geval gebruik maken van de beschreven stappen hier om de otoconia verwijderen na fixatie. Controleer utricles voor de resterende gepigmenteerde dak epitheel. Verwijder voorzichtig het resterende dak epitheel met behulp van twee # 55 forceps. Om de otoconia verwijderen, vervangen Sorensen&#39;s fosfaatbuffer met 750-1000 ul Cal-Ex ontkalker (Fisher # CS510-1D). Laat Cal-Ex op utricles gedurende 1 minuut en 40 seconden (niet meer dan 2 minuten). Vervang Cal-Ex met 0,1 M fosfaat Sorensen&#39;s buffer en wassen (5 keer, 5 minuten per stuk). </li><li> Incubeer utricles in natriumboorhydride (Sigma # 452882, 1% in gedeïoniseerd water) voor 10 minuten. Was utricles in 0,1 M fosfaat Sorensen de buffer (5 keer, 5 minuten per stuk). </li><li> Place utricles in blokkeeroplossing (PBS + 2% bovine serum albumine + 0,8% normaal geitenserum + 0,4% Triton X-100) gedurende 3 uur bij kamertemperatuur op een schommelende platform. </li><li> Voeg primaire antilichamen en incubeer overnacht bij 4 ° C. Anti-Myosine 7a (ofwel Proteus Biosciences # 25-6790 of # MYO7A 138-1 van de Developmental Studies Hybridoma Bank) op 1:100 in het blokkeren oplossing labels alle haarcellen. Afzonderlijk te labelen striolar en niet-striolar haarcellen, hebben we gebruik gemaakt van een dubbel-label protocol met monoklonale anti-calmoduline (Sigma # C 3545, 1:150) en polyklonale anti-calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, USA, 1:200). Secundaire antilichamen (gewoonlijk Alexa fluor geconjugeerde secundaire antilichamen van Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) verdund in blokkeeroplossing 1:500 en gedurende 4 uur in het donker bij kamertemperatuur op een schommelende platform. </li><li> Mount utricles op glasplaatjes met Fluoromount-G (Zuid-Biotech, Birmingham, AL, USA). </li></ol> 4. Representatieve resultaten Utricles gekweekt deze methode vol behouden aanvulling van zowel haarcellen en ondersteunen cellen (Figuur 2). Haarcellen in gezonde culturen te tonen rond nucleaire profielen omgeven door dunne cytoplasmatische regio&#39;s die 7a-positieve myosine (figuur 2, bovenste paneel). Ondersteunende cellen (gelabeld met anti-Sox2) zijn kleiner en dicht op elkaar gepakt dan haarcellen (figuur 2, onderste paneel). Adenovirus infecteert 25-50% van de ondersteunende cellen in de utricle en geen haar cellen geïnfecteerd (Figuur 2, Ad-GFP panelen). Opgemerkt dat de optimale werking titer van elk adenovirus dient empirisch te worden bepaald, aangezien haar celdood mogelijk indien de virale titer te hoog is. Bovendien zal gebieden van mechanische schade (veroorzaakt bij de ontleding) nemen van grote hoeveelheden virus. Deze regio&#39;s van mechanische beschadigingen zijn gemakkelijk te onderscheiden door een doorlopende lijn van cellen met een zeer hoge niveaus van GFP expressie en ontbrekende haarcellen. Dit in tegenstelling tot de verstrooide GFP expressie in cellen ondersteunen van een onbeschadigd kweek (Figuur 2). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Utricle Dissection. A:. Auditieve bulla (AB) B:. De bulla is gebroken met behulp van twee stevige tang C: Bony slakkenhuis (RW = ronde venster, S =. stapedial slagader, C = slakkenhuis, ST = stijgbeugel) D: Een scalpel (SB) wordt gebruikt af te snijden de top van het slakkenhuis apicaal van de VIIIe hersenzenuw (8 ste N) ASC = voorste halfrond kanaal E..: Het preparaat is stevig vastgehouden met behulp van een # 3 pincet met een vork gestoken in de voorste halfrond kanaal (ASC) en de andere op de buitenste bot (pijlen). Het membraneuze labyrint wordt verwijderd met een pincet F:. Met de membraneuze labyrint verwijderd, de basale beurt aan de benige lamina spiraal zichtbaar is in de buurt van de haak regio. Een fijne sonde wordt daaronder bot plank aan de plank omhoog en (pijl) verwijderen G. Na verwijdering van de sacculus, utricle (U) zichtbaar direct naast de stijgbeugel voetplaat (SF) H:. Utricle (U ) wordt verwijderd met een pincet # 55 (pijl) SF = stapes voetplaat I:.. Utricle met otoconia (O) gedeeltelijk verwijderd eend sensorische epithelium (SE) zichtbaar onder J:. otoconia (O) worden verwijderd uit de utricle met een stroom van media die een injectiespuit voorzien van een 26-gauge naald. De schaduw van de naald (S) is zichtbaar aan de onderzijde van het beeld K. Utricle met otoconia verwijderd en sensorische epithelium (SE) zichtbaar L:. Adenovirale infectie elk utricle (U) in een afzonderlijk en een mini -tray. Ondersteunende cellen worden geïnfecteerd met adenovirus door pipetteren virus in de put (P = Pipet tip). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Adenovirus-gemedieerde infectie van cellen ondersteunen. Utricles geïnfecteerd met adenovirus rij expressie van green fluorescent protein (GFP-Ad). Afgebeeld zijn confocale beelden van het haar cel laag en de ondersteunende cellaag in hetzelfde gebied van een utricle. Haarcellen zijn gelabeld met een antilichaam tegen Myosine 7a(Magenta). Ondersteunende cellen gelabeld met een antilichaam tegen Sox2 (rood). Schematisch is de structuur van de utricle sensorische epitheel en de ligging van de haarcellen (HC) en ondersteunende cellen (SC). Locaties van confocale (optische) secties in het bovenste (U) en onderste (L) panelen zijn aangegeven met streeplijnen in het schema. Bovenste panelen: In confocale beelden die op het niveau van het haar celkernen, Ad-GFP signaal verschijnt in de ruimten tussen haarcellen en niet overlappen met de haarcel marker Myosine 7a. Onderpanelen: In confocale delen op het niveau van de ondersteunende celkernen, Ad-GFP signaal colocalizes de ondersteunende celmerker Sox-2. Ad-GFP infectie resulteert in een GFP-expressie in de ondersteuning van cellen alleen, en geen haar cellen worden geïnfecteerd. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="Figuur 3"/> Figuur 3. Adenovirale infectie niet leiden tot de dood van haarcellen of ondersteunen cellen. Utricles werden geïnfecteerd met Ad-GFP in 4 x 10 8 pfu / ml. Utricles werden gemerkt met antilichamen tegen Myosine 7a (haarcel marker) en Sox2 (ondersteunende cel marker). Haarcel en het ondersteunen van cel-tellingen gelijk waren voor controle utricles en Ad-GFP geïnfecteerd utricles.

<ol><li>Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+utricle+as+an+in+vitro+preparation+for+studies+of+ototoxic-drug-induced+sensory+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death.</a> Brain Res. , (2006).</li>
<li>Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+hair+cell+death+requires+STAT1+and+is+attenuated+by+epigallocatechin+gallate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate.</a> J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).</li>
<li>Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FDA-approved+drugs+and+bioactives+that+protect+hair+cells+in+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29+lateral+line+and+mouse+%28Mus+musculus%29+utricle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).</li>
<li>Chiu, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+lateral+line+to+screen+for+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).</li>
<li>Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+signaling+in+neomycin-induced+vestibular+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death.</a> Hear Res. , 221-221 (2006).</li>
<li>Matsui, J. I., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+hair+cell+death+and+regeneration%3A+two+halves+of+the+same+equation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Otolaryngol.+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation.</a> Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).</li>
<li>Ryals, B. M., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+regeneration+after+acoustic+trauma+in+adult+Coturnix+quail%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail.</a> Science. 240, 1774-176 (1988).</li>
<li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240, 1772-174 (1988).</li>
<li>Shang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+cell+division+is+not+required+for+regeneration+of+auditory+hair+cells+after+ototoxic+injury+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).</li>
<li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).</li>
<li>Lahne, M., Gale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage-induced+activation+of+ERK1%2F2+in+cochlear+supporting+cells+is+a+hair+cell+death-promoting+signal+that+depends+on+extracellular+ATP+and+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium.</a> J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).</li>
<li>Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+Activation+in+Hair+Cells+of+the+Mouse+Utricle+Exposed+to+Neomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin.</a> Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).</li>
<li>Matsui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors+promote+vestibular+hair+cell+survival+and+function+after+aminoglycoside+treatment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).</li>
<li>Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+caspases+prevents+ototoxic+and+ongoing+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death.</a> J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).</li>
<li>Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+inducing+local+inner+ear+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">A novel technique for inducing local inner ear damage.</a> Hear Res. 176, 1-2 (2003).</li>
<li>Forge, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+death+of+hair+cells+in+mammalian+vestibular+sensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia.</a> Hear Res. 139, 1-2 (2000).</li>
<li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors+prevent+cisplatin-induced+apoptosis+of+auditory+sensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells.</a> Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).</li>
<li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hearing+loss+and+cochlear+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death.</a> Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).</li>
<li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hair+cell+death+and+is+necessary+for+the+protective+effect+of+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).</li>
<li>Francis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol+Inhibits+Aminoglycoside-Induced+Ototoxicity+via+Heat+Shock+Protein+32+%28HSP32%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32).</a> Cell Death and Disease. , (2011).</li>
<li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors%2C+but+not+c-Jun+NH2-terminal+kinase+inhibitor+treatment%2C+prevent+cisplatin-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss.</a> Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).</li>
<li>Bird, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+cells+eliminate+dying+sensory+hair+cells+to+maintain+epithelial+integrity+in+the+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear.</a> J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).</li>
<li>Sato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+on+cochlear+macrophages+influences+survival+of+hair+cells+following+ototoxic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Haarcellen zijn gevoelig voor de dood veroorzaakt door een veelheid van spanningen, zoals vergrijzing, lawaai trauma, en blootstelling aan ototoxische geneesmiddelen, met inbegrip van het aminoglycoside-antibiotica en het antineoplastische middel cisplatine. Bij zoogdieren haar celdood leidt tot blijvend gehoorverlies en / of balans verstoring. In vitro model systemen zijn essentiële hulpmiddelen voor studies die gericht zijn op het bepalen van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen a...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3734">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection</a>. There was an error with a figure, the authors middle names were omitted, and the acknowledgements were updated.

Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagens</strong</td&gt;<td<strong&gt; Bedrijf</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalogus nummer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Medium 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fine pincet (# 55)</td&gt;<td&gt; Fine Science Tools</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fine pincet (# 5)</td&gt;<td&gt; Fine Science Tools</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tang (# 3)</td&gt;<td&gt; Fine Science Tools</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicilline G</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Foetaal runderserum</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc mini-tray</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adenovirus-GFP</td&gt;<td&gt; Vector Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cal-Ex ontkalker</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Natriumboorhydride</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 452.882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Myosine 7a (polyklonaal)</td&gt;<td&gt; Proteus Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Myosine 7a (monoklonale)</td&gt;<td&gt; Developmental Studies Hybridoma Bank</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Calmoduline</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Calbindin</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; Southern Biotechnology Associates</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabel 1</strong&gt;. Reagentia en instrumenten die in utricle cultuur en adenovirus infectie.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * Opmerking: Ad-GFP wordt normaliter door Vector Biolabs op een voorraad titer van 1x10<sup&gt; 10</sup&gt; Pfu / ml. Wij gevraagd een aangepaste amplificatie om de voorraad virus voorzien op titer 1,2 x10<sup&gt; 11</sup&gt; Pfu / ml.</p&gt;

dissectie van volwassen muis utricle en adenovirus-gemedieerde ondersteunende-cel infectie

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Gehoorverlies en evenwichtsstoornissen worden vaak veroorzaakt door de dood van mechanosensorische haarcellen, die de receptor cellen van het binnenoor. Omdat er geen cellijn die naar tevredenheid is zoogdier haarcellen, onderzoek naar haarcellen is gebaseerd op primaire orgaan culturen. De beste kenmerk vitro modelsysteem van volwassen zoogdieren haarcellen gebruikt orgaankweken van utricles van volwassen muizen (figuur 1) 1-6. De utricle is een vestibulaire orgaan, en de haarcellen van het utricle zijn vergelijkbaar in zowel structuur als functie om de haarcellen in het gehoororgaan, het orgaan van Corti. De volwassen muis utricle voorbereiding is een volwassen sensorische epitheel voor de studie van de moleculaire signalen die het overleven, homeostase, en de dood van deze cellen te reguleren. Zoogdieren cochleaire haarcellen zijn terminaal gedifferentieerd en niet wordt geregenereerd wanneer ze verloren zijn. In niet-mamMalinese gewervelde dieren, auditieve of vestibulaire haar celdood wordt gevolgd door robuuste regeneratie die gehoor en evenwicht functies 7, 8 herstelt. Hair celregeneratie wordt gemedieerd door glia-achtige ondersteunende cellen, die de basolaterale oppervlak van haarcellen contact op te nemen in de sensorische epitheel 9, 10. Ondersteunende cellen zijn ook belangrijke mediatoren van haar overleving van de cel en de dood 11. We hebben onlangs een methode voor infectie van cellen in cultuur ondersteunen utricles met adenovirus. Met adenovirus type 5 (dE1/E3) een transgen met GFP onder de controle van de CMV promoter leveren wij dat adenovirus specifiek en efficiënt infecteert ondersteunende cellen. Steun cel infectie-efficiëntie ongeveer 25-50% en haarcellen niet geïnfecteerd (figuur 2). Belangrijk vinden we dat adenovirale infectie van ondersteunende cellen niet leidt tot toxiciteit voor haarcellen of ondersteunende cellen, zoals cellen in Ad-GFP infected utricles gelijkwaardig zijn aan die in niet-geïnfecteerde utricles (figuur 3). Zo adenovirus-gemedieerde genexpressie in de ondersteuning van cellen van gekweekte utricles biedt een krachtig instrument om de rol van ondersteunende cellen als mediatoren van haar overleving van de cel, de dood en regeneratie te bestuderen.

Mechanosensorische haarcellen zijn de receptor cellen van het binnenoor. De meest kenmerk<em&gt; In vitro</em&gt; Modelsysteem van volwassen zoogdier haarcellen maakt gebruik van orgaan culturen van utricles van volwassen muizen. We presenteren de dissectie van de volwassen muis utricle, en tonen we aan adenovirus-gemedieerde infectie van ondersteunende cellen in gekweekte utricles.

Dissectie van volwassen muis Utricle en Adenovirus-gemedieerde Ondersteunende-cel infectie

Gehoorverlies en balansstoornissen worden vaak veroorzaakt door de dood van mechanosensorische haarcellen, welke de receptorencellen van het binnenoor zijn. Aangezien er...

Deze presentatie is een demonstratie van de procedures voor hele-orgaankweken van het utriculus van volwassen muizen. Het gebruik van adenovirus om steuncellen van de gekweekte utriculus te infecteren zal ook worden gedemonstreerd. Dit wordt bereikt door eerst de utriculus zorgvuldig uit het binnenoor te dissekeren.De tweede stap is het verwijderen van het dakepitheel. Vervolgens worden de otoconia verwijderd, waarbij het sensorisch epitheel intact blijft. De laatste stap is het infecteren van de ondersteunende cellen van het utriculus met behulp van een adenovirus.Deze technieken kunnen worden gebruikt in een breed scala aan experimenten die zijn ontworpen om rijpe haarcellen en ondersteunende cellen van zoogdieren te bestuderen. In vitro. De sensorische receptorcellen in het binnenoor worden haarcellen genoemd, en deze cellen zijn verantwoordelijk voor het omzetten van geluidsenergie of hoofdbewegingen in neurale input voor de hersenen.Gehoorverlies wordt vaak veroorzaakt door de afsterving van deze sensorische haarcellen. Om de mechanismen ten grondslag aan de dood van sensorische haarcellen te bestuderen, is het zeer nuttig om over een in vitro modelsysteem te beschikken. De methode die wij zullen demonstreren, maakt gebruik van volledige organculturen van het utriculus van volwassen muizen.Het utriculus is een vestibulair orgaan in het binnenoor, en de haarcellen van het utriculus zijn vergelijkbaar met de haarcellen in het gehoororgaan, dat het corti-orgaan wordt genoemd. De utriculus-preparatie is het best gekarakteriseerde modelsysteem voor studies naar haarcellen en ondersteunende cellen van volwassen zoogdieren. Daarnaast zullen we een methode demonstreren die ons laboratorium onlangs heeft ontwikkeld om adenovirus te gebruiken voor het infecteren van de ondersteunende cellen van het utriculus.De adenovirus-techniek stelt ons in staat om de rollen van ondersteunende cellen te onderzoeken als mediatoren van de overleving, dood en regeneratie van haarcellen. We gebruiken deze technieken in ons laboratorium om twee belangrijke vragen te beantwoorden. Ten eerste: wat zijn de cellulaire en moleculaire signalen die bepalen of een haarcel onder stress uiteindelijk overleeft of sterft?En ten tweede, hoe kunnen we deze informatie gebruiken om therapieën te ontwikkelen, klinische therapieën om gehoorverlies te voorkomen of om te keren? Lindsey Maye, een bioloog in mijn laboratorium, zal deze technieken demonstreren. Een visuele demonstratie van de dissectie van het utriculus is belangrijk omdat het weefsel klein en fragiel is, en zeer gevoelig is voor mechanische beschadiging, vooral tijdens de stappen van het verwijderen van de otoconieën en het dakepitheel.Na het euthanaseren en onthoofden van een volwassen muis in overeenstemming met een door de instelling goedgekeurd protocol voor dierverzorging en -gebruik, wordt de schedel in tweeën gesplitst van caudaal naar rosters en wordt de hersenmassa uit beide helften verwijderd om het benig labyrint bloot te leggen. Trim vervolgens de schedel rondom de benige slakkenhuis en breng het benig labyrint over naar een weefselkweekschaal van 35 millimeter met steriel medium, 1 99. Indien de bulla tympanica nog intact is, gebruik dan twee stevige pincetten om de bulla te breken.Neem de tijd om de anatomische referentiepunten van de botpreparaat te identificeren, waaronder de apex basis, de acclus, de ovale en ronde vensters, de wortel van de achtste hersenzenuw en de halvcirkelvormige kanalen zoals te zien op deze afbeeldingen, die zijn overgenomen uit het geschreven protocol. Orienteer het preparaat in de schaal zodanig dat de gehoorbeentjes zich onderin de schaal bevinden en de wortel van de achtste hersenzenuw naar boven is gericht. Gebruik een pincet om het preparaat in de regio van de halvcirkelvormige kanalen vast te houden en snijd met een scalpel met een blad nummer 11 de apex van de cochlea af, net apicaal van de zenuwwortel. Gebruik het voorste halvcirkelvormige kanaal als handgreep om het preparaat te stabiliseren en roteer het preparaat zodat het afgesneden gedeelte naar boven is gericht.Verwijder nu met een pincet nummer vijf de cochlea vanaf de modiolus tot aan de basis. Gebruik vervolgens een fijne sonde, gemaakt van een halve set pincetten nummer 55, om de laatste benige plaat van de osseuze spiraallamina op te tillen. Om de S te onthullen; onder de S bevindt zich de voetplaat van de stapes.Deze afbeelding toont de voetplaat van de stapes, aangeduid met sf, wat een belangrijk oriëntatiepunt is om de positie van het utriculus, aangeduid met U, te identificeren; deze ligt direct naast de voetplaat van de stapes. Gebruik de fijne probe om voldoende bot weg te chippen om ongeveer een derde van het utriculus bloot te leggen. Gebruik vervolgens een pincet nr. 55 om het utriculus voorzichtig te verwijderen door het vlakbij de rand of bij de zenuwwortel vast te pakken.Indien het gepigmenteerde dakepitheel nog aan het utriculus vastzit, verwijder dit dan met een fijne pincet. Als utriculi worden gebruikt voor adenoviruseinfectie, is de verwijdering van de otoconia noodzakelijk om dit te kunnen doen. Vul een spuit met dissectiemedium en voorzie deze van een naald met een gauge van 26 of 28.Houd de utriculus aan de rand vast met een pincet nr. 55 en verwijder de otoconiëen met een stroom medium. Alternatief kunnen de otoconiëen worden verwijderd met een wimperharing. Zodra alle utriculi zijn gedissekeerd, vervangt u het dissectiemedium door steriel kweekmedium en plaatst u de plaat in een incubator bij 37 °C met 5% carbon dioxide.Alle procedures met adenovirus worden uitgevoerd volgens de voorzorgsmaatregelen voor biosafety level 2. Gebruik, wanneer u klaar bent voor infectie, een microcurette om utriculus-haarcellen over te brengen naar één putje van een mini-tray die 15 µL serumvrij D-M-E-M-F 12 bevat. Voeg 1 tot 4 × 10⁷ plaque-vormende eenheden adenovirus toe aan het putje met de utriculuscultuur.De u-trickles en het virusbevattende medium worden gedurende twee uur bij 37 °C met 5% koolstofdioxide in een bevochtigde kamer geïncubeerd. Na twee uur worden de u-trickles overgebracht naar een 24-wells weefselkweekplaat met kweekmedium met serum. Na overdracht worden de u-trickles opnieuw gedurende één nacht gekweekt bij 37 °C met 5% koolstofdioxide.Utriculi kunnen de volgende dag worden gebruikt voor live imaging-experimenten, of ze kunnen worden gefixeerd voor immunochemie. Utriculi worden gefixeerd in 4% paraformaldehyde op een schudplateau gedurende drie uur bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius. Was daarna de utriculus drie keer gedurende 15 minuten in 0,1 molair Sorensens fosfaatbuffer.Indien de otoconia niet waren verwijderd voor de adenovirusinfectie, verwijder deze dan op dit punt door het utriculus één tot twee minuten onder te dompelen in calx decalcify, gevolgd door wassen met 0,1 M Sorensen-fosfaatbuffer. Dompel het utriculus vervolgens drie uur lang in blokkeringsoplossing bij kamertemperatuur. Verdun na de blokkeringsstap het primaire antilichaam in blokkeringsoplossing. Voeg dit toe aan de plaat met de utriculi en incubeer dit gedurende de nacht bij 4 °C.Was de volgende dag de utriculi en sacculi met fosfaatbuffer. Voeg vervolgens het secundaire antilichaam toe, verdund in blokkeringsoplossing, en incubeer dit gedurende vier uur op kamertemperatuur op een schudplatform, terwijl het product tegen licht wordt beschermd. Monteer tot slot de utriculus op glasplaatjes met behulp van FluorMount-G. Deze confocale beelden tonen de haarcellaag en de ondersteunende cellaag in hetzelfde gebied van één utriculus die is geïnfecteerd met adenovirus dat de expressie van groen fluorescent proteïne stimuleert.Haarcellen zijn gelabeld met een antilichaam tegen myosin seven A, wat magenta verschijnt. Ondersteunende cellen zijn gelabeld met een antilichaam tegen socks, two, wat hier rood verschijnt. Er is te zien dat adenovirus GFP lokaliseert in ondersteunende cellen en niet in haarcellen.Deze grafiek demonstreert dat adenovirale infectie met adenovirus GFP bij vier maal 10⁸ plaque-vormende eenheden per milliliter niet leidt tot de dood van haarcellen of ondersteunende cellen. Zodra de dissectie onder de knie is, kunnen beide cochlea's van één dier binnen 10 tot 15 minuten in cultuur worden gebracht.Het is echter belangrijk om tijdens het ontwikkelen van deze procedure te onthouden dat u de tijd neemt en voorzichtig bent bij het hanteren van het weefsel na deze procedure. Andere methoden zoals live confocale beeldvorming, immunohistochemie, R-T-P-C-R en Western blotting kunnen worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden over de dood, overleving en regeneratie van ondersteunende cellen en haarcellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het utriculus moet dissekeren en ondersteunende cellen moet infecteren met adenovirus.Houd er rekening mee dat werken met virussen gevaarlijk kan zijn en dat altijd biosafety level 2-voorzorgsmaatregelen moeten worden getroffen bij het uitvoeren van deze procedures.

dissection-adult-mouse-utricle-adenovirus-mediated-supporting-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video gebruiken we een adenovirus het dragen van de Cre-recombinase-gen tot de primaire muis embryonale fibroblasten het dragen van een floxed Rac1 allel infecteren.

Adenovirus-gemedieerde Genetische Verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten

Werkwijze voor het traceren van synaptisch verbonden neuronen beschreven. We maken gebruik van TVA specificiteit van een upstream cel te peilen of een cel populatie van belang synaptische input van genetische gedefinieerde celtypes ontvangt.

Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

De beschreven postauriculaire chirurgische benadering maakt een snelle en directe toediening mogelijk in de scala tympani van de muizencochlea, terwijl bloedverlies en sterfte bij dieren wordt geminimaliseerd. Deze methode kan worden gebruikt voor cochleaire therapie met behulp van moleculaire, farmacologische en virale toediening aan postnatale muizen via het ronde venmembraan.

Chirurgische methode voor viraal gemedieerde Gene Levering aan de Mouse Inner Ear door het ronde venster membraan

We presenteren een methode om de volwassen orgaan van Corti isoleren drie intacte cochleaire windingen (apex, midden en base). We tonen ook een procedure voor immunokleuring met fluorescent gelabelde antilichamen. Samen technieken maken het bestuderen van haarcellen, steuncellen en andere celtypen in de cochlea.

Hele Mount Dissection en Immunofluorescentie van de Adult Mouse Cochlea

In dit verslag zijn de voordelen van organotypic culturen en gedissocieerde primaire culturen van muis-afgeleide dorsal root ganglia gemarkeerd om te onderzoeken van een breed scala van mechanismen die zijn gekoppeld aan neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, neuroinflammation, en reactie op virale infectie.

Volwassen muis DRG Explant en losgekoppeld van cel modellen om te onderzoeken Neuroplasticiteit en reacties op milieu beledigingen, met inbegrip van de virale infectie

Hier beschrijven we canalostomy procedure waarmee lokale drug levering tot de inner oren van volwassen en neonatale muizen door het semicircular kanaal met minimale schade aan gehoorbescherming en vestibulaire functie. Deze methode kan worden gebruikt om te enten virale vectoren, farmaceutische producten en kleine moleculen in het binnenoor muis.

Canalostomy als een chirurgische benadering van lokale Drug Delivery tot de Inner oren van volwassen en neonatale muizen

Driedimensionale organotypic culturen van de lymfkliertest utricle en het slakkenhuis in optisch duidelijk collageen ik gels behouden aangeboren weefsel morfologie, toestaan voor mechanische stimulatie via aanpassing van matrix stijfheid en virus-gemedieerde gene levering toestaan.

Driedimensionale Organotypic culturen van vestibulaire en auditieve zintuigen

Dit protocol beschrijft het proces van het genereren en karakteriseren van muis urotheliale organoïden die deleties in genen van belang herbergen. De methoden omvatten het oogsten van muizenurotheelcellen, ex vivo transductie met adenovirus dat Cre-expressie drijft met een CMV-promotor, en zowel in vitro als in vivo karakterisering.

Ex Vivo Organoïde model van Adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizen urotheelcellen

Er worden methoden beschreven voor het genereren van grote hoeveelheden recombinante adenovirussen, die vervolgens kunnen worden gebruikt om het inheemse knaagdier urotheel te transduceren, waardoor expressie van transgenen of downregulatie van endogene genproducten mogelijk is.

Expressie van transgenen in native blaasurotheel met behulp van adenovirus-gemedieerde transductie

De stria vascularis is van vitaal belang voor het genereren van endocochleair potentieel. Hier presenteren we de dissectie van de volwassen muis stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining.

Dissectie van volwassen muis Stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining

Leer de dissectie van volwassen muis utricle en adenovirus-gemedieerde infectie van ondersteunende cellen. Deze methode biedt een waardevol model voor het bestuderen van haarcelregeneratie en overleving in het binnenoor.

Dissectie van volwassen muis Utricle en Adenovirus-gemedieerde Ondersteunende-cel infectie

Meer video's verkennen