Name: Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Leer ChIA-PET voor chromatine-interactieanalyse en transcriptieregulatie. Deze methode combineert chromatine-immunoprecipitatie met nabijheidsligatie om genoombrede lange-afstandsinteracties in kaart te brengen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs worden ondersteund door A * STAR van Singapore. Daarnaast wordt MJF ondersteund door een A * STAR National Science Scholarship, een L&#39;Oreal For Women in Science National Fellowship en een Lee Kuan Yew post-doctorale beurs. YR wordt ondersteund door NIH CODEREN subsidies (R01 HG004456-01 en R01 HG003521-01). De auteurs erkennen ook de videografie team van 8 pixels Productions, Singapore, in het bijzonder de heer Kelvin Issey, de heer Chang Kai Xiang en de heer Sherwin Gan voor het filmen van de scènes, mevrouw Siti Rahim voor videobewerking en mevrouw Michelle Teo voor de voice-over.

<ol><li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SATB1+packages+densely+looped%2C+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li>
<li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li>
<li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li>
<li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li>
<li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li>
<li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li>
<li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22(2010).</li>
<li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li>
<li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12(2007).</li>
<li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li>
<li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
<li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+at+a+distance%3A+DNA-looping+and+initiation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li>
<li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li>
<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Chia-PET is een methode ontwikkeld om lange afstand interacties in transcriptieregulatie te identificeren. Een van de kritische factoren die de kwaliteit van een Chia-PET-bibliotheek te bepalen, is de kwaliteit van ChIP materiaal. Het protocol in beeld omvat het gebruik van EGS en formaldehyde te verknopen de cellen. Het gebruik van formaldehyde gecombineerd met een tweede reagens verknopen met een langere spacer arm kunnen helpen bij de binding van eiwitten die niet kunnen worden gebonden formaldehyde alleen 3,11,15. Wij hebben gebouwd bibliotheken met deze methode, die hebben aangetoond robuuste bindingsplaatsen en lange afstand interacties 9. Echter, de verknoping en chip voorwaarden moet worden geoptimaliseerd voor elke factor van belang, en het is belangrijk niet te over-crosslink als te veel verknoping zal resulteren in problemen met fragmentatie door sonicatie, en mogelijk kan resulteren in valse chromatine interacties . Chromatine interactiesgeïdentificeerd door Chia-PET moet gevalideerd worden door een andere methode, zoals fluorescentie in-situ hybridisatie 4. We raden een minimum van 100 ng van chromatine materiaal. Hoewel we hebben gebouwd van goede kwaliteit bibliotheken uit 50 ng van chromatine materiaal, hebben we vastgesteld dat grote hoeveelheden uitgangsmateriaal mag de bouw van Chia-PET bibliotheken met minder dan 16 PCR-cycli, om zo amplicons en redundantie van elke bibliotheek. Deze lagere redundantie geassocieerd met meer unieke toegewezen labels en een hoog percentage aan gegevens, waardoor een vollediger chromatine interactie kaart met minder banen van sequencing. De laatste verpakt volume van kralen in elke buis moet 50 pl en 100 ul voor magnetische en Sepharose kralen respectievelijk. Als het verpakte kraal volume kleiner is dan aangegeven, te brengen tot het minimum vol volume met dezelfde pre-goedgekeurde blanco magnetische of Sepharose kralen om het verlies van DNA-dragende kraal een minimum te beperkens in latere stappen. Afgezaagde tips of grote-core tips moet worden gebruikt voor het pipetteren Sepharose kralen. De volgende wijzigingen zijn verwerkt naar aanleiding van de eerder gepubliceerde Chia-PET-protocol 5. Ten eerste zijn magnetische G kralen die voor de monsterneming verlies te minimaliseren tijdens het wassen. Bovendien identificeerden we niet-specifieke banden met afmetingen van ongeveer 100 bp en 138 bp zijn amplicons van zelf-geligeerde half-linkers en / of adapters. Daarom hebben we verminderde concentratie van gebiotinyleerde half-linkers en 454 GS20 adapters niet-specifieke banden minimaliseren PCR amplificatie. De nabijheid ligatie volume werd teruggebracht van 50 ml tot 10 ml tot monster verlies te minimaliseren tijdens de daaropvolgende zuivering stappen en ook besparen op de kosten reagens. We hebben ook verhoogde de incubatietijd naar Chia-PET DNA geïmmobiliseerd om de parels tot de maximale vangst van Chia-PET-DNA op de streptavidine kralen te garanderen. In de nabijheid ligatie stap chimère ligaties that niet het ware in vivo chromatine interacties onvermijdelijk opgewekt in een niet-specifieke en willekeurige wijze. Derhalve de kwaliteit van gegevens van een chia-PET experiment evalueren, wordt de snelheid van chimerisme geschat uit het gebruik van twee verschillende halve linkers specifieke nucleotide barcodes TAAG en ATGT 5. Na high-throughput sequencing, de chia-PET sequenties eerst geanalyseerd linker barcode samenstelling en sequenties afgeleid van specifieke ligatieproducten en aspecifieke ligatieproducten onderscheiden 8. Het percentage van bekende hersenschimmen (dat wil zeggen heterodimeren AB linkers) die aanwezig zijn in onze in-house MCF-7 RNA polymerase II Chia-PET bibliotheken is minder dan 15%. Chia-PET-sequenties worden vervolgens ingedeeld in twee categorieën, namelijk zelf-ligatie de persoonlijke levenssfeer en inter-ligatie levenssfeer. Self-ligatie Huisdieren zijn verkregen uit zichzelf circularization ligatie van de chromatine fragmenten en daarbij onder-ligatie Huisdieren zijn afgeleid van inter-ligatie tussen twee DNA-fragmenten. Dit laatste is dan onderverdeeld in drie verschillende categorieën op basis van de genomische afstand van elke tag op hetzelfde chromosoom (intrachromosomale inter-ligatie PET&#39;s) of dat beide tags zijn toegewezen aan twee verschillende chromosomen (interchromosomal inter-ligatie huisdieren). We hebben een Chia-PET hulpmiddel softwarepakket te sorteren op de verschillende categorieën 8. Dit wordt gebaseerd op DNA-fragmenten die in de bibliotheek. In het algemeen zal kleiner ChIP fragmenten geven een hogere resolutie en de afgesneden voor deze RNA-polymerase II Chia-PET bibliotheken is ongeveer 4 kb. Bovendien echte chromatine interacties kunnen worden onderscheiden van ruis door telling van het aantal onderling ligatie technologieën in een interactie cluster, met andere woorden een cluster van hoge PET aantal aldus een hogere kans een echt chromatine interactie 8 hebben . Om onze valse positieven te filteren eenstijgen van hoog verrijkt ankers die onder-ligatie persoonlijke levenssfeer kunnen vormen door toeval, heeft een statistische analyse kader ook is geformuleerd om goed voor willekeurige vorming van een inter-ligatie gezelschapsdieren tussen twee ankers 8. Kortom, de Chia-PET-techniek maakt het mogelijk in kaart brengen van chromatine interactie netwerken op een wereldwijde schaal. De implementatie van ChIP in Chia-PET kan de vermindering van de bibliotheek complexiteit en achtergrondgeluiden. Bovendien ChIP voegt specificiteit van chromatine interacties, waardoor het onderzoek van specifieke chromatine interacties bij bepaalde transcriptiefactoren 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 4-20% gradiënt TBE gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6225BOX </td><td> Stap B 6,3 </td></tr><tr><td> 5 x T4 DNA ligase buffer met PEG </td><td> Invitrogen </td><td> 46300018 </td><td> Stap B, 2.2 </td></tr><tr><td> 6% TBE gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6263BOX </td><td> Stap B 6,8 </td></tr><tr><td> Agilent DNA-100 test </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> Stap B, 7.1 </td></tr><tr><td> Agilent Hoge gevoeligheid DNA-test </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Agilent Bioanalyzer 2100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> Centrifugeer Tube Filters (Spin-X) </td><td> Corning &lt;/ Td&gt; <td> CLS8160 </td><td> Stap B, 3.7 en 6.9 </td></tr><tr><td> Dark Reader transilluminator </td><td> Clare Chemisch Onderzoek </td><td> DR46B </td><td> Stap B 6,8 </td></tr><tr><td> Digitale Sonifier Cell Disrupter </td><td> Branson </td><td> 450D-0101063591 </td><td> Stap A, 4,3 </td></tr><tr><td> DynaMag-2 magneet (Magnetic Particle Concentrator) </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td> Stap A, 7.5.1 Stap B, voor alle magnetische korrels wasstappen </td></tr><tr><td> DynaMag-15 Magneet (Magnetic Particle Concentrator) </td><td> Invitrogen </td><td> 123.01D </td><td> Stap A, 5 en 6 </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR (Magnetic Particle Concentrator) </td><td> Invitrogen </td><td> 49-2025 </td><td> Stap B 6,5 </td></tr><tr><td> Escherichia coli DNA polymerase I </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td> Stap B 5,6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </td&gt; <td> Stap A, 7.5.1 Stap B, 4.3 en 6.5 </td></tr><tr><td> Illumina CBOT Cluster Generation System </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td> Stap B, 7.4 </td></tr><tr><td> Illumina Genome Analyzer IIx </td><td> Illumina </td><td> SY-301-1301 </td><td> Stap B, 7,5 </td></tr><tr><td> Illumina PE primers </td><td> Illumina </td><td> PE-102-1004 </td><td> Stap B, 5.4 (indien nodig) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer </td><td> Palico Biotech </td><td> RM-2L </td><td> Stap B, een incubatie met rotatie </td></tr><tr><td> LightCycler 480 Real-time PCR-systeem </td><td> Roche </td><td> 04 640 268 001 </td><td> Stap A, 7.5.3 Stap B, 7,3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR Green I MasterMix </td><td> Roche </td><td> 03 752 186 001 </td><td> Stap B, 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 Streptavidine Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 11206D </td><td> Stap B, 5,2 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Magnetische (Dynabeads) Proteïne G </td><td> Invitrogen </td><td> 100.03D </td><td> Stap A, 5.1.1 en 5.2.1 </td></tr><tr><td> MaXtract High Density (2 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129056 </td><td> Stap A, 7.5.1 </td></tr><tr><td> MaXtract High Density (50 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129073 </td><td> Stap B, 4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> RNase ONE Ribonuclease </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> Stap B, 4.8 </td></tr><tr><td> RNA polymerase II (8WG16) monoklonaal antilichaam </td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td> Stap A, 5.2.4 </td></tr><tr><td> Oak Ridge centrifugebuis (polypropyleen) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> Stap A, 3.1 </td></tr><tr><td> Oak Ridge centrifugebuis (Teflon FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> Stap B, 4.3 </td></tr><tr><td> Phusion High Fidelity Master Mix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> Stap B, 6 </td></tr><tr><td> Picogreen (Quant-iT) dsDNA Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> P11495 </td><td> Stap A, 7.5.2 </td></tr><tr><td> Polystyreen Ronde Bottom Test Tube </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> Stap A, 4,1 </td></tr><tr><td> Proteaseremmer Cocktail Tabletten (compleet, EDTA-vrij) </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Stap A, 1.6 verder </td></tr><tr><td> Proteïnase K Solution (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> Stap A, 4.4, 7.5.1 Stap B, 4,1 </td></tr><tr><td> T4 DNA ligase </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> Stap B, 2.2, 3.9 en 5.4 </td></tr><tr><td> T4 DNA-ligase buffer (NEB) </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td> Stap B, 3.3 en 3.9 </td></tr><tr><td> T4-DNA-polymerase </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>Stap B 1,2 </td></tr><tr><td> T4 DNA polynucleotidekinase </td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td> Stap B, 3,3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS Kit v5-GA </td><td> Illumina </td><td> FC-104-5001 </td><td> Regenten voor Illumina Genome Analyzer IIx systeem </td></tr><tr><td> TruSeq PE Cluster Kit v2-CBOT-GA </td><td> Illumina </td><td> PE-300-2001 </td><td> om gebruik te maken met de Illumina CBOT Cluster Generation systeem </td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Invitrogen </td><td> S-7585 </td><td> Stap B, 6.3 en 6.8 </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td> Stap B, 6.3 en 6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td colspan="2"> Volgorde </td><td> Reacties </td></tr><tr><td rowspan="2"> Gebiotinyleerde half-linkers A (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal HPLC gezuiverd Interne Biotine dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TAA GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal HPLC gezuiverd </td></tr><tr><td rowspan="2"> Gebiotinyleerde half-linkers B (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT AAC TCC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal HPLC gezuiverd Interne Biotine dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;ATG GTT GGA TAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal HPLC gezuiverd </td></tr><tr><td rowspan="2"> Niet-gebiotinyleerde half-linkers (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;GAT GGC CGC ATC GGA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptor A (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;CCA TCT CCC CAT TGC TCC GTG CATCTG CCT TTC CCC TGT CTC AGN N 3 &#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5&#39;CTG AGA CAG GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG CAG GGA TGA GAT GG 3 &#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adapter B (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;CTG AGA CAC GCA ACA GGG GAT AGG CAA GGC ACA CAG GGG ATA GG 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;ATC CCT CCC TGT GTG CCT CTA TGC TCC CCT GTT GCG TGT CTC AGN N 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina-NN-adapters </td><td> Top </td><td> 5 &#39;ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal HPLC gezuiverd Zie Stap B, 5.4 </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;phos - GAT AAG CGG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal HPLC gezuiverd gefosforyleerd 5 &#39;einde Zie Stap B, 5.4 </td></tr><tr><td> Illumina 1-454 (vooruit) primer (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC CTA TCC CCT GTG TGC CTT G 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td> Illumina 2-454 (achteruit) primer (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA CGG GAT TCC ATC TCA TCC CTG CGT GTC 3&#39; </td><td> 250 nmol schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td> qPCR Primer 1.1 (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG OP 3&#39; </td><td> 10nmole schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td> qPCR Primer 2.1 (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC CGA ATA 3&#39; </td><td> 10nmole schaal PCR-Grade </td></tr><tr><td> Illumina 3-454 sequencing primer (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC CAT CTG CCT TTC CCC TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole schaal HPLC gezuiverd </td></tr><tr><td> Illumina 4-454 sequencing primer (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT CTA TGC TCC CCT GTT GCG TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole schaalHPLC Gezuiverd </td></tr></tbody></table> Tabel oligo en adapters. Order oligo van geïntegreerde DNA Technologies (IDT) en bereid linkers en adapters op dezelfde wijze als eerder beschreven 10. Half-linkers en adapters kunnen vooraf worden bereid en enkele maanden bij -20 ° C.

chromatine interactie analyse met gepaarde-end tag sequencing (chia-pet) voor het in kaart brengen van chromatine interacties en begrijpen transcriptie verordening

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomen zijn georganiseerd in drie-dimensionale structuren, de vaststelling van hogere-orde-conformaties in de microscopisch kleine nucleaire ruimtes 7, 2, 12. Dergelijke architecturen zijn niet willekeurig en actie tussen genpromoters en regulerende elementen 13. De binding van transcriptiefactoren specifieke regulerende sequenties brengt een netwerk van transcriptie-regulatie en coördinatie 1, 14. Chromatine Interactie Analyse door Gekoppeld-End Tag Sequencing (Chia-PET) is ontwikkeld om te identificeren deze hogere-orde chromatine structuren 5,6. Cellen zijn vast en interactie loci worden opgevangen door covalente DNA-eiwit cross-links. Om niet-specifieke geluid te minimaliseren en de complexiteit te verminderen en om de specificiteit van de chromatine interactie analyse te verhogen, wordt chromatine immunoprecipitatie (ChIP) gebruikt tegen specifiek eiwit factoren om chromatine fragmenten van belang te verrijken voor de nabijheid van ligatie. Ligatie met half-linkers vormt vervolgens covalente banden tussen paren van DNA-fragmenten bij elkaar binnen de afzonderlijke complexen chromatine vastgebonden. De flankerende MmeI restrictie-enzym sites in de half-linkers maken extractie van gepaarde eind-tag-linker-tag constructies (PET&#39;s) op MmeI spijsvertering. Aangezien de halve linkers gebiotinyleerd worden deze constructen PET gezuiverd met streptavidine-magnetische korrels. Het gezuiverde Huisdieren zijn geligeerd met next-generation sequencing adapters en een catalogus van op elkaar inwerkende fragmenten wordt gegenereerd via de volgende generatie sequencers zoals de Illumina Genome Analyzer. Mapping en bio-informatica analyse wordt vervolgens uitgevoerd om ChIP verrijkt bindingsplaatsen en chip-verrijkte chromatine interacties 8 geven. Wij hebben een video om kritische aspecten van de Chia-PET-protocol, in het bijzonder de voorbereiding van de microchip aan te tonen als de kwaliteit van ChIP speelt een belangrijke rol in de uitkomst van een Chia-PET-bibliotheek. Aangezien de protocollenlang, slechts de kritische stappen in de video.

Chromatine Interactie Analyse door Gekoppeld-End Tag Sequencing (Chia-PET) is een methode voor<em&gt; De novo</em&gt; Detectie van chromatine interacties, voor een beter begrip van transcriptionele controle.

Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

Genomen zijn georganiseerd in driedimensionale structuren en nemen hogere-orde conformaties aan binnen de micron-grote nucleaire ruimtes 7, 2, 12. Dergelijke ...

COMIN-interactieanalyse met behulp van powder- en tag-sequencing is een methode voor genoombrede analyse van long-range COMIN-interacties. Kortgezegd noemen we dit magic share pad. Deze methode omvat veel moleculaire biologie-stappen en kan ingewikkeld zijn.Daarom tonen we u in de volgende video enkele van de belangrijkste stappen bij chromatin immunoprecipitatie en de constructie van de library voor ChIA-PET-analyse. Chromatin immunoprecipitatie, bekend als ChIP, is de eerste kritische stap bij het construeren van een ChIA-PET-library. Hier worden chromatinestalen uit celculturen gecrosslinkt, gesoniceerd en geïmmunoprecipiteerd.Aparte aliquoten van chip-DNA worden vervolgens geligeerd aan gebarcodeerde halve linkers, waarna proximity ligatie wordt uitgevoerd. Pets worden vrijgemaakt door restrictiedigestie, gezuiverd op gecoate magnetische beads en geligeerd aan adapters voor next generation sequencing. Chimerische chair pets worden geïdentificeerd via de AB-linkercompositie en tag-flanking.De centrale linkersequenties worden uitgelezen en in kaart gebracht op het genoom. In deze video tonen we het standaard ChIP-protocol dat routinematig in ons laboratorium wordt gebruikt op een borstkankercellijn MCF 7. Uit onze gegevens blijkt dat een hogere ChIP-verrijking met specifieke antilichamen betere ChIP-seq-gegevens oplevert. Daarom raden wij sterk aan om het ChIP-protocol te optimaliseren en de verrijking te valideren via qPCR.Voordat men overgaat tot de constructie van de chromatin-immunoprecipitatie-bibliotheek, worden CF7-cellen gekweekt tot ongeveer 75% confluentie in een weefselkweekschaal van 500 cm², die voor cross-linking ongeveer 20 miljoen cellen bevat. Verwijder het groeimedium en was de cellen twee keer met warme PBS. Fixeer de cellen met vers bereide 1,5 mM EGS gedurende 45 minuten op een rotator bij kamertemperatuur. Voeg formaldehyde toe tot een eindconcentratie van 1% en incubeer gedurende 20 minuten.De efficiëntie van het crosslinken is cruciaal en varieert per cellijn en per eiwit van belang. De concentratie, incubatietijd en temperatuur van het crosslinken moeten worden geoptimaliseerd. Stop de reactie van de crosslinkers door 10 minuten te incuberen met een eindconcentratie van 200 millimol glycine.Verwijder de geneutraliseerde crosslinkers en was tweemaal met koud PBS. Oogst de cellen door de celpellet los te schrapen met een gekoelde tafelcentrifuge. De pellet is nu klaar voor cellyse. Alternatief kan de pellet worden ingevroren bij -80 °C. Als de celpellet is ingevroren, ontdooi deze dan op ijs voordat u verdergaat met de cellyse en resuspendeer de pellet in 0,1% SDS lysebuffer.Centrifugeer de buis bij 4 °C met een gekoelde centrifuge, verwijder het supernatant en herhaal de cellyse. Zodra de nucleaire lyse is uitgevoerd, komt het gecrosslinkte chromatine vrij voordat de chromatinfragmentatie plaatsvindt. De afwezigheid van het kernmembraan maakt het mogelijk om het gecrosslinkte chromatine onder mildere condities te soniceren.Resuspendeer de celkernpellet in 1% SDS lysisbuffer. Breng de suspensie over naar een centrifugebuis voor hoge snelheden. Centrifugeer de buis bij vier graden Celsius.Verwijder nucleair debris via centrifugatie. Het chromatische palet moet er als volgt uitzien. Gebruik een P 1000 pipetpunt om het palet in stukjes te breken en was dit tweemaal met 0,1% SDS lysisbuffer.Centrifugeer de buis bij 4 °C met een gekoelde centrifuge. Het nucleaire pellet is nu klaar voor sonicatie. Als alternatief kan het pellet worden ingevroren bij -80 °C.Breng het palatum over naar een doorzichtige buis. Voeg 0,1% SDS-lysisbuffer toe aan het palatum en verwijder alle luchtbellen. Houd de monsters gedurende de sonicatie koud om oververhitting te voorkomen. Verschillende condities, zoals het buffervolume, de diepte van de probe, de sonicatie-intensiteit, het aantal cycli en de mate van cross-linking, kunnen de sonicatie-efficiëntie beïnvloeden.Voer de omkering van de cross-link uit en verdeel het chromatine in aliquoten met behulp van proteïnase K en run een agarosegel. Om de fragmentatie-efficiëntie te verifiëren, wordt optimalisatie aanbevolen om het gewenste DNA-groottebereik tussen 200 en 600 bp te verkrijgen. Verwijder het cellisat door centrifugatie.Het chromatine is nu gereed om te worden gepre-gecleard met magnetische beads. Alternatief kan het proces worden gestopt bij -80 °C totdat er voldoende chromatine is verzameld. Om een ChIP te starten, worden de beads drie keer gewassen met beads-wasbuffer; deze en toekomstige wasstappen met magnetische eiwitbeads bestaan uit de volgende stappen.Voeg gesoniceerd chromatine toe aan de vooraf gewassen beads en incubeer dit gedurende de nacht bij vier graden Celsius in een aparte buis. Coat de vooraf gewassen beads met antilichaam en incubeer dit gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Was de met antilichaam gecoate beads tweemaal met beads wasbuffer.De hoge complexiteit van het substraat voor proximity ligation leidt onvermijdelijk tot aanzienlijke aspecifieke ruis, waardoor de kosten voor sequencing toenemen. Naast het verminderen van het complexiteitsniveau en de achtergrondruis, hebben we een monoklonaal antilichaam tegen muis RNA-polymerase II gebruikt om chromatine-interacties te identificeren die betrokken zijn bij transcriptieregulatie.Dit maakt het mogelijk om actieve promotoren en hun bijbehorende regulatoire regio's te onderzoeken, wat bijdraagt aan het begrip van efficiënte en mogelijk coöperatieve transcriptie. Verwijder de wasbuffer van de met antilichamen gecoate beads, combineer het vooraf gezuiverde chromatine met de met antilichamen gecoate beads en incubeer dit een nacht bij 4 °C. Na de incubatie overnacht worden de beads onderworpen aan een reeks wasstappen om ongebonden chromatine te verwijderen; resuspendeer de beads vervolgens in een aliquot TE-buffer. Neem een kleine hoeveelheid af voor kwantitatieve analyse en controle van de verrijking. Chromatine-interactieanalyse met behulp van pad- en tag-sequencing is een techniek die is ontwikkeld voor grootschalige de novo analyse van interagerende chromatine-structuren van hogere orde.DNA-fragmenten die zijn verrijkt door chromatinimmunoprecipitatie worden vastgelegd door proximity ligatie. De pad- en tag-strategie wordt toegepast op de constructie van CHI-PET-bibliotheken, die worden gesequenced met high-throughput next-generation sequencing-technologieën. In deze video laten we de kritieke experimentele aspecten van de constructie van CHI-PET-bibliotheken zien.Het eerste deel van de constructie van de bibliotheek omvat het manipuleren van proteïne A- of G-beads, waaraan de DNA-fragmenten gebonden zijn, om de enzymen en het bufferzout te verwijderen. Gebruik na elke enzymatische reactie zachte centrifugatie en een tikkende beweging bij elke wasstap. Pipetteer het supernatant meerdere keren om de opvang van de beads te maximaliseren wanneer deze op een magnetisch element worden geplaatst.Concentrator voor alle incubatiestappen waarbij kralen in het reactiemengsel aanwezig zijn. Bereid de mastermix vooraf en voeg het enzym als laatste toe nadat de kralen homogeen zijn geresuspendeerd. Zorg ervoor dat de kralen gedurende de gehele incubatie goed gemengd blijven. De half-linker oligonucleotiden zijn ontworpen met een interne barcode bestaande uit vier nucleotiden en een herkenningsplaats voor het type IIS-restrictie-enzym MME I.Na het ligeren van de halve linkers aan de gebonden DNA-fragmenten in C-chromatinecomplexen, zullen de interagerende DNA-fragmenten verbonden zijn door een volledige linkersequentie. Deze halve linkers genereren sequenties met heterodimeer ab-linkers, afkomstig van aspecifieke ligatieproducten, of sequenties met homodimeer AA- of BB-linkers, afkomstig van specifieke ligatieproducten. Het gebruik van twee halve linkers met verschillende nucleotide-barcodes maakt daarom het specificeren van verschillende experimenten of replica's mogelijk, evenals het monitoren van de aspecifieke chimeer ligatiesnelheden tussen verschillende chipcomplexen.Het is belangrijk om de reactie op ijs voor te bereiden en de half-linkers voorzichtig op ijs te ontdooien. Meng de half-linkers goed met water en vervolgens met een PEG-bevattende ligasebuffer. Zorg ervoor dat de mastermix goed gemengd is voordat deze wordt gebruikt.Voeg T4 DNA-ligase pas toe aan het gesuspendeerde chip-DNA wanneer de half-linkers en chip-DNA-fragmenten goed gemengd zijn om concatenatie van half-linkers te voorkomen. Sluit de buis af met Parafilm. Incubeer overnacht bij 16 °C onder rotatie. Intacte chromatinecomplexen worden vervolgens van de beads geëlueerd door toevoeging van SDS in buffer EB. Voeg geëlueerd DNA toe om de SDS-concentratie te verlagen en Triton X 100 om alle SDS te quench. De circularisatie van chromatinecomplexen wordt gefaciliteerd door de ligatie van twee half-linkers, waardoor een volledige linkersequentie op de interactiejunctie ontstaat. Ligeer de geëlueerde chromatinecomplexen onder extreem verdunde omstandigheden om ligaties tussen verschillende DNA-proteïnecomplexen te minimaliseren. Voeg T4 DNA-ligase pas toe nadat de geëlueerde chromatinecomplexen voldoende zijn verdund in het reactiemengsel. Na het omkeren van de cross-linking (reverse cross-linking) om DNA-geassocieerde proteïnen te verwijderen, worden de gecirculariseerde DNA-fragmenten gezuiverd middels fenol-chloroformextractie. Gebruik het KaiGen phase lock gelsysteem voor eenvoudige scheiding.Na fenolextractie wordt glyco blue A DNA-carrier gebruikt om de massa en zichtbaarheid van het pellet te vergroten. De linker-oligonucleotiden bevatten flankerende MmeI-herkenningsplaatsen. MmeI is een Type IIS-restrictie-enzym dat 18 en 20 basenparen stroomafwaarts van zijn doelbindingsplaatsen knipt om korte tags van het chromatinefragment te genereren, wat resulteert in PET tag linker tag-constructen, afgekort als pets.Daarnaast is elke helft van de linker gemodificeerd met biotine om zuivering van de pet-constructen met streptavidine-gecoate magnetische kralen mogelijk te maken. Voer één MME-digestie uit om de tag-linkerconstructen vrij te maken. Zuiver de pets via selectieve binding aan streptavidine-kralen en ligeer de pet-constructen met adapters voor high-throughput sequencing.Gebruik fusion DNA-polymerase om de CHI PET Library Fusion te amplificeren. DNA-polymerase wordt gebruikt om templates met een hoge nauwkeurigheid en efficiëntie te genereren. Stel de PCR-reactie koud op en voeg als laatste het fusion DNA-polymerase toe.Aangezien het enzym 3' naar 5' exonuclease-activiteit vertoont, kunnen primers worden afgebroken in de afwezigheid van dNTPs. Als de charset-bibliotheek succesvol is geconstrueerd, moet er een prominente, scherp gedefinieerde band van ongeveer 223 basenparen zichtbaar zijn. Vermijd aspecifieke banden bij het uitsnijden van de band van 223 basenparen uit de gel en zuiver de uitgesneden band met behulp van het Gel Crush-protocol.Voer een kwaliteitscontrole uit met een Agilent 2, 100 bioanalyzer met een DNA 1000-kit voorafgaand aan high-throughput sequencing. We hebben zojuist de CHI PET-procedure gedemonstreerd voor de onbevooroordeelde detectie van genoombrede chromatine-interacties. De kwaliteit van CHI PET-gegevens hangt af van de effectiviteit van het gebruikte chip-antilichaam en de sequencing-diepte.Hier gebruiken we 18 tot 20 miljoen reads voor interactie-mapping. Dit specifieke protocol is succesvol gebruikt om chromatine-interactienetwerken te karakteriseren die gebonden zijn door de oestrogeenreceptor en RNA-polymerase in het menselijke genoom. Wij voorzien dat deze assay een krachtig instrument zal zijn voor toekomstige studies naar de driedimensionale architectuur van transcriptiebiologie in de context van het gehele genoom.We hopen dat deze video nuttig voor u zal zijn. Bedankt voor het kijken.I.

chromatin-interaction-analysis-with-paired-end-tag-sequencing-chia

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De combinatie van chromatine immunoprecipitatie en ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) kan identificeren en in kaart eiwit-DNA-interacties in een bepaald weefsel of cellijn. Geschetst is hoe je een hoge kwaliteit ChIP sjabloon voor de daaropvolgende sequencing, met ervaring met de transcriptiefactor TCF7L2 als een voorbeeld te genereren.

Generatie van hoge kwaliteit Chromatine immunoprecipitatie DNA Template voor High-throughput sequencing (ChIP-seq)

De vraag hoe chromatine toezichthouders en chromatine staten van invloed op het genoom in vivo is de sleutel tot ons begrip van hoe vroeg lot van de cel beslissingen worden genomen in het zich ontwikkelende embryo. ChIP-Seq-de meest populaire benadering van chromatine functies onderzoeken op mondiaal niveau wordt hier geschetst voor Xenopus embryo.

Genoom-brede Snapshot van chromatine regelgevers en staten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryo&#39;s van Chip-Seq

Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek voor de identificatie van DNA-bindingsplaatsen van Arabidopsis eiwitten in vivo. Deze procedure omvat chromatine verknoping en fragmentatie, selectieve immunoprecipitatie met antilichamen tegen het eiwit van belang en qPCR analyse van gebonden DNA. We beschrijven een eenvoudige ChIP assay geoptimaliseerd voor Arabidopsis planten.

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde high-throughput ChIP-sequencing protocol en computationele analyses pijpleiding voor de bepaling van genoom-brede chromatine staat patronen uit bevroren tumor weefsels en cellijnen.

Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels

Hier beschrijven we methoden voor het uitvoeren van ChIP-Seq en CARIP-Seq, met inbegrip van de voorbereiding van de bibliotheek van next-generation sequencing, voor het genereren van wereldwijde epigenomic en chromatine-geassocieerde RNA kaarten in ES-cellen.

CARIP-Seq en ChIP-Seq: methoden voor het identificeren van de chromatine-geassocieerde RNAs en eiwit-DNA interacties in embryonale stamcellen

De identificatie van de fysieke interacties tussen genen en regelgevende elementen is uitdagend maar heeft bevorderd door chromosoom conformatie opname methoden. Deze wijziging van het 4C-seq-protocol PCR bias vermindert door het minimaliseren van de over-amplificatie van PCR sjablonen en maximaliseert de mappability van leest door het opnemen van een toevoeging restrictie-enzym digest stap.

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

We beschrijven een stapsgewijze protocol voor tandem chromatine immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) waarmee de analyse van cel-type-specifieke genoom-brede Histon wijziging.

TChIP-Seq: Cell-Type-specifieke Epigenome profilering

Nauwkeurige bepaling van eiwitbindende locaties in het genoom is belangrijk voor het begrijpen van genregulatie. Hier beschrijven we een genomische mapping methode die chromatine-immunogeprecipiteerd DNA behandelt met exonucleasevertering (ChIP-exo) gevolgd door sequencing met hoge doorvoer. Deze methode detecteert eiwit-DNA interacties met near base-pair mapping resolutie en hoge signaal-ruisverhouding bij zoogdierneuronen.

Hoge resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muis stamcel-afgeleide neuronen met behulp van chromatine immunoprecipitation-exonuclease (ChIP-Exo)

Hier presenteren we een snel en eenvoudig ATAC-seq-protocol dat geïmplementeerd kan worden in L4-fase Caenorhabditis elegans whole-worm met slechts 30 μL wormpellet.

Chromatine toegankelijkheidsprofilering bij hele Caenorhabditis elegans L4-larven

Hier presenteren we een protocol om RNA-geassocieerde chromatine DNA-DNA interacties vast te leggen voor het in kaart brengen van RNA-gerelateerde driedimensionale genoomorganisatie.

RNA-geassocieerde chromatine DNA-DNA interactie methode

Leer ChIA-PET voor chromatine-interactieanalyse en transcriptieregulatie. Deze methode combineert chromatine-immunoprecipitatie met nabijheidsligatie om genoombrede lange-afstandsinteracties in kaart te brengen.

Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening (Video) | JoVE Journal

Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

Meer video's verkennen