Name: Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Leer hoe u geïnduceerde regulatoire T-cellen genereert uit primaire menselijke naïeve en geheugen T-cellen. Deze methode maakt vergelijking van Tregs met andere subsets binnen één donor mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<p class="jove_content"&gt; De auteurs willen Jennifer Strange en Greg Bauman bedanken voor hun hulp bij flowcytometrie-analyse en sortering. Dit werk werd ondersteund door de NIH Grant Aantal 2P20 RR020171 van de NCRR en door de Universiteit van Kentucky het opstarten van fondsen om FM; GIE erkent de steun van de presidentiële Graduate Fellowship en de Kentucky Opportunity Fellowship.</p

1. Isolatie van de humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC&#39;s) van Buffy Coat <ol><li> Verwerven van een eenheid van buffycoat uit het ziekenhuis of in de omgeving bloed locatie in het centrum. Ons bloed centrum voorziet ons van ongeveer 40-60 ml buffycoat per eenheid verkregen van normaal bloed donoren. </li><li> Giet het bloed in een autoclaaf 500 ml glazen fles met steriel PBS tot buffycoat verdunnen. Het eindvolume van PBS + buffy coat moet 250 ml. </li><li> Vul tien 50 ml conische buizen met elk 20 ml Lymphoprep oplossing. </li><li> Voorzichtig bedekken de Lymphoprep oplossing met 25 ml van het verdunde buffy coat, zorg dat u de Lymphoprep oplossing verstoren. </li><li> Spin buizen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur bij 500 x g. Zorg ervoor dat het uitschakelen van de centrifuge van de rem, om zo niet de lymfocyt fractie verstoren. </li><li> Verzamelen van de PBMC aan het grensvlak tussen de Lymphoprep en het plasma-medium lagen met een pipet. Zuig de plasma-medium uit tot ongeveer 1 mlnog steeds betrekking op de buffy coat laag met de PBMC&#39;s. Gebruik een 10 ml pipet op PBMC&#39;s over te dragen aan een nieuwe 50 ml buis. </li><li> Tweemaal wassen cellen met PBS en vervolgens cellen te resuspenderen in 50 ml koud RPMI voor het tellen van een hemocytometer. Typische herstel is 8 x 10 8 - 1 x 10 9 PBMC&#39;s. </li></ol> Deze procedure kan worden verlaagd voor kleinere hoeveelheden bloed. Verdunning van bloed monsters 1:01 in PBS. 2. Magnetische negatieve selectie van Total CD4 + T-cellen, CD4 + CD45RA + naïeve T-cellen of CD4 + CD45RO + geheugen T-cellen uit PBMC met EasySep Enrichment Kits (Stem Cell Technologies) Te volgen stappen voor 1 x 10 8 tot 4,25 x 10 8 PBMC&#39;s. <ol><li> Hersuspenderen PBMC tot een uiteindelijke concentratie van 5 x 10 7 per ml in PBS dat 2% FBS en 1 mM EDTA. Verplaats cellen om een ​​verse 14 ml polypropyleen ronde bodem buis. <ol class = &quot;lalpha&quot;&gt; <li> Isolatie van totaal humaan CD4 + T-cellen door negatieve selectie: voeg menselijke CD4 + T-cellen Enrichment cocktail van antilichamen (50 pL per ml PBMCs) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Isolatie van menselijke naïeve T-cellen door negatieve selectie: voeg 50 ul van anti-CD45RO antilichaam per ml celsuspensie PBMC, mengen en incuberen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg verrijking cocktail die bij de kit (50 pL per ml PBMCs), mengen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Isolatie van het menselijk geheugen T-cellen door negatieve selectie: voeg het menselijk geheugen CD4 + T Cell Verrijking Cocktail van antilichamen (50 ul per ml van PBMC&#39;s), meng en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Meng magnetische deeltjes in gelijke mate te verspreiden in de hele oplossing. Niet vortex nanodeeltjes uit naïef kit. </li><li> Voeg de magnetische deeltjes (100 pl per ml van PBMC&#39;s voor de totale CD4 + en naïeve T-cel selectie, 50 ul per ml van PBMC&#39;s voor het geheugen T-cel-selectie). Meng door voorzichtig pipetteren 2-3 en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten naïve T-cel selectie of 5 minuten geheugen of totale CD4 + T-cel selectie. </li><li> Voeg PBS dat 2% FBS en 1 mM EDTA het volume met tot 10 ml per buis. Meng door zachtjes te pipetteren 2-3 keer voor het plaatsen van niet-afgetopte buis in zilver EasySep magneet voor 5, 10 of 2,5 minuut voor het totale CD4 + T-cellen, naïef en geheugen subsets, respectievelijk. </li><li> Met buis nog in EasySep magneet, giet vloeistof in nieuwe 50 ml buis naar de cellen van belang te isoleren. </li><li> Herhaal de stappen 2.5 en 2.6 voor beter herstel. </li></ol> 3. Cultuur van de Cel Te regulatoire T-cellen induceren <ol><li> De dag voor stap 1 en 2, laag weefselkweekplaten door eerst verdunnen anti-CD3-antilichaam (OKT3 kloon) tot een concentratie van 1 ug / ml in steriele PBS. Voor een 6 wells plaat 2 ml PBS + anti-CD3 per putje toe te voegen, voor een 12 wells plaat voeg 1 ml of voor een 24 wells plaat voeg 500 ul per putje. Houd de gecoate plaat staan ​​bij 4 ° C tot gebruik. </li><li> Bereid polarisatie medium door toevoeging van 10% hitte-geïnactiveerd foetaal koeienserum (FBS), 100 U / mL penicilline, 100 pg / ml streptomycine en 50 uM β-mercapto-ethanol met RPMI-1640 vooraf aangevuld met 2,06 mM Glutamax I-en 25 mM HEPES buffer. Vervolgens voegt 2 ng / ml TGF-β en 5 ng / ml IL-2. Hier kan een toe te voegen liganden of remmers van belang zijn voor de media. Resuspenderen cellen uit stap 2 in een concentratie van 2 x 10 6 cellen / ml polarisatie medium. </li><li> Voorverwarmen platen bij 37 ° C en zuig de PBS van anti-CD3-beklede putjes voor het toevoegen cellen. Voeg 4 mL per putje celsuspensie voor een 6 wei-plaat, 2 ml cellen voor een 12 wei-plaat of 1 ml cellen voor een 24 wei-plaat. Vul lege putten met PBS om verdamping te verminderen vanmedia. Incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Op dag 3 na plating, draaien beneden plaat in een centrifuge gedurende 5 minuten bij 500 x g. Zonder te storen T-cellen aan de onderkant van de plaat, verwijdert u de helft van de media en te vervangen door vers medium. Anderzijds, als het goed wordt overvol met cellen (concentratie van meer dan 3 x 10 6 / ml), splitsen van het volume even in een andere anti-CD3 gecoate plaat en opnieuw toevoegen verse media tot oorspronkelijke volume. Incubeer twee tot drie dagen bij 37 ° C / 5% CO2. </li></ol> 4. Fluorescentie-Activated Cell Sorting (FACS) van de drie populaties van T-cellen <ol><li> Bereid FACS wasbuffer door toevoeging van 0,5% (w / v) bovine serum albumine (BSA) en 2 mM EDTA steriele PBS. Plaats buffer bij 4 ° C te koud. </li><li> Goed te verwijderen cellen van celkweek en spoel elke well met 2 ml PBS om volledige cel herstel te verzekeren. Plaats alle cellen in 50 ml polypropyleen buizen en centrifugeer op 500 xg gedurende 10minuten bij 4 ° C. </li><li> Tel de cellen op een hemocytometer de cel dichtheid bepalen. </li><li> Plaats 3-5 x 10 5 cellen per buis in vier afzonderlijke 5 ml ronde bodem polystyreen buizen voor vergoeding controles. Plaats resterende cellen in 50 ml polypropyleenbuizen niet meer dan 35 x 10 6 cellen per buis. </li><li> Spin down cellen gedurende 5 minuten bij 4 ° C en zuig media. Resuspenderen cellen worden gesorteerd in 90 pi koude wasbuffer per 1 x 10 6 cellen. Resuspenderen in 100 ul van koud wassen de buffer van de compensatieregeling, buizen. </li><li> Om de cellen te sorteren, combineren 2 pi anti-CD25-PE, 3 pi anti-CD45RA-PE-Cy5 en 1 pi anti-CD127 APC per 1 x 10 6 cellen. Voeg geen antilichaam tegen de eerste compensatieregelaar buis, 2 pi anti-CD25-PE de tweede buis 3 pi anti-CD45RA - PE-Cy5 de derde buis en1 pi anti-CD127 APC de vierde buis. Incubeer alle buizen op ijs gedurende 45 minuten in het donker. </li><li&gt; Voeg 10 ml koud wassen buffer om de cellen te worden gesorteerd en 1 mL van de compensatieregeling, buizen. Centrifugeer alle cellen bij 500 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Zuig buffer en hersuspenderen cellen in een concentratie van 1 x 10 7 cellen per ml wasbuffer. Voeg 1,5 ul van DNase II per ml van de cellen voor het filteren door middel van een 40 uM nylon cel zeef. Verplaatsen cellen meervoudige 5 ml met ronde bodem polypropyleenbuizen met niet meer dan 3,5 ml per buis. Resuspendeer compensatieregeling, cellen in 300 ul van wassen buffer. </li><li> Stel schadevergoeding MoFlo flowcytometer cross detectie te minimaliseren door de PE, APC en PE-Cy5 filters. Stel poorten naar iTregs (CD25 Hi CD127 -/LOW CD45RA - cellen) te sorteren, naïef (CD25-CD45RA +) en geheugen (CD25 - CD45RA -) T-cellen in 5 ml ronde bodem polystyreen buizen met een serum van pasgeboren kalf. </li></ol> 5. Onderdrukking Assay <ol><li> Maak suppression assay media door toevoeging van 100 U / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 5 ng / ml IL-2 en 2 ng / ml TGF-β AIM-V. </li><li> De dag van de test, te zuiveren heterologe CD4 + T-cellen van de buffy coat, zoals aangegeven in stap 1 en 2. Dit zijn de doelwitcellen de onderdrukking assay en bevat geen CD25 + cellen Treg, zoals te zien in figuur 2 dag 0. </li><li> Label cellen CellTrace kit volgens fabrikant, behalve dat slechts 1 pi van 5 mM voorraadoplossing per ml cellen in plaats van 2 pl. Houden uit direct zonlicht, voeg 18 ul van de DMSO door de CellTrace kit tot een flacon van CFSE om een ​​5 mM stockoplossing te maken. Resuspenderen het vereiste aantal doelcellen (maximaal 1 x 10 7) in voorverwarmde PBS + 0,1% (w / v) BSA tot een eindconcentratie van 1 x 10 6 cellen / ml. Voeg 1 ul van 5 mM CFSE per ml cellen en incuberen op 37 ° C waterbad gedurende 5 minutes. Voeg 5 volumes van volledige, ijskoude RPMI met 10% FBS tegen vlekken te lessen en op ijs incubeer gedurende 5 minuten. Was de cellen twee keer met koud volledige RPMI en resuspendeer 1 x 10 5 cellen per 100 ui van onderdrukking test media. </li><li> Treg onderdrukking inspecteur kralen op een voorraad concentratie van 2 x 10 7 kralen / ml. Pellet een aantal korrels gelijk aan het totale aantal cellen per experiment snel centrifugeren in een Eppendorf buis. Ze wast kralen met RPMI en re-pellet. Na aspiratie van RPMI, Resuspendeer kralen, zodat de juiste hoeveelheid korrels per goed zijn in 8 ul van onderdrukking test media. </li><li> Om een 96 ronde bodem weefselkweek plaat toe CFSE-gekleurde cellen (1 x 10 5 cellen / ml) inspecteur kralen en gepolariseerd gesorteerde cellen (1 x 10 5 cellen / ml) in vers onderdrukking assay media voor een gewenst doel (CFSE gekleurd): effector (gesorteerd) verhouding in een eindvolume van 200 ul. Alle voorwaarden zijn vastgelegd in tripliCates. </li><li> Bereid de eerste van twee controle condities door het toevoegen van 100 pi van CFSE gekleurde cellen, 8 ul van inspecteur kralen en 1 x 10 5 van verse, ongekleurde cellen in 92 microliter suppressor voedingsbodem per well. Bereid de tweede controle met dezelfde cellulaire componenten als hierboven, maar zonder Treg inspecteur kralen. </li><li> Afdekplaat aluminiumfolie en incuberen bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende vijf dagen. </li><li> In het donker verzamelen cellen uit elk putje van pipetteren en in een 5 ml met ronde bodem polystyreenbuis. Centrifugeer cellen bij 500 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C, aspiraat media en hersuspenderen in 300 ul koud FACS wasbuffer vanaf stap 4. Analyseer de eerste 3 x 10 4 CFSE + gebeurtenissen uit de live-lymfocyt gate die doelcellen in een histogram met Cell Quest software. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Voorbeeld van een flowcytometrische pseudocolor dot plots over een termijn van vijf dagen-course controle iTreg differentiatie van de relatieve co-expressie van CD25 met Foxp3 kan CTLA-4 CD45RA te zien in Figuur 2. Het histogram in figuur 3 met succes onderdrukking assay waarin gesorteerde iTregs (CD25 Hi CD45RA - CD127 -/LOW cellen). De subset van vijf dagen cultuur heeft verkregen regulerende / suppressor vermogen Figuur 4 toont de inductie van Tregs van een naïeve T-cel pool (boven panelen) en een geheugen T-cel pool (onderste panelen), na vijf dagen cultuur in de standaard iTreg medium. CFSE kleuring van de eerste cellen aan te tonen dat ofwel naïef (rechtsboven paneel) of memory T-cellen (rechts onder panel) naar iTregs (hoogste Foxp3 expressie cellen) te onderscheiden pas na enkele rondes van celdeling. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische experimentele procedure. PBMC are afgescheiden van de menselijke perifeer bloed via gradiënt centrifugatie voor magnetische negatieve selectie van CD4 + CD25 - T-cellen. Na vijf tot zes dagen in cultuur, cellen ondergaan FACS en zijn co-geïncubeerd met heterologe CFSE gelabelde doelcellen aan suppressor activiteit te meten. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig2.jpg" /> Figuur 2 Gezuiverd humane primaire CD4 + CD25 -. T cellen worden gekweekt in medium iTreg. Een deel van cellen verzameld net na isolatie (dag 0) en 1, 3 en 5 van celkweek de voortgang van CD45RA, Foxp3, CTLA-4 en CD25 markeringen houden. De iTreg profiel komt overeen met CD45RA -, Foxp3 Hi, CTLA-4 Hi en CD25 Hi (gemarkeerd in de in-grafiek venster). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig3.jpg" /> Figuur 3. Gezuiverde CD4 + CFSE labeled cellen (1 x 10 5 / putje) zijn gekweekt met Treg onderdrukking inspecteur korrels bij aanwezigheid van gesorteerde naïeve geheugen of iTreg cellen (3 x 10 4 / putje). Na vijf dagen worden de cellen geoogst en de CFSE profiel van de gekleurde cellen geanalyseerd door flowcytometrie. De aanwezigheid van iTreg cellen heft volledig de proliferatie van CD4 + T-cellen. Aantallen zijn een indicatie van het percentage van CFSE-gelabelde cellen die hebben ondergaan divisie. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig4.jpg" /> Figuur 4 Gezuiverd menselijke primaire naïef. (CD4 + CD25 - CD45RA +) en geheugen (CD4 + CD25 - CD45RO +) T-cellen worden gekleurd met CFSE en gekweekt in iTreg medium. Na vijf dagen worden de cellen fenotype en de celdeling tarieven geschat. Zoals aangegeven in fig. 2, iTreg deelverzameling onderscheiden van beide subsets overeen metCD45RA - CD25 Hi Foxp3 Hi en CTLA-4 Hi (laatste twee niet getoond). Vergelijkende CFSE kleuring profielen te identificeren iTregs (hier als de hoogste uitdrukking Foxp3 T-cellen) als de meest proliferatieve cellen tijdens de vijf-daagse cultuur.

<ol><li>Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+interactions+between+CD45RBhigh+and+CD45RBlow+CD4%2B+T+cells+are+important+for+the+balance+between+protective+and+pathogenic+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).</li>
<li>Tarbell, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell-expanded%2C+islet-specific+CD4%2B+CD25%2B+CD62L%2B+regulatory+T+cells+restore+normoglycemia+in+diabetic+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).</li>
<li>Morgan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+treatment+of+collagen-induced+arthritis+by+adoptive+transfer+of+CD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells.</a> Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).</li>
<li>Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+infusion+of+ex+vivo+activated+and+expanded+CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29+immune+regulatory+cells+inhibits+graft-versus-host+disease+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality.</a> Blood. 99, 3493-3493 (2002).</li>
<li>Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP3%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">FOXP3: of mice and men.</a> Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).</li>
<li>Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T+regulatory+cell+therapy%3A+take+a+billion+or+so+and+call+me+in+the+morning%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning.</a> Immunity. 30, 656-6565 (2009).</li>
<li>Morgan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+FOXP3+mRNA+is+not+confined+to+CD4%2BCD25%2B+T+regulatory+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans.</a> Human Immunology. 66, 13-20 (2005).</li>
<li>Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+Generation+and+Enhanced+Suppression+of+Human+CD4%2BCD25%2B+Regulatory+T+Cells+by+Retinoic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid.</a> Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).</li>
<li>McHugh, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29+immunoregulatory+T+cells%3A+gene+expression+analysis+reveals+a+functional+role+for+the+glucocorticoid-induced+TNF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor.</a> Immunity. 16, 311-323 (2002).</li>
<li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+Self-Tolerance+Maintained+by+Cd25%2BCd4%2BRegulatory+T+Cells+Constitutively+Expressing+Cytotoxic+T+Lymphocyte-Associated+Antigen+4%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).</li>
<li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD127+expression+inversely+correlates+with+FoxP3+and+suppressive+function+of+human+CD4%2B+T+reg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).</li>
<li>Schraven, B., Kalinke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+superagonists%3A+what+makes+the+difference+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD28 superagonists: what makes the difference in humans.</a> Immunity. 28, 591-595 (2008).</li>
<li>Reneer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripherally+induced+human+Regulatory+T+cells+uncouple+Kv1.3+activation+from+TCR-associated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling.</a> European Journal of Immunology. , (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Terwijl Treg overdracht bezit enorme therapeutische belofte bij de bestrijding van auto-immuniteit afstoting van het transplantaat en andere immuun-of inflammatoire-gemedieerde aandoeningen, methoden voor hun efficiënte generatie en stabiele onderhoud zijn nog niet ontwikkeld. Aangezien slechts 1-5% van de circulerende humane T-cellen zijn Tregs, hun gecontroleerde expansie en differentiatie lost dit gebrek als een belangrijke afschrikkende werking van de uitvoering van Tregs in de kliniek. Aan de andere kant, zoals we ...

<table border="1"><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> Axis-Shield </td><td> 1114547 </td><td> Bewaren bij kamertemperatuur </td></tr><tr><td> Gekoelde tafelcentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td><td></td></tr><tr><td> Bright-Line hemocytometer </td><td> Hausser Wetenschappelijk </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Human CD4 + T Cell Verrijking Kit </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19052 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Human Memory CD4 + T Cell Verrijking Kit </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19157 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Human naïeve CD4 + T Cell Verrijking Kit </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19155 </td><td></td></tr><tr><td> De Big Easy EasySep Magnetto </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 18001 </td><td> Zilver </td></tr><tr><td> 5 ml ronde bodem polystyreen buizen </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml polypropyleen centrifugebuizen </td><td> VWR </td><td> 89004-368 </td><td></td></tr><tr><td> 14 ml polypropyleen Round-benedenbuis </td><td> BD Falcon </td><td> 352059 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml polypropyleen centrifugebuizen </td><td> VWR </td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr><td> Menselijk anti-CD3 antilichaam </td><td> Bio X Cell </td><td> BE0001-2 </td><td> Kloon: OKT3 </td></tr><tr><td> 24 Nou Cell Polystyreen Cultuur Plate </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 96 Nou Ronde bodem Tissue Culture Plate </td><td> Grenier Bio-One </td><td> 650180 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 met Glutamax I-Hepes buffer </td><td> Gibco </td><td> 72400 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Foetaal runderserum (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercapto </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> Recombinant Human TGF-β1 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8348-62 </td><td></td></tr><tr><td> Recombinant Human IL-2 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8029-63 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumine (BSA) </td><td> MP Biomedicals Inc </td><td> 810531 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Amresco </td><td> E177 </td><td></td></tr><tr><td> Muis anti-humaan CD25-PE </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-024 </td><td> Kloon: 4E3 </td></tr><tr><td> Muis anti-humaan CD45RA-PE-Cy5 </td><td> eBioscience </td><td> 15-0458-42 </td><td> Kloon: HI100 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD127-APC </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-094-890 </td><td> Kloon: MB15-18C9 </td></tr><tr><td> DNase II </td><td> MP Biomedicals Inc </td><td> 190370 </td><td></td></tr><tr><td> MoFlo Flow Cytometer </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FlowJo Software </td><td> Tree Star, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cell Quest Pro Software </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Serum van pasgeboren kalveren </td><td> Gibco </td><td> 16010 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> AIM-V </td><td> Gibco </td><td> 0870112 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrace CFSE celproliferatie Kit </td><td> Invitrogen </td><td> C34554 </td><td></td></tr><tr><td> Treg onderdrukken Inspector Beads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-909 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 40 uM Nylon cellijnER </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr></table>

genereren van induced regulatoire t-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen t-cellen

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

De ontwikkeling en het onderhoud van immunosuppressieve CD4 + regulatoire T-cellen (Tregs) dragen bij tot de perifere tolerantie die nodig is om in de immunologische homeostase te blijven met de enorme hoeveelheid van het zelf en commensale antigenen in en op het menselijk lichaam. Verstoringen in de balans tussen Tregs en inflammatoire conventionele T-cellen kan leiden tot immunopathologie of kanker. Hoewel de therapeutische injectie van Tregs is aangetoond effectief te zijn in muismodellen van colitis 1, type I diabetes 2, reumatoïde artritis en graft versus host disease, 4 verschillende fundamentele verschillen in de mens versus de muis Treg biologie 5 is tot nu toe uitgesloten klinisch gebruik. Het gebrek aan voldoende, zuiverheid, stabiliteit en homing specificiteit van therapeutische Tregs noodzakelijk een dynamisch platform van de menselijke Treg ontwikkeling waarop de voorwaarden te optimaliseren voor hun ex vivo expansie 6. Hier hebben we D Derenderen een methode voor de differentiatie van de geïnduceerde Tregs (iTregs) van een humaan perifeer bloed donor die kunnen worden onderverdeeld in vier stadia: isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen, magnetische selectie van CD4 + T-cellen, in vitro celkweek en fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) van T-cel subsets. Aangezien de Treg handtekening transcriptiefactor forkhead box P3 (Foxp3) is een activatie geïnduceerde transcriptiefactor bij mensen 7 en andere unieke marker is, een combinatoriële panel van markers worden gebruikt om T-cellen herkennen suppressor activiteit. Na zes dagen kweken kunnen cellen in het systeem wordt begrensd in naïve T-cellen, T-cellen of geheugen iTregs basis van hun relatieve expressie van CD25 en CD45RA. Als het geheugen en de naïeve T-cellen hebben verschillende gemeld polarisatie eisen en plasticities 8, voorsortering van de eerste T-cel populatie in CD45RA + en CD45RO + subsets kunnen be gebruikt om deze verschillen te onderzoeken. In overeenstemming met anderen, onze CD25 Hi CD45RA - iTregs hebben hoge niveaus van Foxp3 9, GITR en CTLA-4 11 en lage niveaus van CD127 12. Na FACS van elke populatie kunnen resulterende cellen worden gebruikt in een suppressor assay de relatieve vermogen om proliferatie van carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) gelabelde autologe T cellen te vertragen evalueert.

Wij beschrijven een werkwijze voor het regulerende, geheugen naïeve T-cellen van een menselijke bloed donoren. Gepolariseerde Tregs kan worden vergeleken met andere subgroepen in verschillende genetische en functionele toepassingen met genetische homogeniteit, zoals onderdrukking assay ook hier beschreven.

Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen

De ontwikkeling en het behoud van immunosuppressieve CD4+ regulatoire T-cellen (Tregs) dragen bij aan de perifere tolerantie die nodig is om te blijven in ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van humane regulatoire T-cellen uit primaire T-cellen. Eerst worden mononucleaire cellen uit perifeer bloed geïsoleerd uit humane bloedmonsters. Vervolgens worden CD4-positieve T-cellen gezuiverd uit het PBMC-mengsel en gekweekt.Na zes dagen worden de cellen met behulp van een flowcytometer gesorteerd in naïeve, geheugen-, effector- en geïnduceerde regulatoire T-celsubsets, waarna suppressor-assays worden uitgevoerd. Gebruik deze cellen om aan te tonen dat deze methode menselijke regulatoire T-cellen met suppressoractiviteit genereert. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van technieken die gebruikmaken van muizencellen, zijn dat onze menselijke methode een grotere fysiologische en klinische relevantie heeft en een vergelijking van Tregs met andere celpopulaties binnen een enkele donor mogelijk maakt.Het elimineren van variabiliteit tussen proefpersonen. Deze methode kan cruciale vragen over het regulatoire celveld beantwoorden, zoals wat de regulatoire gebeurtenissen zijn die de transitie tussen conventionele T-cellen en regulatoire cellen moduleren, of wat de signalerings- en transcriptionele gebeurtenisse

generation-induced-regulatory-t-cells-from-primary-human-nave-memory

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an assay to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived CD8αβ+ T Cells. Tumor antigen-specific iPSCs are grown on a stromal cell monolayer and differentiated into hematopoietic progenitor cells (HPCs). The HPCs are differentiated into CD4+ CD8+ double-positive T cells using a differentiation medium. These cells are then stimulated to generate single-positive T cells expressing CD8.

Generating Single Positive CD8 T Cells from Induced Pluripotent Stem Cells

CD4+ regulatorische T-cellen zijn krachtige immuunmodulatoren en hebben belangrijke functies in immuunhomeostase. Het gebrek aan deze cellen in perifeer bloed maakt functionele studies uitdagend, specifiek in de context van HIV-1-infectie. We beschrijven hier een methode om functionele CD4+ Tregs te isoleren en uit te breiden van perifeer bloed van HIV-1-geïnfecteerde individuen.

Nieuwe tools om regulatoire T-cellen van HIV-1-geïnfecteerde individuen Expand

Adenovirale genoverdracht in naïeve CD4 T-cellen met transgene expressie van de Coxsackie adenovirus receptor kan de moleculaire analyse van regulatoire T...

Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie

Dit artikel beschrijft een methode voor de generatie en proliferatie van humane T-celklonen die specifiek reageren op een gedefinieerd allo-antigen. Dit protocol kan worden aangepast voor het klonen van humane T-cellen die specifiek zijn voor een verscheidenheid aan peptide-MHC-liganden.

Genereren van menselijke allogeen-specifieke T-cellen uit perifeer bloed

Naïve CD4+ T-cellen polariseren naar verschillende subsets, afhankelijk van de omgeving op het moment van activering.  De differentiatie van naïve CD4+ T-cellen naar verschillende effector-subsets kan in vitro worden bereikt door de toevoeging van T-celreceptor-stimuli en specifieke cytokine-signalen.

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Dit protocol beschrijft de reproduceerbare productie en fenotypering van mens veroorzaakte regulerende T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T-cellen in vitro. Verschillende protocollen voor FOXP3 inductie mogelijk maken voor de studie van specifieke iTreg fenotypes verkregen met de respectieve protocollen.

In vitro differentiatie van humane CD4 + FOXP3 + geïnduceerde regulatoire T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T cellen met behulp van een TGF-β-bevattende Protocol

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van functionele tumor antigen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide CD8αβ+ enkele positieve T-cellen met behulp van OP9/dll1-co-cultuur systeem.

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

Hier is een protocol voor de effectieve onderdrukking van replicatie van het hepatitis B-virus (HBV) in muizen door gebruik te maken van de adoptieve celoverdracht (ACT) van stamcel afkomstige virale antigeen (AG)-specifieke T-lymfocyten. Deze procedure kan worden aangepast voor mogelijke op ACT gebaseerde immunotherapie van HBV-infectie.

Stamcel afkomstige virale AG-specifieke T-lymfocyten onderdrukken HBV-replicatie bij muizen

Dit protocol biedt een gestroomlijnde workflow voor het genereren en testen van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs).

Generatie van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen

Leer hoe u geïnduceerde regulatoire T-cellen genereert uit primaire menselijke naïeve en geheugen T-cellen. Deze methode maakt vergelijking van Tregs met andere subsets binnen één donor mogelijk.

Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen

Meer video's verkennen