Name: Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Leer enzymatische deglycosylering van glycoproteïnen met specifieke glycosidases voor analyse van N- en O-gekoppelde glycosylering. Deze methode gebruikt SDS-PAGE en specifieke kleuringstechnieken om glycaanmodificaties te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<html> 1. Enzymatische deglycosylatie <ol><li> Gebruik PCR-buisjes om waterverlies door verdamping te minimaliseren. Label een stel buisjes 1 tot 7. </li><li> Ontdooi de 10X G7 buffer, de 10X glycoproteïne denaturerende buffer, en de 10% NP-40 en zachte tik op de buizen naar de inhoud te mengen. Bewaren bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats het enzym-bevattende flesjes op het ijs. Probeer de dooi / vries-cycli te minimaliseren. </li><li> Los de inhoud van de hCGβ flacon (150 ug) in 600 ul van dH 2 O en blijf op ijs. </li><li> Bereid 1 ml 1X G7 buffer door verdunning van de 10X voorraad in dH 2 O. </li><li> Verdun 0,5 pi van PNGase F in 25 ul 1X G7 buffer en blijf op ijs. </li><li> Bereid de mix exoglycosidase (EG mix) door het combineren van 2 pi elk van α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 fucosidase, β1-3 galactosidase, en α1-3, 6 galactosidase. </li><li> Stel PCR-buisjes, zoals aangegeven: </li></ol>ak &quot;&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Tube / monster # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> hCGβ (0.25mg/ml) </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 10X Glycoproteïne denatureren Buffer </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> Cap de buizen, meng en plaats in hetthermocycler, sluit het deksel en de denaturatie van de eiwitten door het incuberen van 10 minuten bij 94 ° C, gevolgd door een 4 ° C te houden (met behulp van PCR-buizen in een thermocycler veel voorkomt verdamping in kleine hoeveelheden monsters). </li><li> Haal de buizen van thermocycler en centrifuge om zichtbare condensatie te verwijderen. </li><li> Voeg de volgende reagentia zoals aangegeven: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Sample # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 10% NP-40 </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> 10X G7 Buffer </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5 &amp; mu; L </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> PNGase F 01:50 dil. </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Deglycosylatie Mix </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> EG mix </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 10μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> Totale reactie vol. </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l &lt;/ Td&gt; <td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td></tr></tbody></table><ol start="12"><li> Sluit de PCR-buisjes met behulp van nieuwe caps (gooi het gebruikte die omdat ze niet goed passen na een incubatie-cyclus). </li><li> Meng de buizen door zachtjes tikken vier keer en dan draaien de inhoud naar beneden. </li><li> Plaats de buizen in de thermocycler en incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur, dan de monsters afkoelen tot 4 ° C. </li></ol> 2. SDS-PAGE van deglycosylated monsters <ol><li> Bereid 130 ul vers 3X ​​reducerende SDS laadbuffer door het toevoegen van 4 ul van 1.25m DTT. </li><li> Voeg 12,5 ul van de voorbereide 3x reducerende SDS laadbuffer aan elk monster. </li><li> Sluit de buizen met nieuwe caps en tik de buizen om te mengen. </li><li> Incubeer de buizen in een thermocycler bij 94 ° C gedurende 5 minuten en daarna afkoelen tot 4 ° C. </li><li> Belasting 30 pi van elk monster en 10 ul van het eiwit marker op een 10-20% Tris-Glycine gel. Sla de rest van de steekproef voor deel 3.1. Belasting 10μl van ColorPlus Prestained Protein Marker. </li><li> Electrophorese de gel op 130 volt bij kamertemperatuur totdat de kleurstof voorkant is de buurt van de onderkant van de gel. </li><li> Wanneer de gel is voltooid, verwijdert u de gel uit de cast en plaats deze in een klein plastic doosje met genoeg Coomasie blauwe vlek om de gel te dekken. </li><li> Vlekken op de gel gedurende 1 uur onder zacht schudden. </li><li> Was de gel drie keer voor 30 minuten in 50 ml van destain oplossing. </li><li> Noteer de beelden met behulp van een wit licht transilluminator of scanner. Als alternatief kan de gel worden gedroogd tussen de bladen van cellofaan in een frame. </li></ol> 3. Pro-Q Emerald 300 voor de detectie van geglycosyleerde proteïnen in SDS-PAGE gels <ol><li> Parallel met de gel in 2.1), laad de rest van de monsters op een 10-20% Tris-Glycine gel. Belasting 10 &amp; mu; L van ColorPlus Prestained Protein Marker. </li><li> Terwijl de gel loopt tot ontbinding van de Pro-Q Emerald reagens met DMF en de voorbereiding van de voorraad Fix, wassen en oxiderende oplossingen voor de Pro-Q Emerald 300 vlek na de product handleiding die bij de kit. </li><li> Als de elektroforese is voltooid, verwijdert u de gel van de cast en plaats deze in een plastic doos. </li><li> Bevestig de gel door het toevoegen van 100 ml van de Fix-oplossing en het verlaten van het &#39;s nachts bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Was de gel met 100 ml van de Wash-oplossing voor 10 tot 20 minuten bij kamertemperatuur met niet-joodse agitatie. Herhaal de wassen met verse Wash-oplossing. </li><li> Oxideren van de koolhydraten door het incuberen van de gel met zacht schudden gedurende 30 minuten in 25 ml van oxiderende oplossing. </li><li> Was de gel zoals beschreven in stap 3.5. </li><li> Terwijl de gel is wassen voor te bereiden verse Pro-Q Emerald 300 vlek door het toevoegen van 500 pi van de Pro-Q Emerald 300 reagens oplossing opgelost in stap 3.2 tot 25 ml vanvlekken buffer die in de kit. </li><li> Vlekken op de gel door toevoeging van 25 ml van de vlek bereid in stap 3.8 en incubatie in het donker met zacht schudden voor 90 tot 120 minuten. </li><li> Herhaal de twee wasstappen beschreven in stap 3.5. </li><li> Noteer de beelden met een UV-transilluminator bij 300 nm. Gebruik maken van de 80 kDa marker, die is voorzien van Pro-Q Emerald Green, de UV-afbeelding overlappen om een ​​wit licht beeld van de gel met de prestained ladder. </li><li> Vergelijk de beelden van de Coomasie gekleurde gel in stap 2,10 met de Pro-Q Emerald gekleurde gel vanaf stap 3.11. </li></ol> 4. Representatieve resultaten De veranderingen in eiwit migratie na enzymatische deglycosylatie zijn weergegeven in figuur 2. Vergelijk de te controleren steekproef (panel A, baan 1) met de PNGase F behandeling (verwijdering van N-glycanen, laan 2), en deglycosylatie Mix (PNGase F, plus endo-en exoglycosidases naar O-glycanen te verwijderen, baan 3). Zonder verdere verlagingin grootte wordt gezien na het verteren met extra glycosidasen (baan 4). Naast een verandering in de massa, bands worden scherper als glycans worden verwijderd. Een band die draait onder de 17 kDa marker (asterisk) vertegenwoordigt de volledig deglycosylated hCGβ polypeptide (MW: 16 kDa). Andere bands zou kunnen voortvloeien uit onvolledige deglycosylatie of van de verschillende niet-geïdentificeerde eiwitten die aanwezig zijn in de hCGβ steekproef (zie baan 1). Lanen 5 tot 7 (controles) tonen de bands die overeenkomt met de glycosidases. De glycoproteïne vlekken door Emerald Green is te zien in paneel B. Dit reagens oxideert en vlekken alle glycanen aanwezig zijn in een eiwitmolecuul. Daarom is de intensiteit van het signaal af naarmate hCGβ is enzymatisch deglycosylated (baan 1 tot baan 4). De resterende signaal in lanen 3 en 4 wijzen op de aanwezigheid van glycan motieven, die bestand zijn tegen de gebruikte enzymen. De extra glycosidases gebruikt in laan 4 verwijderen van een paar extra suiker residuen: het eiwit migratie is hetzelfde, maareen lichte daling van de intensiteit in vlekken te zien. Bestand tegen suiker-groepen waren niet aanwezig in alle eiwitten soorten: sommige banden werden niet gedetecteerd door Emerald Green (afwezig in de UV-beeld, tussen haakjes), dat aangeeft dat ze uitgebreid deglycosylated. Aanvullende gegevens ondersteunen de conclusie dat hCGβ heterogeen is geglycosyleerd. De lagere band op rijstrook 2 (pijl) is zwak op het Emerald Green beeld, terwijl de bovenste band op rijstrook 2 is helder, wat aangeeft dat veel suikers groepen nog steeds aanwezig zijn. Deze gegevens ondersteunen de conclusie dat recombinant hCGβ uitgedrukt in muizen cellen bevat meerdere glycovormen 9. Deze verschillende glycovormen zijn te wijten aan de inherente heterogeniteit van glycosylering waar een aantal polypeptiden ontvangen geen een glycan in elke consensus site en / of een aantal glycanen worden uitgebreid, terwijl anderen zelfs op hetzelfde eiwit dat niet zijn. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig1.jpg" /> Figuur 1.Typische glycosylering patronen voor uitgescheiden of cel-oppervlakte glycoproteïnen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig2.jpg" /> Figuur 2. SDS-PAGE-gels met enzymatische deglycosylatie van hCGβ. Paneel A toont een Coomasie blauwe vlekken, terwijl Paneel B toont de resultaten van Pro-Q Emerald 300 voor visualisatie van geglycosyleerde eiwitten. Voorbeeld nummer: 1, hCGβ controle; 2, PNGase F spijsvertering, 3, deglycosylatie Mix spijsvertering, 4, deglycosylatie Mix plus exoglycosidases spijsvertering, monsters 5 tot 7 zijn het reagens controles (O-Glyc, O-glycosidase, GNA, β-N -Acetylglucosaminidase; Gal / Fuc, β1-3 galactosidase, α1-3, 6 galactosidase, en α1-2 fucosidase, GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase, Neu, Neuraminidase, PNGase; PNGase F)

<ol><li>Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation%3A+nature%2C+distribution%2C+enzymatic+formation%2C+and+disease+implications+of+glycopeptide+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds.</a> Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).</li>
<li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+in+Cellular+Mechanisms+of+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation in Cellular Mechanisms of Health and Disease.</a> Cell. 126, 855-867 (2006).</li>
<li>Arnold, J. N., Wormald, M. R., Sim, R. B., Rudd, P. M., Dwek, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+glycosylation+on+the+biological+function+and+structure+of+human+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins.</a> Annual Review of Immunology. 25, 21-50 (2007).</li>
<li>Mitra, N., Sinha, S., Ramya, T. N. C., Surolia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+oligosaccharides+as+outfitters+for+glycoprotein+folding%2C+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">N-linked oligosaccharides as outfitters for glycoprotein folding, form and function.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31, 156-163 (2006).</li>
<li>Carlsen, R. B., Bahl, O. P., Swaminathan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chorionic+gonadotropin.+Linear+amino+acid+sequence+of+the+beta+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human chorionic gonadotropin. Linear amino acid sequence of the beta subunit.</a> Journal of Biological Chemistry. 248 (19), 6810-6812 (1973).</li>
<li>Tarentino, A. L., Plummer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deglycosylation+of+Asparagine-linked+Glycans+by+PNGaseF%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Glycoscience+and+Glycotechnology%22%5BJournal%5D)">Deglycosylation of Asparagine-linked Glycans by PNGaseF.</a> Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 5 (23), 163-170 (1993).</li>
<li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-N4-%28N-acetyl-%CE%B2-glucosaminyl%29asparagine+amidase+F+cannot+release+glycans+with+fucose+attached+%CE%B11-3+to+the+asparagine-linked+N-acetylglucosamine+residue%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1-3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199, 647-652 (1991).</li>
<li>Koutsioulis, D., Landry, D., Guthrie, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+endo-%CE%B1-N-acetylgalactosaminidases+with+broader+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Novel endo-α-N-acetylgalactosaminidases with broader substrate specificity.</a> Glycobiology. 18 (10), 799-805 (2008).</li>
<li>Thakur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+glycoforms+of+the+intact+alpha+subunit+of+recombinant+human+chorionic+gonadotropin+by+high-resolution+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Profiling the glycoforms of the intact alpha subunit of recombinant human chorionic gonadotropin by high-resolution capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (2), 8900-8907 (2009).</li>
<li>Park, S., Lee, M. R., Shin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+microarrays+as+powerful+tools+in+studies+of+carbohydrate-mediated+biological+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate microarrays as powerful tools in studies of carbohydrate-mediated biological processes.</a> Chemical Communications. 37, 4389-4399 (2008).</li>
<li>Zachara, N. E., Vosseller, K., Hart, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+proteins+modified+by+O-linked+N-acetylglucosamine%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of proteins modified by O-linked N-acetylglucosamine.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 95, 17-17 (2011).</li>
<li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVarki%2C+A+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. , 2nd Ed, Clod Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
</ol>

De auteurs zijn in dienst van New England Biolabs, die veel van de reagentia gebruikt in dit artikel oplevert.

De methode die hier beschreven met behulp van enzymatische deglycosylatie en SDS-PAGE kan waardevolle informatie over de glycosylering toestand van een eiwit van interesse te bieden, terwijl de glycan-specifieke reagentia vergemakkelijken de interpretatie van de gegevens. Dit protocol is bedoeld voor de eerste studies van eiwitten glycosylering en het is bijzonder geschikt voor secretoire en membraan glycoproteïnen uit zoogdiercellen: de enzymen gekozen in dit geval wordt specifiek verwijdert alle N-glycanen, en of N-glycanen plus en de meest voorkomende suikers uitbreiding en vormen de kern van O-glycanen. Glycosidases hebben het extra voordeel dat ze mild, vergeleken met chemische deglycosylatie methoden, het behoud van de integriteit van zowel de suikers en eiwitten ruggengraat. Om de bezettingsgraad (die aminozuren zijn geglycosyleerd), de mate van glycosylering, of om de fijne structuur van glycanen, meer geavanceerde technieken zoals m vast te stellen toe te lichtenkont spectrometrie, vloeibare chromatografie of NMR zijn vereist. Door zijn eenvoud, kunnen meerdere stappen in dit protocol worden aangepast, vervangen en / of gecombineerd met verschillende experimentele behoeften tegemoet te komen. Echter, voor het verkrijgen van resultaten die duidelijk geïnterpreteerd kunnen worden is het belangrijk om te begrijpen zijn sterke punten en beperkingen. Ten eerste, de specificiteit en de zuiverheid van de glycosidases zijn cruciaal: alleen goed gekarakteriseerde enzymen getest om vrij te zijn van proteasen en andere vervuilende activiteiten moeten worden gebruikt. Helaas is er geen standaard definitie voor enzym-eenheid glycosidasen, moet de gebruiker de juiste vervanging te bepalen volgens de specificaties van de fabrikant. Ten tweede, een zorgvuldige keuze van detectie is nodig: a) eiwitkleuring reagentia zijn alleen handig als deglycosylatie resulteert in een belangrijke verschuiving in de moleculaire massa. Zo&#39;n een duidelijk resultaat zoals hier te zien is niet altijd verkregen. In andere gevallen hebben we gezien abnormale miintegratie na deglycosylatie (ver van de voorspelde moleculair gewicht, of zelfs langzamer migratie). Dit fenomeen is niet goed begrepen, maar het kan gezegd worden dat iedere verandering in de migratie is het bewijs dat het eiwit is deglycosylated. B) Suiker detectie met antilichamen unieke uitdagingen beperking van hun toepasbaarheid presenteert. Het is erg moeilijk om algemene anti-glycan antilichamen te genereren, zijn ze meestal aangevoerd tegen een complex glycan doelstelling, die het gebruik ervan beperkt. Verder zijn er verschillende monoklonale anti-glycan antilichamen scherm ongewenste kruisreactiviteit 10. C) Lectines (eiwitten met suiker intrinsieke affiniteit) zijn zeer geschikt voor suiker detectie, plus ze geven inzicht in glycan structuur. Echter, niet alle van hen hebben een hoge specificiteit, en velen zijn slechts gedeeltelijk gekarakteriseerd (wat betekent dat ze kunnen onbekende affiniteiten hebben). Als gevolg daarvan positief lectine kleuring geeft indicatie, geen bewijs, van de aanwezigheid van een given suiker. d) Chemische de etikettering kits (gebaseerd op perjodaat oxidatie van suikers) zijn de methode bij uitstek om alle glycoproteïnen vlek, en dus zeer geschikt voor deglycosylatie volgen. Bij het verwerken van een onbekend monster, is het een goede gewoonte om glycoproteïne controles omvatten. Fetuin is een direct beschikbaar N - en O-glycoproteïne, choriongonadotrofine (beide subeenheden) is ook een goede keuze. Bovine serum albumine (BSA) kan gebruikt worden als een negatieve controle. Er dient echter te worden opgemerkt dat sommige niet-geglycosyleerde eiwitten lichtjes reageren met de Pro-Q Emerald 300, in het bijzonder bij gebruik bij hoge concentraties. Niet-geglycosyleerde moleculair gewicht normen, zoals de prestained eiwit marker gebruikt in dit protocol, hebben het voordeel van het weergeven van scherpe bands. Alleen door toeval is een van deze eiwitten (80 kDa) reactief naar Pro-Q Emerald 300. Daarom kan de gebruiker willen een glycoproteïne standaard ladder in plaats daarvan lopen, zoals Candy-Cane uit Invitrogen. Ten slotte is eenvoudig in-gel detectie van nucleocytosolic glycoproteïnen (die gemodificeerd zijn met een enkele O-GlcNAc) is mogelijk met het gebruik van een monoklonaal antilichaam, langs de β-N-Acetylglucosaminidase voor de specificiteit controle 11. De beschrijving van deze techniek is verder dan de bestek van dit artikel, maar het dient te worden vermeld als glycosidasen zijn nuttige instrumenten voor de studie van vele andere glycoproteïnen en glycoconjugaten aanwezig in de cellen. Een uitgebreide behandeling van alle bekende vormen van glycosylering kan worden gevonden in de tweede editie van de &#39;Essentials voor Glycobiologie &quot;, gratis beschikbaar online op de NCBI Bookshelf (boekenplank ID: NBK1908; PMID: 20301239) 12.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Humaan choriongonadotrofine β </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C6572 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Tubes </td><td> VWR </td><td> 20170-004 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Thermocycler </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4359659 </td><td></td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> P0704 </td><td> Geleverd met buffers </td></tr><tr><td> Eiwit deglycosylatie Mix </td><td> New England Biolabs </td><td> P6039 </td><td> Geleverd met buffers </td></tr><tr><td> α-N-Acetylglalactosaminidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0734 </td><td> Geleverd met buffer </td></tr><tr><td> α1-2 fucosidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0724 </td><td> Geleverd met buffer </td></tr><tr><td> α1-3, 6 galactosidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0731 </td><td> Geleverd met buffer </td></tr><tr><td> β1-3 galactosidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0726 </td><td> Geleverd met buffer </td></tr><tr><td> 10X Buffer G7 (500 mM natriumfosfaat) </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> Geleverd met PNGaseF of Degl Mix </td></tr><tr><td> 10X Glycoproteïne denatureren Buffer (5% SDS, 400 mM DTT) </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> Geleverd met PNGaseF of Degl Mix </td></tr><tr><td> 10% NP-40 </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> Geleverd met PNGaseF of Degl Mix </td></tr><tr><td> 3X SDS laadbuffer (187,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 6% SDS, 30% glycerol, 0,03% Bromophenol blauw) </td><td> New England Biolabs </td><td> B7703 </td><td> Geleverd met 1,25 m DTT </td></tr><tr><td> ColorPlus Prestained Protein Marker </td><td> New England Biolabs </td><td> P7709 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% Tris-Glycine Multigel </td><td> Cosmo Bio Co </td><td> DCB-414.893 </td><td></td></tr><tr><td> Cassette elektroforeseapparaat </td><td> Cosmo Bio Co </td><td> DCB-303111 </td><td></td></tr><tr><td> Elektroforese Voeding EPS 301 </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Q Emerald 300 Glycoproteïne Stain Kit </td><td> Invitrogen </td><td> P-21857 </td><td></td></tr><tr><td> Brilliant Blue R </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B0149 </td><td></td></tr><tr><td> AlphaImager HP System </td><td> Cel Biosciences </td><td> 92-13823-00 </td><td></td></tr></tbody></table>

identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylatie, de toevoeging van covalent gebonden suikers, is een belangrijke post-translationele modificatie van eiwitten die een belangrijke invloed kan processen zoals celadhesie, moleculaire mensenhandel, klaring, en signaaltransductie 1-4. In eukaryoten, de meest voorkomende glycosylering wijzigingen in de secretieroute zijn toevoegingen om tot consensus te asparagine residu&#39;s (N-linked), of op serine of threonine residu&#39;s (O-linked) (figuur 1). Inleiding van N-glycan synthese is sterk geconserveerd in eukaryoten, terwijl de eindproducten kan sterk variëren tussen verschillende soorten, weefsels, of eiwitten. Sommige glycanen blijven ongewijzigd (&quot;high mannose N-glycanen&quot;) of worden verder verwerkt in de Golgi (&quot;complexe N-glycanen&quot;). Een grotere diversiteit is gevonden voor O-glycanen, die beginnen met een gemeenschappelijke N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residu in dierlijke cellen, maar verschillen in lagere organismen 1. ENT &quot;&gt; De gedetailleerde analyse van de glycosylering van eiwitten is een gebied op zich en vereist uitgebreide middelen en expertise om goed uit te voeren. Maar een verscheidenheid van beschikbare enzymen die te verwijderen suikers (glycosidasen) mogelijk maakt om een ​​algemeen idee van de glycosylering status van . een eiwit in een standaard laboratorium instelling Hier illustreren we het gebruik van glycosidases voor de analyse van een model glycoproteïne:. recombinant humaan choriongonadotrofine beta (hCGβ), die twee N-glycanen en vier O-glycanen 5 draagt ​​De techniek vereist slechts eenvoudige instrumentatie en typische verbruiksgoederen, en het kan gemakkelijk worden aangepast aan de analyse van veelvoudige glycoproteïne monsters. Verschillende enzymen kan worden gebruikt in parallel met een glycoproteïne studie. PNGase F is in staat om vrijwel alle soorten van N-gekoppelde glycanen 6,7 te verwijderen. Voor de O-glycanen, is er geen beschikbare enzym dat kan splijten een intact oligosaccharide van the eiwit ruggengraat. In plaats daarvan worden O-glycanen geknipt exoglycosidases om een korte kern, die dan gemakkelijk verwijderd worden door O-glycosidase. De Protein deglycosylatie Mix bevat PNGase F, O-glycosidase, neuraminidase (sialidase), β1-4 galactosidase, en β-N-Acetylglucosaminidase. Het wordt gebruikt om tegelijkertijd te verwijderen N-glycanen en enkele O-glycanen 8. Ten slotte werd de deglycosylatie Mix aangevuld met een mengsel van andere exoglycosidases (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 fucosidase, α1-3, 6 galactosidase, en β1-3 galactosidase), die helpen verwijderen anders resistent monosacchariden die aanwezig kunnen zijn in bepaalde O-glycanen. SDS-PAGE/Coomasie blauw wordt gebruikt om verschillen in eiwit-migratie voor en na de behandeling glycosidase te visualiseren. Daarnaast, een suiker-specifieke kleuring methode, ProQ Emerald-300, toont verminderde signaal als glycanen worden successively verwijderd. Dit protocol is ontwikkeld voor de analyse van kleine hoeveelheden glycoproteïne (0,5 tot 2 ug), hoewel enzymatische deglycosylatie kan worden opgeschaald naar grotere hoeveelheden van de eiwitten als nodig is tegemoet te komen.

Het gebruik van specifieke glycosidases om suikers te verwijderen uit glycoproteïnen, gevolgd door SDS-PAGE is een waardevolle methode om glycan wijzigingen op eiwit-samples te detecteren en is een goede keuze voor de eerste glycobiologie studies. Veranderingen na deglycosylatie kunnen worden gedetecteerd als verschuivingen in gel mobiliteit of door kleuring met glycan gevoelige reagentia.

Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

Glycosylering, de toevoeging van covalent gebonden suikers, is een belangrijke post-translationele modificatie van eiwitten die processen aanzienlijk kan beïnvloeden ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om het gebruik van glycosate te illustreren voor de enzymatische deglycosylering en analyse van n- en O-gekoppelde glycosylering op een modelglycoproteïne. Dit wordt bereikt door een glycoproteïne te behandelen met PGA's F of met de proteïnedeglycosyleringsmix. Daarnaast werd de proteïnedeglycosyleringsmix aangevuld met een mengsel van extra exo-glycosidasen, die soms helpen bij het verwijderen van anderszins resistente suikers.We illustreren deze methode aan de hand van een modelglycoproteïne, recombinant humaan choriongonadotropine bèta, of HCG bèta, gevolgd door SDS-PAGE, Coomassie-blauw kleuring en een suikerspecifieke kleuringsmethode. Pro Q Emerald 300 wordt gebruikt om de glycosylering te analyseren. De resultaten van de HCG bèta-monsters laten zien dat HCG bèta heterogeen geglycosyleerd is en meerdere glycovormen bevat, gebaseerd op de verschillen in eiwitmigratie met en zonder glycosidasebehandeling en het afnemende signaal bij ProQ-kleuring naarmate de glycanen opeenvolgend worden verwijderd.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals massaspectrometrie-analyse, is dat deze eenvoudig is, gebruikmaakt van gangbare laboratoriumapparatuur en geschikt is voor de beginnende glycobioloog. Deze methode kan cruciale vragen in het glycoveld beantwoorden, zoals de vraag of een eiwit geglycosyleerd is. Om de enzymatische deglycosylering te starten, ontdooit u de meegeleverde buffers uit de proteïnedeglycosyleringskit.Meng de buisjes grondig en bewaar ze bij kamertemperatuur. Plaats de vials met enzymen op ijs, los de inhoud van de HCG beta vial op in 600 µL gedestilleerd water en bewaar dit op ijs. Bereid één milliliter van een 1X G7-buffer door de 10x stock op te lossen in gedestilleerd water en gebruik vervolgens 25 µL hiervan om 0,5 µL PGA's f te verdunnen.Bereid de exo-glycosidase-mix voor door telkens twee microliters van de vier exo-glycosidases samen te voegen. Voeg vervolgens HCG beta en 10 x glycoproteïne-denaturatiebuffer toe aan zeven genummerde PCR-buisjes zoals aangegeven in het schriftelijke protocol, sluit de buisjes en meng voorzichtig. Denatureer de eiwitten in de thermocycler door 10 minuten te incuberen bij 94 degrees Celsius, gevolgd door een hold bij four degrees Celsius. Centrifugeer de buisjes na het verwijderen uit de thermocycler om eventuele zichtbare condensatie te verwijderen. Voeg aan elk reactiebuisje de resterende reagentia toe volgens het schriftelijke protocol. Sluit de PCR-buisjes met nieuwe dopjes.Meng de buisjes vervolgens door ze vier keer voorzichtig te tikken nadat de inhoud is gecentrifugeerd, plaats de buisjes in de thermocycler en incubeer deze gedurende vier uur bij 37 °C. Koel de monsters daarna af tot 4 °C. Bereid voor de SDS-PAGE verse 3 x reducerende SDS-laadbuffer.Voeg met DTT 12,5 µL van de bereide drie x reducerende SDS-laadbuffer toe aan elk monster, sluit de buisjes met nieuwe doppen en tik zachtjes tegen de buisjes om te mengen. Incubeer de buisjes in een thermocycler bij 94 °C gedurende vijf minuten en koel ze vervolgens af tot 4 °C. Laad na incubatie 30 µL van elk monster en 10 µL van de eiwitmarker op een 10 tot 20% tri-glycine gel. Bewaar het resterende deel van elk monster.Voer elektroforese uit op de gel bij 130 volt totdat het kleurfront zich nabij de onderkant van de gel bevindt. Wanneer de run is voltooid, verwijder dan de gel uit de mal en plaats deze in een kleine plastic bak met voldoende kumasi blue-kleuringsvloeistof om de gel volledig te bedekken. Laat de gel gedurende één uur kleuren onder milde agitatie.Was drie keer gedurende 30 minuten. Leg de beelden vast met een witlicht-transilluminator of scanner in 50 milliliter detain-oplossing. Als alternatief kan de gel worden gedroogd tussen vellen cellofaan.Laad in een frame het resterende deel van elk monster en een eiwitmarker op een 10 tot 20% Tri-glycine gel terwijl de gel loopt. Los het ProQ emerald-reagens op met DMF en bereid de stock-fixeer-, was- en oxidatielösungen voor de kleuring volgens de producthandleiding die bij de kit is geleverd. Wanneer de elektroforese is voltooid, verwijder dan de gel uit de mal en plaats deze in een plastic bak.Fixeer de gel door 100 milliliters van de bereide fixeeroplossing toe te voegen. Laat de gel een nacht bij kamertemperatuur staan onder milde agitatie. Was de gel gedurende 10 tot 20 minuten bij kamertemperatuur met 100 milliliters van de bereide wasoplossing onder milde agitatie, en herhaal deze wasstap een tweede keer met verse wasoplossing.Oxideer vervolgens de koolhydraten door de gel 30 minuten met zachte agitatie te incuberen in 25 milliliters van de bereide oxidatielosuning, gevolgd door twee extra wasbeurten terwijl de gel wordt gewassen. Bereid verse ProQ emerald 300-kleurstof door 500 microliters ProQ Emerald 300-reagensoplossing toe te voegen aan 25 milliliters van de in de kit meegeleverde kleuringsbuffer. Kleur de gel door deze na de gelkleuring 90 tot 120 minuten onder donkere omstandigheden met zachte agitatie te incuberen in de bereide kleurstof.Herhaal de twee wasstappen zoals eerder beschreven. Leg vervolgens de beelden vast met een UV-transilluminator bij 300 nanometers. Vergelijk als laatste stap de beelden van de met Coomassie gekleurde gel met de ProQ Emerald-gekleurde gel.De veranderingen in eiwitmigratie na enzymatische deglycosylering zijn zichtbaar wanneer het controlemonster wordt vergeleken met de F-behandeling van PGA. Om n-glycanen te verwijderen en bij de behandeling met de deglycosyleringsmix om n- en O-glycanen te verwijderen, is er geen verdere afname in grootte waarneembaar na digestie met aanvullend glycosate. Naast een verandering in massa worden de banden scherper naarmate de glycanen worden verwijderd.Een band die onder de marker van 17 kilodalton loopt, stelt waarschijnlijk het volledig deglycosyleerde HCG beta-polypeptide voor. Banen vijf tot en met zeven tonen de banden die overeenkomen met de Glyco. Andere banden kunnen afkomstig zijn van onvolledige deglycosylering of van meerdere niet-geïdentificeerde eiwitten die aanwezig zijn in het HCG beta-monster.Het smaragdgroene reagens oxideert en kleurt alle glycanen die in een eiwitmolecuul aanwezig zijn. Daarom neemt de intensiteit van het signaal af naarmate HCG beta enzymatisch wordt gedeglycosyleerd. Het residuele signaal in baan drie en vier duidt op de aanwezigheid van glycaanmotieven die resistent zijn tegen de gebruikte enzymen.Het aanvullende glycosaat wordt gebruikt in baan vier. Verwijder een paar extra suikerresiduen. De eiwitmigratie is gelijk, maar er is een lichte afname in kleuringsintensiteit zichtbaar.Resistente suikergroepen waren niet aanwezig in alle eiwitsoorten. Sommige banden werden niet gedetecteerd door Emerald Green, wat erop wijst dat deze uitgebreid waren deglycosyleerd. Aanvullende gegevens ondersteunen de conclusie dat HCG beta heterogeen geglycosyleerd is. De onderste band in baan twee is zwak zichtbaar op de Emerald Green-afbeelding.Hoewel de bovenste band in baan twee helder is, wat aangeeft dat er nog veel GLYCAN-groepen aanwezig zijn, ondersteunen deze gegevens de conclusie dat recombinant HCG beta dat tot expressie is gebracht in muiscellen meerdere glycovormen bevat vanwege de inherente heterogeniteit van glycosylering. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals massaspectrometrie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: wat is de bezettingsgraad? Wat is de mate van glycosylering, of wat is de fijnstructuur van de glycanen?Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u glycosylate kunt gebruiken voor de enzymatische deglycosylering en analyse van NNO-gekoppelde glycanen op glycoproteïnen. De keuze van de detectiemethode kan lastig zijn, omdat eiwitkleuringen alleen nuttig zijn als de deglycosylering leidt tot een significante verschuiving in de moleculaire massa voor andere eiwitten.Wij hebben abnormale migraties waargenomen na deglycosylering en hebben vastgesteld dat elke verandering in de migratie een bewijs is dat het eiwit is gedeglycosyleerd.

identification-characterization-protein-glycosylation-using-specific

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een methode voor de analyse van de verandering van N-gekoppelde glycanen door het vroege leven van glycoproteïnen na hun biosynthese in zoogdiercellen. Dit wordt bereikt door pulse-chase analyse van metabolisch gelabeld glycanen, enzymatische vrijlating uit glycoproteïnen en onderzoek door HPLC.

Pulse-chase analyse van N-gebonden suikerketens van glycoproteïnen in zoogdiercellen

Een specifieke en gevoelige methode om inzicht te krijgen in de expressie profiel van glycosfingolipiden antigenen in het immuunsysteem organen en cellen wordt beschreven. De methode maakt gebruik van de ion trap massaspectrometrie waardoor stapsgewijze versnippering van glycosfingolipiden moleculen voor structurele analyse in vergelijking met chemisch gesynthetiseerde standaard.

Massaspectrometrische analyse van glycosfingolipiden antigenen

Om de diversiteit van O-gekoppelde glycanen grondig te onderzoeken, wordt een nieuwe procedure voor in-gel reducerende β-eliminatie, gecombineerd met permethylering en een snelle fase-verdelingsmethode, toegepast op de analyse van O-gekoppelde glycanen die direct vrijkomen uit glycoproteïnen opgelost door SDS-PAGE en bruikbaar voor verdere glycomics-analyse door massaspectrometrie.

Verbeterde In-gel Reductive β-eliminatie voor Comprehensive O-gebonden en Sulfo-glycomics door massaspectrometrie

Een hoogdoorvoerprotocol werd ontwikkeld voor gecombineerde proteomics en glycomics zuivering en LC-MS/MS kwantificering in plasma. Deamidatie-analyse van N-gekoppelde glycosyleringsmotieven was specifiek voor degekoppelde sites. Nauwkeurige kwantificering van N-glycanen werd bereikt door filterondersteunde N-glycaanscheiding te koppelen aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met glycaanhydrazide-tagsstrategie.

Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

Dit artikel beschrijft een methode cardiovasculaire weefselmonsters voor MS analyse mogelijk maakt (1) de analyse van ECM eiwitsamenstelling, (2) het identificeren van glycosyleringsplaatsen, en (3) de samenstelling karakterisering van glycan vormen moeten worden bereid. Deze methodologie kan worden toegepast, met kleine modificaties, voor de studie van de ECM in andere weefsels.

Glycoproteoomanalyses van de extracellulaire matrix: Een methode voor Intact Glycopeptide analyse met behulp van massaspectrometrie

Open zoeken maakt de identificatie van glycopeptiden versierd met voorheen onbekende glycaansamenstellingen mogelijk. In dit artikel wordt een gestroomlijnde aanpak voor het uitvoeren van open zoekopdrachten en daaropvolgende glycaangerichte glycopeptide-zoekopdrachten gepresenteerd voor bacteriële monsters met behulp van Acinetobacter baumannii als model.

De toepassing van open zoekgebaseerde benaderingen voor de identificatie van Acinetobacter baumannii O-gebonden glycopeptiden

Dit protocol beschrijft de glycomics-geleide glycoproteomics-methode, een geïntegreerde omics-technologie die uitgebreide inzichten biedt in het heterogene glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen die nodig zijn om de glycobiologie van kankers beter te begrijpen.

Glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen 

Hier beschrijven we een nieuwe kwantitatieve proteomics-techniek voor het identificeren van eiwitcomplexen in Saccharomyces cerevisiae. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de SILAC methode, samen met affiniteit zuivering, gevolgd door tandem massaspectrometrie te identificeren met een hoge specificiteit van de binding partners van een ER-eiwit, Scs2p.

Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

Een kort protocol voor eiwitkleuring met Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels wordt beschreven zonder gebruik te maken van organische oplosmiddelen of azijnzuur als in de klassieke kleuren procedures met CBB.

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

De bijhorende video beschrijft het gebruik van de GELFREE 8100 Fractionation System, welke partities complex eiwit monsters op basis van moleculair gewicht en herstelt de fracties in de vloeibare fase. De video beschrijft hoe de technologie werkt, hoe het wordt gebruikt, en biedt resulterende data, met polyacrylamidegelelektroforese analyse van gefractioneerde runderen leverhomogenaat.

Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery

Leer enzymatische deglycosylering van glycoproteïnen met specifieke glycosidases voor analyse van N- en O-gekoppelde glycosylering. Deze methode gebruikt SDS-PAGE en specifieke kleuringstechnieken om glycaanmodificaties te bestuderen.

Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

Meer video's verkennen