Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

Het algemene doel van het volgende experiment is om het gebruik van glycosaat te illustreren voor de enzymatische deglycosylering en analyse van n en O Gekoppelde glycosylering op een model glycoproteïne. Dit wordt bereikt door een glycoproteïne te behandelen met PGA's F of met het eiwitdeglycosyleringsmengsel. Ook werd het eiwitdeglycosyleringsmengsel aangevuld met een mengsel van extra exo glyco ass, die soms helpen om anders resistente suikers te verwijderen.

We illustreren deze methode met behulp van een model glycoproteïne recombinant humaan choriongonadotrofine beta, of HCG beta volgende SDS-pagina, gevolgd door Kumasi blauw kleuring en een suikerspecifieke kleuringsmethode. Pro Q Emerald 300 worden gebruikt om de D geglycosyleerde te analyseren. HCG beta monsters worden verkregen, die aantonen dat HCG beta heterogeen geglycosyleerd is en meerdere glycovormen bevat op basis van de verschillen in eiwitmigratie met en zonder glycosaatbehandeling en het verminderde signaal op ProQ kleuring naarmate de glycanen successief worden verwijderd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals massaspectrometrie-analyse, is dat het eenvoudig is, gebruik maakt van gebruikelijke laboratoriumapparatuur en goed is voor de beginnende glycobioloog. Deze methode kan sleutelvragen in het glycogebied beantwoorden, zoals is mijn eiwit geglycosyleerd. Om te beginnen met enzymatische deglycosylering ontdooi de meegeleverde buffers uit het eiwitdeglycosyleringskit.

Meng de buisjes grondig en bewaar ze op kamertemperatuur. Plaats de enzymhoudende flesjes op ijs, los de inhoud van het HCG beta flesje op in 600 microliters gedistilleerd water en bewaar het op ijs. Na het bereiden van één milliliter van één XG zeven buffer door de 10 x voorraad te verdunnen in gedistilleerd water, gebruik 25 microliters om 0,5 microliters van PGA's f te verdunnen.

Bereid het exo glycosaatmengsel voor door twee microliters van elk van de vier exo glyco ziekten te combineren. Voeg vervolgens HCG beta en 10 x glycoproteïne denaturerende buffer toe aan zeven genummerde PCR-buisjes zoals aangegeven in het geschreven protocol, sluit de buisjes en meng voorzichtig. Denatureer de eiwitten in de thermocycler door 10 minuten bij 94 graden Celsius te incuberen, gevolgd door een houden bij vier graden Celsius. Na het verwijderen van de buisjes uit de thermocycler centrifugeer om eventuele zichtbare condensatie uit elke reactiebuis te verwijderen, voeg de resterende reagentia toe volgens het geschreven protocol. Sluit de PCR-buisjes met nieuwe doppen.

Meng vervolgens de buisjes door vier keer voorzichtig te tikken nadat de inhoud naar beneden is gedraaid, plaats de buisjes in de thermocycler en incubeer gedurende vier uur bij 37 graden Celsius. Koel vervolgens de monsters af tot vier graden Celsius. Om SDS-pagina in te stellen, bereid vers drie x reducerend SDS-ladingsbuffer.

Met DTT, voeg 12,5 microliter van de bereide drie x reducerend SDS-ladingsbuffer Toe aan elk monster, sluit de buisjes met nieuwe doppen en tik voorzichtig op de buisjes om te mengen. Incubeer de buisjes in een thermocycler bij 94 graden Celsius gedurende vijf minuten en koel vervolgens af tot vier graden Celsius. Na incubatie laad, 30 microliter van elk monster en 10 microliter van de eiwitmarker Op een 10 tot 20%tri glycine gel. Bewaar de rest van elk monster.

Electros de gel bij 130 volt totdat de D-voorkant zich bijna aan de onderkant van de gel bevindt. Wanneer de gel klaar is, verwijder de gel uit de mal en plaats deze in een kleine plastic doos met genoeg kumasi blauwe kleurstof om de gel te bedekken. Bewaar de gel een uur met zachte agitatie. Nadat de gel is gekleurd.

Was drie keer gedurende 30 minuten. In 50 milliliters dekkingsoplossing, registreer de afbeeldingen met een wit licht transluminator of scanner. Als alternatief kan de gel worden gedroogd tussen vellen cellofaan.

In een frame, voer de rest van elk monster en een eiwitmarker uit op een 10 tot 20%Tri glycine gel terwijl de gel draait. Los de ProQ smaragd reagens op met DMF en bereid de voorraad fix, was en oxiderende oplossingen voor de kleuring volgens de producthandleiding die bij het kit wordt geleverd. Wanneer de elektroforese voltooid is, verwijder de gel uit de mal en plaats deze in een plastic doos.

Fix de gel door 100 milliliter van de bereide fixe oplossing toe te voegen. Laat de gel een nacht bij kamertemperatuur staan met zachte agitatie. Was de gel met 100 milliliter van de bereide wasoplossing gedurende 10 tot 20 minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie, herhaal de was een tweede keer met verse wasoplossing.

Oxideer vervolgens de koolhydraten door de gel te incuberen met zachte agitatie gedurende 30 minuten in 25 milliliters van de bereide oxiderende oplossing, volg de incubatie met twee extra wasbeurten terwijl de gel wordt gewassen. Bereid vers ProQ smaragd 300 kleurstof voor door 500 microliters van de ProQ Smaragd 300 reagensoplossing toe te voegen aan 25 milliliters van de in het kit geleverde kleuringsbuffer. Kleur de gel door te incuberen in de bereide kleurstof onder donkere omstandigheden met zachte agitatie gedurende 90 tot 120 minuten na de kleuring van de gel.

Herhaal de twee wasstappen zoals eerder beschreven. Neem vervolgens de afbeeldingen op met een UV-trans illuminator bij 300 nanometer. Als laatste stap, vergelijk de afbeeldingen van de kumasi gekleurde gel met de ProQ smaragd kleuring gel.

De veranderingen in eiwitmigratie na enzymatische deglycosylering kunnen worden gezien wanneer het controlemonster wordt vergeleken met de PGA's F behandeling. Om n glycanen te verwijderen en de Deglycosyleringsmix behandeling om n en O glycanen te verwijderen, wordt geen verdere verkleinde grootte gezien na vertering met extra glycosaat. Naast een verandering in massa worden banden scherper naarmate glycanen worden verwijderd.

Een band die onder de 17 kilodalton marker loopt, vertegenwoordigt waarschijnlijk het volledig gedeglycosyleerd HCG beta polypep