Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van humane regulatoire T-cellen uit primaire T-cellen. Eerst worden mononucleaire cellen uit perifeer bloed geïsoleerd uit humane bloedmonsters. Vervolgens worden CD4-positieve T-cellen gezuiverd uit het PBMC-mengsel en gekweekt.

Na zes dagen worden de cellen met behulp van een flowcytometer gesorteerd in naïeve, geheugen-, effector- en geïnduceerde regulatoire T-celsubsets, waarna suppressor-assays worden uitgevoerd. Gebruik deze cellen om aan te tonen dat deze methode menselijke regulatoire T-cellen met suppressoractiviteit genereert. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van technieken die gebruikmaken van muizencellen, zijn dat onze menselijke methode een grotere fysiologische en klinische relevantie heeft en een vergelijking van Tregs met andere celpopulaties binnen een enkele donor mogelijk maakt.

Het elimineren van variabiliteit tussen proefpersonen. Deze methode kan cruciale vragen over het regulatoire celveld beantwoorden, zoals wat de regulatoire gebeurtenissen zijn die de transitie tussen conventionele T-cellen en regulatoire cellen moduleren, of wat de signalerings- en transcriptionele gebeurtenissen zijn die specifiek zijn voor de regulatoire cellen? De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot therapieën voor auto-immuunziekten, inflammatoire aandoeningen en kanker vanwege de vitale rol die regs spelen in de immuunhomeostase.

Over het algemeen vinden personen die nieuw zijn in deze technische uitdaging het lastig vanwege de verscheidenheid aan gebruikte technieken en, in sommige stappen, het nauwe venster voor optimale kweekcondities van de cellen. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de ontwikkeling van Treg-cellen, kan deze ook worden gebruikt om de plasticiteit van de differentiatie van de T-cel-lijn te monitoren of om de capaciteit van T-cel-milli te analyseren om dit te induceren of te voorkomen. De procedure voor de ontwikkeling van Treg-cellen zal worden gedemonstreerd door Andrea McCool en de promovendi Marie Catherine Ranier, Gavin Ellis en Catalina Vale Ortega.

Begin deze procedure door menselijke perifere mononucleaire bloedcellen te isoleren uit 40 tot 60 liter B Buffy coat. Om de buffy coat te verdunnen, brengt u deze over in een autoclaafbare glazen fles van 500 milliliter die 150 milliliters steriele PBS bevat. Voeg vervolgens meer steriele PBS toe om het uiteindelijke volume aan te vullen tot 250 milliliters. Vul daarna 10 conische buizen van 50 milliliter, elk met 20 milliliters lympho prep-oplossing.

Breng vervolgens voorzichtig 25 milliliter van de verdunde buffy coat aan bovenop de Lympho prep-oplossing. Let er hierbij op dat de Lympho prep-oplossing niet wordt verstoord. Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op 500 ×g. Zorg ervoor dat de rem van de centrifuge is uitgeschakeld om te voorkomen dat de lymfocytenfractie wordt verstoord.

Na het centrifugeren bevindt de PBM CS zich op de interface tussen de lymfaprep en de plasmamediumlagen om deze te verzamelen. Aspireer het plasmamedium totdat er nog ongeveer 1 milliliter overblijft dat de buffy coat-laag met de pbmc bedekt. Gebruik een 10 milliliter pipet om de pbmc over te brengen naar een nieuwe 50 milliliter buis.

Nadat de cellen tweemaal zijn gewassen met PBS, worden ze opnieuw gesuspendeerd in 50 milliliters koud RPMI en geteld met behulp van een hemocytometer. De typische opbrengst is 8 × 10⁸ tot 1 × 10⁹ pBMC's nadat de concentratie is bepaald. Suspendeer de pBMC's opnieuw tot een uiteindelijke concentratie van 5 × 10⁷ per milliliter in PBS met 2% FBS en 1 millimolaire EDTA en breng de cellen over naar een nieuwe 14 milliliter polypropyleen buis met ronde bodem.

Vervolgens wordt de EA-kit gebruikt voor de negatieve selectie van de cellen van belang. De cocktails voor T-celverrijking die bij de kit worden geleverd, bevatten een tetramere antilichaamcomplex, dat aan de ene zijde een anti-dextrine-antilichaam heeft en aan de andere zijde een antilichaam tegen ongewenste celoppervlakte-antigenen. Wanneer de cocktail aan de cellen wordt toegevoegd, verbindt het tetramere antilichaamcomplex de ongewenste cellen.

Vervolgens worden met dextraan gecoate magnetische deeltjes toegevoegd, die binden aan het tetramere antilichaamcomplex en zo de ongewenste cel verbinden met het magnetische deeltje. Er wordt vervolgens een magneet gebruikt om de ongewenste cellen te scheiden van de cellen van belang, die vervolgens worden opgevangen om CD4-positieve T-cellen te isoleren. Pipetteer 1 × 10⁸ tot 4,25 × 10⁸ PBMC in een conische buis van 15 ml. Voeg vervolgens voor elke milliliter PBMC 50 µL van de human CD4-positive T-cell enrichment cocktail van antilichamen toe.

Meng en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Meng de magnetische particles om deze gelijkmatig over de oplossing te verdelen. Voeg 100 µL magnetische particles toe per milliliter PBMC.

Meng door twee tot drie keer voorzichtig te pipetteren en incubeer ze vervolgens 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg PBS met FBS en EDTA toe om het volume aan te vullen tot 10 milliliters per buis en meng door twee tot drie keer voorzichtig te pipetteren. Plaats de ongekapte buis vervolgens vijf minuten in de cept-magneet, waarbij de buis in de magneet blijft staan.

Giet de vloeistof in een nieuwe buis van 50 milliliter om de gewenste cellen te isoleren voor een betere opbrengst. Herhaal dit proces door extra P-B-S-F-B-S-E-D-T-A aan de buis toe te voegen, te mengen en het monster opnieuw in de magneet te plaatsen. Zodra de cellen zijn geïsoleerd, telt u deze en centrifugeert u ze vervolgens 5 minuten bij 500 ×g bij kamertemperatuur.

Resuspendeer de celpellet in polarisatiemedium om een concentratie van 2 × 10⁶ cellen per milliliter te bereiken. Ga vervolgens verder met het cultiveren zoals beschreven in het volgende gedeelte van de video om regulatoire T-cellen te induceren. Voorverwarm anti-CD3-gecoate 6-wells weefselkweekplaten bij 37 °C.

Zodra de platen opgewarmd zijn, wordt het PBS uit de wells geaspireerd. Voeg vervolgens vier milliliter van de CD four positief verrijkte celsuspensie aan elke well toe. Vul eventuele lege wells aan met PBS om verdamping van het medium te verminderen en incubeer gedurende drie dagen.

Centrifugeer de plaat vijf minuten bij 500 ×g. Verwijder vervolgens, zonder de cellen op de bodem van de plaat te verstoren, de helft van het medium en vervang dit door vers medium; incubeer nog twee tot drie dagen. De cellen kunnen nu worden gesorteerd via fluorescence activated cell sorting zoals beschreven in de volgende sectie, of worden gebruikt als doelcellen voor een suppressie-assay zoals later beschreven. Nadat er twee tot drie dagen zijn verstreken, worden de cellen en de passende compensatiecontroles voorbereid voor fluorescence activated cell sorting om geïnduceerde regulatoire naïeve en memory T-cellen te scheiden. Kleur de te sorteren cellen met anti-CD25 PE, anti-CD45RA PE-Cy5 en anti-CD127 APC, zoals beschreven in het bijbehorende document.

Zorg er ook voor dat antilichamen worden toegevoegd aan de juiste compensatiecontroles voor fax-analyse. Resuspendeer de cellen na kleuring in wasbuffer tot een concentratie van 1 × 10⁷ cellen per milliliter, voeg vervolgens 1,5 µL DNase II per milliliter cellen toe en filtreer de cellen door een nylon cell strainer van 40 µm. Breng de cellen over naar polypropylene tubes met een ronde bodem van 5 milliliter, met maximaal 3,5 milliliter per tube.

Resuspendeer de compensatiecontrolecellen in 300 microliters wasbuffer. Stel de compensatie op de flowcytometer zo in dat kruisdetectie door de PE A PC- en PE sci-fi-filters wordt geminimaliseerd. Stel gates in om tregs, naïeve en memory T-cellen te sorteren in polystyreen buizen met een ronde bodem van vijf milliliter die één milliliter kalfsserum bevatten, om vast te stellen of de regulatoire T-cellen die tijdens de sortering zijn gegenereerd in staat zijn om T-celproliferatie te onderdrukken.

Hier wordt een suppressie-assay uitgevoerd. De niet-gesorteerde, CD4-positieve verrijkte cellen dienen als doelcellen. Deze mogen geen CD25-positieve geïnduceerde regulatoire T-cellen bevatten.

Begin met het labelen van de doelcellen met CFSE met behulp van een cell trace kit volgens de instructies van de fabrikant, waarbij één microliter van een 5 M stockoplossing per milliliter cellen wordt gebruikt in plaats van twee microliters. Pelleteer vervolgens een aantal treg suppression inspector beads gelijk aan het totale aantal cellen door middel van een korte centrifugatie in een microcentrifugebuis. Was de beads één keer met RPMI en pelleteer ze opnieuw na het centrifugeren.

Aspireer het RPMI en resuspendeer ze tot de juiste concentratie in acht microliters suppressie-assaymedium per well in een 96-wells ronde bodem weefselkweekplaat. Voeg acht microliters CFSE-gekleurde doelcellen toe. Inspecteer de beads en gepolariseerde gesorteerde cellen tot een eindvolume van vers suppressie-assaymedium.

Medium van 200 µL. Alle condities worden in triplikaat geplaatst. Voor de bereiding van de controles worden 100 µL CFSE-gekleurde cellen, acht µL inspector beads en 1 × 10⁵ verse ongekleurde cellen toegevoegd aan 92 µL suppressor assay.

Medium per putje aan de eerste twee controleputjes. Voeg vervolgens 100 µL CFSE-gekleurde cellen en 1 × 10⁵ verse ongekleurde cellen in 92 µL suppressor assay-medium per putje toe. Medium per putje aan de tweede twee controleputjes.

Dek de plaat af met aluminiumfolie en plaats deze vijf dagen in het donker in de incubator. Verzamel de cellen uit elke put door middel van pipetteren en breng ze over in een polystyreen buis met ronde bodem van vijf milliliter. Centrifugeer de cellen bij 500 ×g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Zuig het medium af en resuspendeer ze in 300 microliters koud fax wasbuffer. Om de voortgang van de geïnduceerde differentiatie van regulatoire T-cellen te monitoren, werden gezuiverde humane primaire CD4 positieve CD25 negatieve T-cellen gekweekt in iTreg medium; aliquoten genomen op dag 0, 1, 3 en 5 werden geanalyseerd via flowcytometrie om de expressie van CD45RA, FoxP3, CTLA4 en CD25 markers te beoordelen. Zoals te zien is in deze pseudokleur dotplots, prolifereren en differentiëren de cellen in vitro over een tijdsverloop van vijf dagen als reactie op CD3 cross-linking in aanwezigheid van TGF-beta en IL-2, wat uiteindelijk leidt tot een CD45RA negatief, FoxP3 hoog, CTLA4 hoog en CD25 hoog profiel. Dit duidt op de ontwikkeling van iTregs uit conventionele T-cel precursors om het relatieve vermogen van de gegenereerde tregs om T-cel proliferatie te onderdrukken te beoordelen.

CFSE-gelabelde cellen werden gekweekt met treg suppression inspector beads in aanwezigheid van gesorteerde naïeve memory- en iTreg-cellen, zoals te zien is in dit histogram. Cellen CD25 high, CD45RA negatief CD127 negatief. Low geïnduceerde regulatoire T-cellen zijn de enige subset uit een vijfdaagse kweek die regulatoire onderdrukkingscapaciteit heeft verworven.

Dit geeft aan dat de in dit systeem gegenereerde cellen zowel fenotypisch als functioneel suppressor regulatoire T-cellen zijn en geen geactiveerde conventionele T-cellen, die mogelijk tijdelijk FOX P3 en CD 25 tot expressie brengen, maar niet immunosuppressief zijn. De aanwezigheid van geïnduceerde regulatoire T-cellen heft de proliferatie van CD4-positieve T-cellen volledig op. De getallen zijn indicatief voor het percentage CFSE-gelabelde cellen die zich hebben gedeeld om vast te stellen dat hetzelfde geldt voor gezuiverde T-cel-subsets.

Menselijke primaire naïeve en geheugen T-cellen werden gekleurd met CFSE en daarin gekweekt. In Treg-medium werden de cellen na vijf dagen gefenotypeerd en werden de celdelingssnelheden geschat zoals weergegeven. Hier werden Tregs geïnduceerd uit een pool van naïeve T-cellen en een pool van geheugen T-cellen na een kweekperiode van vijf dagen.

In standaard IT reg medium, toont CFSE-kleuring van de initiële cellen aan dat zowel naïeve als geheugen-T-cellen pas na meerdere ronden van celdeling differentiëren tot regulatoire T-cellen; vergelijkende CFSE-kleuringsprofielen identificeren de geïnduceerde regulatoire T-cellen als de meest proliferatieve cellen tijdens de vijfdaagse cultuur. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u geïnduceerde TX verkrijgt uit een populatie van naïeve, geheugen- of totale T-cellen afkomstig van een enkele donor tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Het is belangrijk om gedurende het hele proces een steriele techniek te hanteren en te voorkomen dat de CFSE aan licht wordt blootgesteld tijdens deze procedure. Andere methoden, zoals functionele assays, kunnen worden uitgevoerd om andere vragen te beantwoorden, zoals wat de verschillen zijn in celdelingssnelheden, specifieke cytokinesynthese en het gebruik van ionkanalen tussen regulatoire en conventionele T-cellen na hun ontwikkeling. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van de immunologie om auto-immuunziekten en andere treg-gerelateerde pathologieën bij menselijke patiënten te onderzoeken.

Vergeet niet dat het werken met menselijk bloed zeer riskant is en dat er tijdens deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals adequate bloedbanktests en een correcte afvalverwerking.