Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

Het algemene doel van het volgende experiment is om het gebruik van glycosate voor de enzymatische deglycosylering en analyse van n- en O-gebonden glycosylering op een modelglycoproteïne te illustreren. Dit wordt bereikt door een glycoproteïne te behandelen met PGA's F of met de protein deglycosylation mix. Daarnaast is de protein deglycosylation mix aangevuld met een mengsel van additionele exo glyco ass, die soms helpen bij het verwijderen van anderszins resistente suikers.

We illustreren deze methode aan de hand van een modelglycoproteïne, recombinant humaan choriongonadotropine bèta, of HCG bèta, gevolgd door SDS-PAGE, Coomassie-blauw kleuring en een suikerspecifieke kleuringsmethode. Pro Q Emerald 300 wordt gebruikt om de glycosylering te analyseren. De resultaten van de HCG bèta-monsters tonen aan dat HCG bèta heterogeen geglycosyleerd is en meerdere glycovormen bevat, gebaseerd op de verschillen in eiwitmigratie met en zonder glycosidasebehandeling en het verminderde signaal bij de ProQ-kleuring naarmate de glycanen opeenvolgend worden verwijderd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals massaspectrometrie-analyse, is dat deze eenvoudig is, gebruikmaakt van gangbare laboratoriumapparatuur en geschikt is voor de beginnende glycobioloog. Deze methode kan cruciale vragen in het glycoveld beantwoorden, zoals de vraag of een eiwit geglycosyleerd is. Om te beginnen met de enzymatische deglycosylering, ontdooit u de meegeleverde buffers uit de proteïne-deglycosyleringskit.

Meng de buisjes grondig en bewaar deze bij kamertemperatuur. Plaats de vials met enzymen op ijs, los de inhoud van het HCG beta-vial op in 600 µL gedestilleerd water en bewaar dit op ijs. Bereid één milliliter van een 1X G7-buffer door de 10x stock te verdunnen in gedestilleerd water en gebruik vervolgens 25 µL hiervan om 0,5 µL PGA's f te verdunnen.

Bereid de exo glycosidasedispositie voor door telkens twee microliters van de vier exo glycosidases te combineren. Voeg vervolgens HCG beta en 10 x glycoproteïne-denaturatiebuffer toe aan zeven genummerde PCR-buisjes zoals aangegeven in het schriftelijke protocol, sluit de buisjes en meng voorzichtig. Denatureer de eiwitten in de thermocycler door 10 minuten te incuberen bij 94 °C, gevolgd door een hold op 4 °C. Centrifugeer de buisjes na het verwijderen uit de thermocycler om eventuele zichtbare condensatie te verwijderen. Voeg aan elk reactiebuisje de resterende reagentia toe volgens het schriftelijke protocol. Sluit de PCR-buisjes met nieuwe dopjes.

Meng de buisjes vervolgens door ze vier keer voorzichtig te tikken nadat de inhoud is gecentrifugeerd, plaats de buisjes in de thermocycler en incubeer deze gedurende vier uur bij 37 °C. Koel de monsters daarna af tot 4 °C. Bereid voor de SDS-PAGE verse 3x reducerende SDS-laadbuffer.

Voeg 12,5 µL van de bereide drie x reducerende SDS-laadbuffer met DTT toe aan elk monster, sluit de buisjes met nieuwe doppen en tik voorzichtig tegen de buisjes om te mengen. Incubeer de buisjes in een thermocycler bij 94 °C gedurende vijf minuten en koel ze vervolgens af tot 4 °C. Laad na incubatie 30 µL van elk monster en 10 µL van de eiwitmarker op een 10 tot 20% tri-glycine gel, waarbij het restant van elk monster wordt bewaard.

Voer elektroforese uit op de gel bij 130 volt totdat het D-front zich nabij de onderkant van de gel bevindt. Wanneer de run is voltooid, wordt de gel uit de mal verwijderd en in een kleine plastic bak geplaatst met voldoende kumasi blue-kleurstof om de gel te bedekken. Kleur de gel gedurende één uur onder milde agitatie nadat de gel is gekleurd.

Was drie keer gedurende 30 minuten. Leg de afbeeldingen vast in 50 milliliter detain-oplossing met behulp van een witlicht-transilluminator of scanner. Alternatief kan de gel worden gedroogd tussen vellen cellofaan.

Voer in een frame de rest van elk monster en een eiwitmarker uit op een 10 tot 20% Tri-glycinegel terwijl de gel loopt. Los het ProQ emerald-reagens op met DMF en bereid de stockfixeer-, was- en oxidatieoplossingen voor de kleuring voor volgens de producthandleiding die bij de kit is geleverd. Wanneer de elektroforese is voltooid, verwijder dan de gel uit de mal en plaats deze in een plastic doos.

Fixeer de gel door 100 milliliter van de bereide fixeersolutie toe te voegen. Laat de gel een nacht bij kamertemperatuur rusten onder milde agitatie. Was de gel gedurende 10 tot 20 minuten bij kamertemperatuur met 100 milliliter van de bereide wassolutie onder milde agitatie, en herhaal deze wasstap een tweede keer met verse wassolutie.

Oxideer vervolgens de koolhydraten door de gel 30 minuten met zachte agitatie te incuberen in 25 milliliters van de bereide oxidatielosung, gevolgd door twee aanvullende wasbeurten terwijl de gel wordt gewassen. Bereid verse ProQ emerald 300-kleurstof door 500 microliters van de ProQ Emerald 300-reagensoplossing toe te voegen aan 25 milliliters van de in de kit meegeleverde kleurbuffer. Kleur de gel door deze na de gelkleuring gedurende 90 tot 120 minuten onder donkere omstandigheden met zachte agitatie te incuberen in de bereide kleurstof.

Herhaal de twee wasstappen zoals eerder beschreven. Leg vervolgens de beelden vast met een UV-transilluminator op 300 nanometer. Vergelijk als laatste stap de beelden van de Coomassie-gekleurde gel met de ProQ Emerald-gekleurde gel.

De veranderingen in eiwitmigratie na enzymatische deglycosylering zijn zichtbaar wanneer de controlemonster wordt vergeleken met de behandeling van PGA's F. Om n-glycanen te verwijderen en bij de behandeling met de deglycosyleringsmix om n- en O-glycanen te verwijderen, is er geen verdere afname in grootte waarneembaar na digestie met extra glycosidase. Naast een verandering in massa worden de banden scherper naarmate glycanen worden verwijderd.

Een band die onder de marker van 17 kilodalton loopt, vertegenwoordigt waarschijnlijk het volledig gedeglycosyleerde HCG bèta-polypeptide. Banen vijf tot en met zeven tonen de banden die overeenkomen met de Glyco. Andere banden kunnen afkomstig zijn van incomplete deglycosylering of van meerdere niet-geïdentificeerde eiwitten die aanwezig zijn in het HCG bèta-monster.

Het smaragdgroene reagens oxideert en kleurt alle glycanen die in een eiwitmolecuul aanwezig zijn. Daarom neemt de signaalintensiteit af naarmate HCG beta enzymatisch wordt gedeglycosyleerd. Het resterende signaal in baan drie en vier duidt op de aanwezigheid van glycaanmotieven die resistent zijn tegen de gebruikte enzymen.

Het extra glycosaat wordt gebruikt in baan vier. Verwijder enkele extra suikerresten. De eiwitmigratie is hetzelfde, maar er is een lichte afname in de intensiteit van de kleuring waarneembaar.

Resistente suikergroepen waren niet aanwezig in alle eiwitsoorten. Sommige banden werden niet gedetecteerd door Emerald Green, wat erop wijst dat deze uitgebreid gedeglycosyleerd waren. Aanvullende gegevens ondersteunen de conclusie dat HCG bèta heterogeen geglycosyleerd is. De onderste band in baan twee is zwak zichtbaar op de Emerald Green-afbeelding.

Hoewel de bovenste band in baan twee helder is, wat aangeeft dat er nog veel GLYCAN-groepen aanwezig zijn, ondersteunen deze gegevens de conclusie dat recombinant HCG bèta dat in muiscellen is tot expressie is gebracht, meerdere glycovormen bevat vanwege de inherente heterogeniteit van glycosylering. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals massaspectrometrie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: wat is de bezettingsgraad? Wat is de mate van glycosylering, of wat is de fijne structuur van de glycanen?

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u glycosylate kunt gebruiken voor de enzymatische deglycosylering en analyse van NNO-gekoppelde glycanen op glycoproteïnen. De keuze van de detectiemethode kan lastig zijn, omdat eiwitkleuringsregio's alleen nuttig zijn als de deglycosylering resulteert in een significante verschuiving in de moleculaire massa voor andere eiwitten.

We hebben abnormale migraties waargenomen na deglycosylering en hebben vastgesteld dat elke verandering in de migratie een bewijs is dat het eiwit is deglycosyleerd.