Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

COMIN-interactieanalyse met behulp van powder- en tag-sequencing is een methode voor genoombrede analyse van long-range COMIN-interacties. Kortgezegd noemen we dit magic share pad. Deze methode omvat veel moleculaire biologie-stappen en kan ingewikkeld zijn.

Daarom tonen we u in de volgende video enkele van de belangrijkste stappen bij chromatin immunoprecipitatie en de constructie van de library voor ChIA-PET-analyse. Chromatin immunoprecipitatie, bekend als ChIP, is de eerste kritische stap bij het construeren van een ChIA-PET-library. Hier worden chromatinestalen uit celculturen gecrosslinkt, gesoniceerd en geïmmunoprecipiteerd.

Aparte aliquoten van chip-DNA worden vervolgens geligeerd aan gebarcodeerde halve linkers, waarna proximity ligatie wordt uitgevoerd. Pets worden vrijgemaakt door restrictiedigestie, gezuiverd op gecoate magnetische beads en geligeerd aan adapters voor next generation sequencing. Chimerische chair pets worden geïdentificeerd via de AB-linkercompositie en tag-flanking.

De centrale linkersequenties worden uitgelezen en in kaart gebracht op het genoom. In deze video tonen we het standaard ChIP-protocol dat routinematig in ons laboratorium wordt gebruikt op een borstkankercellijn MCF 7. Uit onze gegevens blijkt dat een hogere ChIP-verrijking met specifieke antilichamen betere ChIP-seq-gegevens oplevert. Daarom raden wij sterk aan om het ChIP-protocol te optimaliseren en de verrijking te valideren via qPCR.

Voordat men overgaat tot de constructie van de chromatin-immunoprecipitatie-bibliotheek, worden CF7-cellen gekweekt tot ongeveer 75% confluentie in een weefselkweekschaal van 500 cm², die voor cross-linking ongeveer 20 miljoen cellen bevat. Verwijder het groeimedium en was de cellen twee keer met warme PBS. Fixeer de cellen met vers bereide 1,5 mM EGS gedurende 45 minuten op een rotator bij kamertemperatuur. Voeg formaldehyde toe tot een eindconcentratie van 1% en incubeer gedurende 20 minuten.

De efficiëntie van het crosslinken is cruciaal en varieert per cellijn en per eiwit van belang. De concentratie, incubatietijd en temperatuur van het crosslinken moeten worden geoptimaliseerd. Stop de reactie van de crosslinkers door 10 minuten te incuberen met een eindconcentratie van 200 millimol glycine.

Verwijder de geneutraliseerde crosslinkers en was tweemaal met koud PBS. Oogst de cellen door de celpellet los te schrapen met een gekoelde tafelcentrifuge. De pellet is nu klaar voor cellyse. Alternatief kan de pellet worden ingevroren bij -80 °C. Als de celpellet is ingevroren, ontdooi deze dan op ijs voordat u verdergaat met de cellyse en resuspendeer de pellet in 0,1% SDS lysebuffer.

Centrifugeer de buis bij 4 °C met een gekoelde centrifuge, verwijder het supernatant en herhaal de cellyse. Zodra de nucleaire lyse is uitgevoerd, komt het gecrosslinkte chromatine vrij voordat de chromatinfragmentatie plaatsvindt. De afwezigheid van het kernmembraan maakt het mogelijk om het gecrosslinkte chromatine onder mildere condities te soniceren.

Resuspendeer de celkernpellet in 1% SDS lysisbuffer. Breng de suspensie over naar een centrifugebuis voor hoge snelheden. Centrifugeer de buis bij vier graden Celsius.

Verwijder nucleair debris via centrifugatie. Het chromatische palet moet er als volgt uitzien. Gebruik een P 1000 pipetpunt om het palet in stukjes te breken en was dit tweemaal met 0,1% SDS lysisbuffer.

Centrifugeer de buis bij 4 °C met een gekoelde centrifuge. Het nucleaire pellet is nu klaar voor sonicatie. Als alternatief kan het pellet worden ingevroren bij -80 °C.

Breng het palatum over naar een doorzichtige buis. Voeg 0,1% SDS-lysisbuffer toe aan het palatum en verwijder alle luchtbellen. Houd de monsters gedurende de sonicatie koud om oververhitting te voorkomen. Verschillende condities, zoals het buffervolume, de diepte van de probe, de sonicatie-intensiteit, het aantal cycli en de mate van cross-linking, kunnen de sonicatie-efficiëntie beïnvloeden.

Voer de omkering van de cross-link uit en verdeel het chromatine in aliquoten met behulp van proteïnase K en run een agarosegel. Om de fragmentatie-efficiëntie te verifiëren, wordt optimalisatie aanbevolen om het gewenste DNA-groottebereik tussen 200 en 600 bp te verkrijgen. Verwijder het cellisat door centrifugatie.

Het chromatine is nu gereed om te worden gepre-gecleard met magnetische beads. Alternatief kan het proces worden gestopt bij -80 °C totdat er voldoende chromatine is verzameld. Om een ChIP te starten, worden de beads drie keer gewassen met beads-wasbuffer; deze en toekomstige wasstappen met magnetische eiwitbeads bestaan uit de volgende stappen.

Voeg gesoniceerd chromatine toe aan de vooraf gewassen beads en incubeer dit gedurende de nacht bij vier graden Celsius in een aparte buis. Coat de vooraf gewassen beads met antilichaam en incubeer dit gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Was de met antilichaam gecoate beads tweemaal met beads wasbuffer.

De hoge complexiteit van het substraat voor proximity ligation leidt onvermijdelijk tot aanzienlijke aspecifieke ruis, waardoor de kosten voor sequencing toenemen. Naast het verminderen van het complexiteitsniveau en de achtergrondruis, hebben we een monoklonaal antilichaam tegen muis RNA-polymerase II gebruikt om chromatine-interacties te identificeren die betrokken zijn bij transcriptieregulatie.

Dit maakt het mogelijk om actieve promotoren en hun bijbehorende regulatoire regio's te onderzoeken, wat bijdraagt aan het begrip van efficiënte en mogelijk coöperatieve transcriptie. Verwijder de wasbuffer van de met antilichamen gecoate beads, combineer het vooraf gezuiverde chromatine met de met antilichamen gecoate beads en incubeer dit een nacht bij 4 °C. Na de incubatie overnacht worden de beads onderworpen aan een reeks wasstappen om ongebonden chromatine te verwijderen; resuspendeer de beads vervolgens in een aliquot TE-buffer. Neem een kleine hoeveelheid af voor kwantitatieve analyse en controle van de verrijking. Chromatine-interactieanalyse met behulp van pad- en tag-sequencing is een techniek die is ontwikkeld voor grootschalige de novo analyse van interagerende chromatine-structuren van hogere orde.

DNA-fragmenten die zijn verrijkt door chromatinimmunoprecipitatie worden vastgelegd door proximity ligatie. De pad- en tag-strategie wordt toegepast op de constructie van CHI-PET-bibliotheken, die worden gesequenced met high-throughput next-generation sequencing-technologieën. In deze video laten we de kritieke experimentele aspecten van de constructie van CHI-PET-bibliotheken zien.

Het eerste deel van de constructie van de bibliotheek omvat het manipuleren van proteïne A- of G-beads, waaraan de DNA-fragmenten gebonden zijn, om de enzymen en het bufferzout te verwijderen. Gebruik na elke enzymatische reactie zachte centrifugatie en een tikkende beweging bij elke wasstap. Pipetteer het supernatant meerdere keren om de opvang van de beads te maximaliseren wanneer deze op een magnetisch element worden geplaatst.

Concentrator voor alle incubatiestappen waarbij kralen in het reactiemengsel aanwezig zijn. Bereid de mastermix vooraf en voeg het enzym als laatste toe nadat de kralen homogeen zijn geresuspendeerd. Zorg ervoor dat de kralen gedurende de gehele incubatie goed gemengd blijven. De half-linker oligonucleotiden zijn ontworpen met een interne barcode bestaande uit vier nucleotiden en een herkenningsplaats voor het type IIS-restrictie-enzym MME I.

Na het ligeren van de halve linkers aan de gebonden DNA-fragmenten in C-chromatinecomplexen, zullen de interagerende DNA-fragmenten verbonden zijn door een volledige linkersequentie. Deze halve linkers genereren sequenties met heterodimeer ab-linkers, afkomstig van aspecifieke ligatieproducten, of sequenties met homodimeer AA- of BB-linkers, afkomstig van specifieke ligatieproducten. Het gebruik van twee halve linkers met verschillende nucleotide-barcodes maakt daarom het specificeren van verschillende experimenten of replica's mogelijk, evenals het monitoren van de aspecifieke chimeer ligatiesnelheden tussen verschillende chipcomplexen.

Het is belangrijk om de reactie op ijs voor te bereiden en de half-linkers voorzichtig op ijs te ontdooien. Meng de half-linkers goed met water en vervolgens met een PEG-bevattende ligasebuffer. Zorg ervoor dat de mastermix goed gemengd is voordat deze wordt gebruikt.

Voeg T4 DNA-ligase pas toe aan het gesuspendeerde chip-DNA wanneer de half-linkers en chip-DNA-fragmenten goed gemengd zijn om concatenatie van half-linkers te voorkomen. Sluit de buis af met Parafilm. Incubeer overnacht bij 16 °C onder rotatie. Intacte chromatinecomplexen worden vervolgens van de beads geëlueerd door toevoeging van SDS in buffer EB. Voeg geëlueerd DNA toe om de SDS-concentratie te verlagen en Triton X 100 om alle SDS te quench. De circularisatie van chromatinecomplexen wordt gefaciliteerd door de ligatie van twee half-linkers, waardoor een volledige linkersequentie op de interactiejunctie ontstaat. Ligeer de geëlueerde chromatinecomplexen onder extreem verdunde omstandigheden om ligaties tussen verschillende DNA-proteïnecomplexen te minimaliseren. Voeg T4 DNA-ligase pas toe nadat de geëlueerde chromatinecomplexen voldoende zijn verdund in het reactiemengsel. Na het omkeren van de cross-linking (reverse cross-linking) om DNA-geassocieerde proteïnen te verwijderen, worden de gecirculariseerde DNA-fragmenten gezuiverd middels fenol-chloroformextractie. Gebruik het KaiGen phase lock gelsysteem voor eenvoudige scheiding.

Na fenolextractie wordt glyco blue A DNA-carrier gebruikt om de massa en zichtbaarheid van het pellet te vergroten. De linker-oligonucleotiden bevatten flankerende MmeI-herkenningsplaatsen. MmeI is een Type IIS-restrictie-enzym dat 18 en 20 basenparen stroomafwaarts van zijn doelbindingsplaatsen knipt om korte tags van het chromatinefragment te genereren, wat resulteert in PET tag linker tag-constructen, afgekort als pets.

Daarnaast is elke helft van de linker gemodificeerd met biotine om zuivering van de pet-constructen met streptavidine-gecoate magnetische kralen mogelijk te maken. Voer één MME-digestie uit om de tag-linkerconstructen vrij te maken. Zuiver de pets via selectieve binding aan streptavidine-kralen en ligeer de pet-constructen met adapters voor high-throughput sequencing.

Gebruik fusion DNA-polymerase om de CHI PET Library Fusion te amplificeren. DNA-polymerase wordt gebruikt om templates met een hoge nauwkeurigheid en efficiëntie te genereren. Stel de PCR-reactie koud op en voeg als laatste het fusion DNA-polymerase toe.

Aangezien het enzym 3' naar 5' exonuclease-activiteit vertoont, kunnen primers worden afgebroken in de afwezigheid van dNTPs. Als de charset-bibliotheek succesvol is geconstrueerd, moet er een prominente, scherp gedefinieerde band van ongeveer 223 basenparen zichtbaar zijn. Vermijd aspecifieke banden bij het uitsnijden van de band van 223 basenparen uit de gel en zuiver de uitgesneden band met behulp van het Gel Crush-protocol.

Voer een kwaliteitscontrole uit met een Agilent 2, 100 bioanalyzer met een DNA 1000-kit voorafgaand aan high-throughput sequencing. We hebben zojuist de CHI PET-procedure gedemonstreerd voor de onbevooroordeelde detectie van genoombrede chromatine-interacties. De kwaliteit van CHI PET-gegevens hangt af van de effectiviteit van het gebruikte chip-antilichaam en de sequencing-diepte.

Hier gebruiken we 18 tot 20 miljoen reads voor interactie-mapping. Dit specifieke protocol is succesvol gebruikt om chromatine-interactienetwerken te karakteriseren die gebonden zijn door de oestrogeenreceptor en RNA-polymerase in het menselijke genoom. Wij voorzien dat deze assay een krachtig instrument zal zijn voor toekomstige studies naar de driedimensionale architectuur van transcriptiebiologie in de context van het gehele genoom.

We hopen dat deze video nuttig voor u zal zijn. Bedankt voor het kijken.I.