Name: Muizenmodel van Allergen Induced Astma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Leer een muizenmodel van allergie-geïnduceerde astma met ovalbumine-sensibilisatie en luchtweguitdaging. Deze methode meet methylcholine-respons en IgE-niveaus voor onderzoek naar astma-therapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH Grant HL093196 (RCR) en de Atlanta onderzoek en onderwijs Foundation (AREF).

I. allergenen Sensibilisatie en Challenge (zie figuur 1) A. Voor intratracheale Challenge <ol><li> Voor de eerste sensibilisatie, injecteren mannelijke of vrouwelijke C57BL / 6 of BALB / c muizen (6-8 weken oud) intraperitoneaal op dag 0 en weer op dag 7 met 20 ug ovalbumine (OVA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) geëmulgeerd in 0,2 ml steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) die 2 mg aluminiumhydroxide (Sigma-Aldrich) of met 2 mg aluminiumhydroxide in 0,2 ml steriele PBS als controle. </li><li> Challenge met antigeen geval (bijvoorbeeld op dag 14, 16, 18 en 20). Challenge geschiedt. </li><li> Verdoven muis met een intraperitoneale (ip) injectie van een mengsel van ketamine (90 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Zorg ervoor dat de muis is volledig onder narcose gebracht voor ten minste 10 minuten. </li><li> Hoek werking oppervlak 45 graden of meer. Plaats de muis op dit oppervlak te houden ventrale zijde naar boven en het hoofd aan de bovenkant. </li><li> Hook thread onder voor-snijtanden in te houden hoofd. Zet de poten met elkaar om ervoor te zorgen de luchtpijp recht is en het gebruik tape om de benen te houden. Opnemen chirurgische site met 70% EtOH en wattenstaafje. </li><li> Topicaal aanbrengen bupivicaine (0,1 tot 0,2 ml 0,25% oplossing) bij de snede. </li><li> Nip huid op de keel met een pincet en trek voorzichtig naar buiten. Maak een kleine verticale incisie met chirurgische schaar. Minimaliseer grootte van de incisie. </li><li> Bereid een 1 ml spuit met 50 ul PBS of 0,1% OVA in PBS en plaats deze in een zich herhalend pipet (Tridak Stepper, Torrington, CT). Neem de pipet in de ene hand en gebruik de andere om het weefsel terug te houden met de pincet en bloot de luchtpijp. </li><li> Houd de spuit als parallel aan de luchtpijp mogelijk te maken, steek de naald door de luchtpijp muur en injecteer de oplossing. </li><li> Houd de muis in een verticale oriëntatie na injectie op tijd voor oplossing om zich te vestigen in de longen mogelijk te maken. </li><li> Voorzichtig en steriel dicht wond metpincet en afdichting met hechtdraad. </li><li> Plaats de muis borstbeen naar beneden op een verwarmingselement en laat zich te herstellen tot ze volledig ambulant. Na herstel, terug te keren met de muis om het dier zorginstelling en bewaken het dagelijks op tekenen van seroom, ontsteking of infectie, en wonddehiscentie totdat de wond geheel genezen is. </li></ol> B. Voor de Challenge door Verneveling <ol><li> Sensibiliseren muizen op dag 0 door intraperitoneale injectie van 20 pg van OVA (Sigma-Aldrich) geëmulgeerd in 0,2 ml steriele PBS dat 2 mg aluminiumhydroxide (Sigma-Aldrich) of met 2 mg aluminiumhydroxide in 0,2 ml steriele PBS als controle . </li><li> Op dag 14, te verhogen bij opname door ip injectie zoals hierboven beschreven. </li><li> Op de 21 e, 22 e, 23 e, 24 e en 25 e dag na de eerste sensibilisatie, uitdaging muizen door blootstelling gedurende 30 minuten tot 1% vernevelde OVA of PBS alleen geleverd via een ultrasone vernevelaar (Buxco Research Systems, Wilmington, NC). </li><li> Plaats muizen in de belangrijkste kamer van WBP; acclimatiseren ze binnen de plethysmografie kamer gedurende ten minste 10 minuten. </li><li> Plaats 1 ml 0,1% OVA in steriele PBS of steriele PBS alleen, zoals in onderstaande stappen 4-6, via een verstuiver kop. Verstuiven gedurende 30 minuten. </li><li> Verwijder de vernevelaar beker en gooi de resterende oplossing. </li><li> Verneveling kan worden uitgevoerd op alle muizen gelijktijdig met een verneveling kamer. </li></ol> II. Bepaling van de luchtwegen hyperreactiviteit voor methacholine A. Niet-invasieve meting van luchtwegovergevoeligheid door hele lichaam plethysmografie (WBP; Buxco Research Systems, Wilmington, NC) <ol><li> Laat de poedervorm methacholine fles tot kamertemperatuur opwarmen alvorens te openen (methacholine is zeer hygroscopisch en zal deel nutteloos klonten indien toegestaan ​​om water te absorberen). Bereid een 200 mg / ml stockoplossing in steriele PBS, maak dan serial 2-voudige verdunningen (bijvoorbeeld 100, 50, 25, 12,5 en 60,25 mg / ml). Een oplossing koud. </li><li> Stel, als hieronder: sluit de belangrijkste ingang van WBP te vernevelaar, bias-flow inlaat aan de lucht-pomp, en de WBP afvoer van gas val met behulp van strakke rubber slang. Bevestig drukopnemer tot de verkooppunten van de hoofd-en referentie-kamers van de WBP te overbruggen. Sluit de druksensor aan voorversterker met de bijgeleverde kabels, en sluit voorversterker op de PC met behulp van specifieke data-acquisitie kaart. </li><li> Kalibreer de voorversterker gebruik van de software volgens de aanbevelingen van de fabrikant. </li><li> Plaats muizen in de belangrijkste kamer van WBP; acclimatiseren ze binnen de plethysmografie kamer gedurende ten minste 10 minuten, dan is opname basislijn metingen (Penhbase) gedurende 3 minuten. </li><li> Plaats 1 ml steriele PBS in de vernevelaar beker. Vernevelt gedurende 2 minuten en dan te controleren respiratoire variabelen voor een extra 6 minuten tijdens het drogen fase. Verwijder de vernevelaar beker en gooi de resterende PBS. </li><li> Plaats 1 ml van 6,25 mg / ml methacholine in de vernevelaar beker en rEPEAT verneveling gedurende 2 minuten, plus een 6-minuten controle cyclus. </li><li> Herhaal meting met 12,5, 25, 50 en 100 mg / ml methacholine met dezelfde 2 minuten verneveling periode 6 minuten controle cyclus. </li><li> Verwijder de bladeren van de kamers en terug te geven aan hun kooien. </li><li> Vul vernevelaar beker met 1 ml steriele PBS en de instellingen nogmaals volgorde om de slang te spoelen. </li><li> Schakel de luchtstromen, demonteren, en maak hem schoon alle kamers voordat u een tweede set van dieren. </li></ol> B. invasieve meting van de luchtwegen voor door Computer-gestuurde ventilator (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, Canada) <ol><li> Weeg de muis en het verdoven door intraperitoneale (ip) injectie van 60 mg per kg lichaamsgewicht pentobarbital natrium. </li><li> Na een doeltreffende verdoving, de positie van de muizen Ventro-dorsaal voor tracheostomie. </li><li> Ontsmet de hals huid met 70% ethanol. Topicaal aanbrengen bupivicaine (0,1 tot 0,2 ml 0,25% oplossing) bij het incision site. Incisie en open de hals huid. Scheid de nekspieren en bloot de luchtpijp. </li><li> Maak een 1 - tot 2-mm incisie in de luchtpijp met fijne schaar (zeker niet naar de luchtpijp te verbreken) en voorzichtig plaats de tracheale tube. Bind een hechting rond de luchtpijp naar een luchtlek te voorkomen. </li><li> Leg de muis in het lichaam plethysmograaf kamer en sluit de geplaatste tracheale tube naar de ventilator. </li><li> Start mechanische ventilatie. Stel de juiste ademhaling en getijden / slagvolume (150 slagen / min en 200 ui, respectievelijk voor een 20-g muis). Zorg ervoor dat de borstkas beweegt synchroon met de ventilator. Als de muis is &quot;vechten&quot; met de ventilator (zelf-ademhaling), meer injecteren verdoving en wacht op de synchronisatie. </li><li> Naar aanleiding van nulmetingen, onderhouden muizen onder de uitgangswaarde ventilatie voor nog eens 3 min, en neem dan een 2 e set van impedantie metingen. Deze 2 e set van nulmetingen wordt gebruikt om calculate de gemiddelde uitgangswaarden. </li><li> Lever PBS of methacholine (MCH) uitdagingen (6,25, 12,5, 25, 50 en 100 mg / ml) door channeling inspiratoire flow van de ventilator door middel van een ultrasone vernevelaar. </li><li> Na elke uitdaging met MCh (6,25, 12,5, 25, 50 en 100 mg / ml), terug de zuiger aan het leveren van een VT van 10 ml / kg bij 120 ademhalingen / min en neem impedantie metingen. </li></ol> III. Meting van cellulaire infiltratie in het luchtruim A. Perform bronchoalveolaire lavage (BAL) <ol><li> Na meting van de Ahr, euthanaseren muizen met CO 2, en plaats elke muis op zijn rug op de chirurgische pad. </li><li> Geniet van het gebied met 70% EtOH. </li><li> Beginnend bij de onderbuik, opengesneden de buikholte en verwijder de huid / bovenste spieren, het verplaatsen naar boven in de richting van de ribben. </li><li> Zodra de ribben zichtbaar zijn, u met een schaar voorzichtig doorboren het middenrif. De longen moeten uit de buurt samen te vouwen van het middenrif. Wees vooral careful niet naar nick de longen of het hart. </li><li> Knip de ribbenkast volledig bloot de longen / hart (vermijd het zagen geen grote bloedvaten om bloed te houden van het vullen van de site). </li><li> Met behulp van een 1 ml spuit met een 27 gauge naald (BD spuiten, Franklin Lakes, New Jersey), doorboren het hart ventrikels en langzaam en voorzichtig terug te trekken tegen de spuit om het bloed te verzamelen. Let er op dat instortende het hart. </li><li> Verzamel de serum van dit bloed met een standaardprotocol. Bewaren bij -70 ° C tot gebruik. </li><li> Snijd de huid en weefsel van de keel tot de luchtpijp wordt onthuld. Ruim voldoende weefsel om gemakkelijk te werken binnen het veld (weer, vermijd het snijden van alle belangrijke bloedvaten). </li><li> Met behulp van gebogen schaar, knip in de luchtpijp om een ​​pad te wissen. </li><li> Steek de punt van een gebogen pincet onder de luchtpijp en grijpen het einde van een stuk van hechtdraad. Teken de hechtdraad in de luchtpijp. </li><li> Bind een losse halve knoop over de luchtpijp, laag in de keel. </li><li> Carefully snijden een inkeping, voldoende groot zijn om de canule, boven de hechtdraad. </li><li> Breng de canule in het gat en de luchtpijp voorbij het punt van de hechtdraad. Voorzichtig naar voren drukt u op totdat de canule komt net bij de ingang van de longen (te ver: punctie longen; te kort: ineenstorting luchtpijp bij een poging om te herstellen BAL). </li><li> Draai hechtdraad en volledige knoop om trachea af te dichten rond canule. </li><li> Lock spuit (met 1 ml PBS) op de canule, en voorzichtig op de vloeistof in de long. Longkwabben moet individueel langzaam op te blazen. Doe niet te veel vulling. Voor een volwassen muis 0,9-1,0 ml is het absolute maximum. 0,8 ml kan veiliger. Losjes Lock spuit canule, anders is het waarschijnlijk om schade te veroorzaken bij een poging om los te maken. </li><li> Zuig vloeistof uit longen. Als weerstand wordt ondervonden (weefsel gezogen canule), drukt u canule langzaam verder in de longen en ga verder met het verwijderen. Probeer ook het draaien van de canule op zijn plaats. Als alle else niet lukt, trekken de canule een deel weg, de luchtpijp is veel meer kans om samen te vouwen in dit geval. </li><li> Maak spuit van de canule, stort BAL vloeistof in container, en herhaal 2 keer met verse PBS oplossing. </li><li> Houd de BAL oplossing op ijs tot afgedraaid. </li><li> Gebruik de BAL vloeistof en serum om de OVA specifieke IgE in de handel verkrijgbare muis IgE-ELISA-kits (MD Bioproducts, St. Paul, MN) te meten. </li></ol> B. Tel Cellen en bepalen Differentiëlen <ol><li> Centrifugeer de BAS vloeistof 5 min bij ongeveer 600 x g, 4 ° C. </li><li> Voorzichtig Resuspendeer de cel pellet in PBS en blijf op ijs. </li><li> Plaats een standaard Neubauer hemacytometer met de verdunde celsuspensie en tel de cellen. </li><li> Verwijder aliquots van 2 x 10 4 cellen bij 10 tot 40 ul volume cytospins. Verdun cellen indien nodig. </li><li> Voor cytospins, mix 2 × 10 4 cellen, 130 ul PBS en 10 ui FBS. Voeg gehele cel mengsel Double Cytospin trechter en 10 min centrifugeren op 700 toeren per minuut, met behulp van dubbele cytoslides voor duplicaten van de monsters. </li><li> Laat de dia te drogen bij kamertemperatuur gedurende 1 h voorafgaand aan kleuring. </li><li> Vlekken op de dia&#39;s door gebruik te maken Diff-Quick vlek (Siemens, Newark, DE). </li></ol> IV. Representatieve resultaten Overmatige luchtwegvernauwing volgende provocatieve stimuli is een opvallend kenmerk van klinische astma. We beschrijven twee methoden voor het meten van dergelijke luchtweg hyperreactiviteit voor methacholine in OVA-gesensibiliseerde en uitgedaagd muizen: Whole-body plethysmografie (Figuur 2) en gedwongen oscillatie met behulp van de flexiVent systeem (figuur 3). Beide methoden aan te tonen dat OVA sensibilisatie en uitdaging luchtweg hyperreactiviteit bij muizen veroorzaakt. Eosinofiel-rijke luchtwegontsteking is een ander opvallend kenmerk van zowel klinische als astma en allergische aandoeningen van de luchtwegen bij muizen. Zoals getoond in figuur 4 </strong&gt; OVA sensibilisatie en uitdaging vergroot het aantal cellen die van de luchtwegen worden teruggewonnen BAL. Het aantal eosinofielen en in mindere mate, neutrofielen bijzonder verhoogd. Er zijn aanwijzingen dat allergische luchtwegaandoeningen, het gevolg is van overproductie van IgE-antistoffen tegen sensibiliserende antigenen. Sensibilisatie en uitdaging OVA met de protocollen beschrijven we verhoogt IgE zowel serum BAS vloeistof behandelde muizen (figuur 5). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig1.jpg" /> Figuur 1. Experimentele schema voor OVA geïnduceerde allergische astma. Muizen werden tweemaal gesensibiliseerd ip met 20 ug OVA geëmulgeerd in 2 mg aluminiumhydroxide in 0,2 ml steriele PBS of 2 mg aluminiumhydroxide in 0,2 ml steriele PBS alleen gevolgd de aangegeven tijdstippen door het uit te dagen met 0,1% OVA of steriel PBS oplossing of door de dagelijkse ex<html> ling ondervinden gedurende 30 minuten verneveld 1% OVA in PBS of PBS alleen geleverd via een ultrasone vernevelaar (Buxco). Vierentwintig uur na de laatste OVA belichting werd luchtwegen voor bepaald. Vervolgens werden BAS vloeistof, bloedmonsters longcellen en weefsels verzameld voor verdere analyse. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig2.jpg" /> Figuur 2. Beoordeling van de allergeen-geïnduceerde hyperreactiviteit luchtwegen door een niet-invasieve methode. Muizen (n = 4/group) waren gesensibiliseerd en uitgedaagd met OVA. Vierentwintig uur na de laatste uitdaging, werd luchtwegovergevoeligheid op geïnhaleerd methacholine bepaald met behulp van het hele lichaam plethysmografie zoals beschreven in het protocol. Penh is vastgesteld en uitgedrukt als Penh verhouding (gemiddelde Penh via 8 min tijdsinterval met methacholine gedeeld door het gemiddelde Penh via 8 min interval met PBS). *, P &lt;0,05 versus PBS. iles/ftp_upload/3771/3771fig3.jpg &quot;/&gt; Figuur 3. Beoordeling van de allergeen-geïnduceerde hyperreactiviteit luchtwegen door een invasieve methode (gedwongen oscillatie). Muizen (n = 4/group) waren gesensibiliseerd en uitgedaagd met OVA. Vierentwintig uur na de laatste uitdaging, werd luchtwegovergevoeligheid de toenemende concentraties van geïnhaleerde methacholine bepaald door de gedwongen oscillatie (flexiVent)-methode, zoals beschreven in het protocol. A, B) weerstand van de luchtwegen; C) Lung elastantie. *, P &lt;0,05 versus PBS. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig4.jpg" /> Figuur 4. BAL vloeistof celgetal. Muizen (n = 4/group) waren gesensibiliseerd en uitgedaagd met OVA. Vierentwintig uur na de laatste uitdaging, (Top) BAL cellen werden verzameld en het totaal cellen geteld zoals beschreven in het protocol. (Onder) Cytospin dia&#39;s waren pgerepareerd en gekleurd met Diff-Quick. Tot = totaal cellen; Eos = eosinofielen; Neu = neutrofielen; Mac = macrofagen; Lym = lymfocyten. *, P &lt;0,05 versus PBS. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig5.jpg" /> Figuur 5. OVA-specifieke IgE. Muizen (n = 4/group) waren gesensibiliseerd en uitgedaagd met OVA. Vierentwintig uur na de laatste challenge werd gemeten IgE in BAS vloeistof en in serum van het bloed verzameld door hartpunctie zoals beschreven in het protocol. *, P &lt;0,05 versus PBS.

<ol><li>Braman, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The global burden of asthma.</a> Chest. 130, 4S-12S (2006).</li>
<li>Akinbami, L. J., Mooman, J. E., Liu, X. Asthma Prevalence, Health Care Use, and Mortality: 2005-2009. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAkinbami%2C+LJ+%22National+Health+Statistics+Reports%22">National Health Statistics Reports</a>. 32, National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. 2005-2009 (2011).</li>
<li>Bates, J. H., Rincon, M., Irvin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of asthma.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 297, 401-410 (2009).</li>
<li>Drazen, J. M., Finn, P. W., De Sanctis, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+airway+responsiveness%3A+physiological+basis+of+observed+outcomes+and+analysis+of+selected+examples+using+these+outcome+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mouse models of airway responsiveness: physiological basis of observed outcomes and analysis of selected examples using these outcome indicators.</a> Annu. Rev. Physiol. 61, 593-625 (1999).</li>
<li>Epstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+mouse+models+of+allergic+asthma+mimic+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Arch.+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Do mouse models of allergic asthma mimic clinical disease.</a> Int. Arch. Allergy Immunol. 133, 84-100 (2004).</li>
<li>Blyth, D. I., Pedrick, M. S., Savage, T. J., Hessel, E. M., Fattah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+inflammation+and+epithelial+changes+in+a+murine+model+of+atopic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lung inflammation and epithelial changes in a murine model of atopic asthma.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 425-438 (1996).</li>
<li>Martin, T. R., Gerard, N. P., Galli, S. J., Drazen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+responses+to+bronchoconstrictor+agonists+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pulmonary responses to bronchoconstrictor agonists in the mouse.</a> J. Appl. Physiol. 64, 2318-2323 (1988).</li>
<li>Hamelmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+measurement+of+airway+responsiveness+in+allergic+mice+using+barometric+plethysmography%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156, 766-775 (1997).</li>
<li>Gelfand, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro%3A+mice+are+a+good+model+of+human+airway+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Pro: mice are a good model of human airway disease.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166, 5-8 (2002).</li>
<li>Shapiro, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+asthma%3A+Pro%3A+Allergic+avoidance+of+animal+%28model%5Bs%5D%29+is+not+an+option%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Animal models of asthma: Pro: Allergic avoidance of animal (model[s]) is not an option.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 174, 1171-1173 (2006).</li>
<li>Zosky, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovalbumin-sensitized+mice+are+good+models+for+airway+hyperresponsiveness+but+not+acute+physiological+responses+to+allergen+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Allergy%22%5BJournal%5D)">Ovalbumin-sensitized mice are good models for airway hyperresponsiveness but not acute physiological responses to allergen inhalation.</a> Clin. Exp. Allergy. 38, 829-838 (2008).</li>
<li>Nials, A. T., Uddin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+allergic+asthma%3A+acute+and+chronic+allergen+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">Mouse models of allergic asthma: acute and chronic allergen challenge.</a> Dis. Model. Mech. 1, 213-220 (2008).</li>
<li>Wenzel, S., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+trap%3A+It+still+yields+few+answers+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">The mouse trap: It still yields few answers in asthma.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 174, 1173-1178 (2006).</li>
<li>Rayamajhi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-surgical+Intratracheal+Instillation+of+Mice+with+Analysis+of+Lungs+and+Lung+Draining+Lymph+Nodes+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (51), e2702(2011).</li>
<li>Swedin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+aerosol+and+intranasal+challenge+in+a+mouse+model+of+allergic+airway+inflammation+and+hyperresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Arch.+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of aerosol and intranasal challenge in a mouse model of allergic airway inflammation and hyperresponsiveness.</a> Int. Arch. Allergy Immunol. 153, 249-258 (2010).</li>
<li>Gueders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+asthma%3A+a+comparison+between+C57BL%2F6+and+BALB%2Fc+strains+regarding+bronchial+responsiveness%2C+inflammation%2C+and+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production.</a> Inflamm. Res. 58, 845-854 (2009).</li>
<li>Zhu, W., Gilmour, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+allergic+lung+disease+in+three+mouse+strains+after+systemic+or+mucosal+sensitization+with+ovalbumin+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Comparison of allergic lung disease in three mouse strains after systemic or mucosal sensitization with ovalbumin antigen.</a> Immunogenetics. 61, 199-207 (2009).</li>
<li>Flandre, T. D., Leroy, P. L., Desmecht, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+somatic+growth%2C+strain%2C+and+sex+on+double-chamber+plethysmographic+respiratory+function+values+in+healthy+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice.</a> J. Appl. Physiol. 94, 1129-1136 (2003).</li>
<li>Hoymann, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+and+noninvasive+lung+function+measurements+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Invasive and noninvasive lung function measurements in rodents.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 16-26 (2007).</li>
<li>Chong, B. T., Agrawal, D. K., Romero, F. A., Townley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+bronchoconstriction+using+whole-body+plethysmograph%3A+comparison+of+freely+moving+versus+restrained+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39, 163-168 (1998).</li>
</ol>

Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften opgesteld door de Atlanta VAMC IACUC comite dat is ingesteld op grond van Protocol # V010-10.

Diermodellen van allergische luchtwegaandoeningen vindt u belangrijke hulpmiddelen voor het onderzoek relevant voor de klinische astma. Een aantal verschillende, gebruik verschillende soorten en antigenen, zijn ontwikkeld. De muis, een aantrekkelijke en veel gebruikte proefdieren, biedt ook een aantal voordelen voor de modellen van allergische luchtwegaandoeningen. 9,10 Hoewel dergelijke modellen hebben astma in alle opzichten, 11 niet na te bootsen met aspecten van chronische ziekten is bijzonder ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiaalnaam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Ovalbumine </td><td> Sigma-Aldrich St. Louis, MO </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td> Aluminiumhydroxide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239.186 </td><td></td></tr><tr><td> Acetyl-β-methylcholine chloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2251 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpentobarbital zout </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3761 </td><td></td></tr><tr><td> Hele lichaam plethysmografie (WBP) systeem </td><td> Buxco Research Systems Wilmington, NC </td><td></td><td> <a href="http://www.buxco.com" target="_blank">http://www.buxco.com</a> </td></tr><tr><td> FlexiVent </td><td>SCIREQ, Inc Montreal, Canada </td><td></td><td> <a href="http://www.scireq.com" target="_blank">http://www.scireq.com</a> </td></tr><tr><td> Lichtmicroscoop </td><td> Leica Microsystems, Inc Buffalo Grove, IL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cytospin 4 </td><td> Thermo Scientific Asheville, NC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diff-Quick vlek </td><td> Siemens Newark, DE </td><td> B4132-1A </td><td></td></tr><tr><td> Repetitive pipet </td><td> Tridak Torrington, CT </td><td> STP4001-0025 </td><td></td></tr></tbody></table>

muizenmodel van allergen induced astma

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Astma is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit, waardoor ongeveer 300 miljoen mensen over de hele wereld. 1 Meer dan 8% van de Amerikaanse bevolking heeft astma, met de prevalentie toe. 2 Net als bij andere ziekten, diermodellen van allergische luchtwegaandoeningen veel gemakkelijker begrip van de onderliggende pathofysiologie, helpen bij het identificeren potentiële therapeutische doelen, en laat preklinische testen van mogelijke nieuwe therapieën. Modellen van allergische luchtwegaandoeningen zijn ontwikkeld in verschillende diersoorten, maar muis-modellen zijn met name aantrekkelijk vanwege de lage kosten, gemakkelijke beschikbaarheid, en goed gekarakteriseerd immuunsysteem van deze dieren. 3 Beschikbaarheid van een verscheidenheid van transgene stammen verhoogt verder de aantrekkelijkheid van deze modellen. 4 Hier beschrijven we twee muismodellen van allergische luchtwegaandoeningen, zowel in dienst ovalbumine als antigeen. Na de eerste opname door intraperitoneale injectie, een model spreekt zichers het antigen uitdaging aan door verneveling, de andere door intratracheale levering. Deze twee modellen bieden aanvullende voordelen, met elkaar het nabootsen van de belangrijkste kenmerken van de menselijke astma. 5 De belangrijkste kenmerken van een acute astma zijn onder andere een overdreven luchtwegen reactie op prikkels, zoals methacholine (luchtweg hyperreactiviteit, LHR) en eosinofielen-rijke luchtwegontsteking. Dit zijn ook belangrijke effecten van allergeen uitdaging in onze muismodellen, 5,6 en beschrijven we technieken voor het meten van hen en dus de beoordeling van de effecten van de experimentele manipulatie. In het bijzonder, beschrijven we zowel invasieve 7 en 8 niet-invasieve technieken voor het meten van de luchtweg hyperreactiviteit en methoden voor de beoordeling van infiltratie van ontstekingscellen in de luchtwegen en de longen. Airway ontstekingscellen worden verzameld door bronchoalveolaire lavage, terwijl long histopathologie wordt gebruikt om de markers van ontsteking te beoordelen in het orgel. Dezetechnieken zorgen voor krachtige tools voor het bestuderen van astma op een manier die niet mogelijk zou zijn bij de mens.

Experimentele muismodellen van allergische astma bieden nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van de ziekte van pathogenese en het ontwikkelen van nieuwe therapeutica. Deze modellen zijn zeer geschikt voor het meten factoren die de allergische immuunrespons, ontsteking van de luchtwegen en longen pathofysiologie.

Muizenmodel van Allergen Induced Astma

Astma is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit en treft ongeveer 300 miljoen mensen wereldwijd.1 Meer dan 8% van de Amerikaanse bevolking heeft astma, ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een muismodel van astma te produceren. Eerst worden de muizen gesensitiseerd voor ovalbumine via intraperitonele injectie. In een tweede stap worden de muizen blootgesteld aan ovalbumine, via intratracheale toediening of door middel van verneveling.Dit induceert een allergische reactie van de luchtwegen die vergelijkbaar is met een astma-exacerbatie bij mensen en kan worden gemeten via een methylcholine-provocatietest. Daarnaast kunnen de cellulaire infiltratie in de luchtwegen en de serumspiegels van IgE worden gekwantificeerd om de ernst van deze typische astmaskenmerken te beoordelen. Uiteindelijk ontwikkelen de muizen astma-achtige manifestaties, waarvan de ernst kan worden beïnvloed door verdere experimentele manipulaties.Dit diermodel kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen binnen het astmaonderzoek, zoals de effecten van behandeling met specifieke experimentele geneesmiddelen of het moduleren van specifieke signaleringspaden. Deze procedure zal vandaag worden gedemonstreerd door Irvin en Somia, promovendi in mijn laboratorium. Bereid de sensitisatie-oplossing voor door 1 mg/mL voline te emulgeren in steriele PBS die 10 mg/mL aluminiumhydroxide bevat. Sensitiseer de muizen door 200 µL van het sensitisatie-inoculum, of een controle-oplossing zonder voline, intraperitoneaal te injecteren voor dit protocol.Sensitiseer de muizen zoals beschreven op dag nul en zeven. Voer vervolgens op om beurten uitdagingssessies uit, beginnend op dag 14 tot en met 22 voor de intratracheale uitdaging. Plaats de geanestheseerde muis op een schuin oppervlak.Bevestig een draad onder de voortanden van de muis en houd de kop naar achteren. Breng vervolgens de poot in een horizontale positie om de trachea recht te trekken en plak de achterpoten vast aan het werkvlak. Om de positie te stabiliseren, wordt de nek en het borstgebied van de muis bevochtigd met 70%ethanol en gedesinfecteerd met chlorhexidine. Gebruik een pincet om de huid van de keel vast te pakken en trek deze voorzichtig naar voren met steriele chirurgische scharen.Maak een kleine verticale incisie. Vul een spuit van één milliliter met 50 µL 0,1% Volin in PBS. Voorzie deze van een naald met gauge 27 en plaats deze met één hand in een repitition pipette.Gebruik een steriele pincet om met de andere hand de trachea bloot te leggen. Houd de pipet parallel aan de trachea. Voer de naald voorzichtig in en injecteer de oplossing.Sluit de wond voorzichtig en hecht deze met een hechting, waarbij steriliteit strikt wordt gewaarborgd. Plaats de muis op een warmtemat en laat het dier herstellen voor de challenge via nebulisatie.Gebruik de eerder beschreven methode om de muizen te sensibiliseren op dag nul en 14. Daag de muizen vervolgens dagelijks uit van dag 21 tot en met dag 25. Om de challenge uit te voeren, plaatst u de muizen in de hoofdkamer van een whole-body plethysmografiesysteem en laat u hen minimaal 10 minuten acclimatiseren.Plaats vervolgens één milliliter van 0,1% albumine in steriele PBS in de nebulisatorkop en vernevel gedurende 30 minuten. Om niet-invasieve metingen van luchtweghyperreactiviteit uit te voeren, worden de muizen geacclimatiseerd aan de kamer zoals eerder aangetoond. Registreer daarna gedurende drie minuten de basiswaarden.Plaats vervolgens één milliliter PBS in de nevelbeker, vernevel gedurende twee minuten en monitor de respiratoire variabelen gedurende nog eens zes minuten tijdens de droogfase na de verneveling. Dit voorbeeld illustreert de verhoogde luchtwegresponsiviteit die is ontwikkeld door met ovalbumine behandelde muizen voor het uitvoeren van invasieve metingen van luchtweghyperresponsiviteit. Plaats de geanestheseerde muis op de rug, desinfecteer de nek met ethanol en chloorhexidine, en leg de trachea vrij zoals eerder in deze video beschreven.Zodra de trachea zichtbaar is, gebruikt u fijne steriele scharen om een kleine incisie te maken. Voeg voorzichtig de trachealtube in, waarbij u erop let de trachea niet door te snijden. Bind een hechting rond de trachea om luchtlekkage te voorkomen.Leg de muis op de rug en verbind de trachealtube met de ventilator. Start de mechanische ventilatie voor een muis van 20 gram. Stel de ademhalingsfrequentie in op 150 slagen per minuut en het teugvolume op 200 microliters voor de baseline-ademhalingsmetingen.Herhaal vervolgens de test na toediening van PBS of toenemende doses methylcholine via een ultrasone vernevelaar. Met behulp van de invasieve meting kunnen zowel de luchtwegweerstand als de longelasticiteit worden gemeten zoals verwacht. Volin-behandelde muizen vertoonden een toegenomen weerstand en elasticiteit na de provocatie.Leg na euthanasie de buikholte van de muis bloot en doorboor vervolgens voorzichtig het diafragma met een schaar. Let erop dat de longen of het hart niet worden doorboord. Snijd de borstkas weg.Puncteer vervolgens het hart met een spuit van 1 mL voorzien van een naald van 27 gauge en neem langzaam het bloed af; bewaar het bloed voor serumscheiding en analyse van ova-specifieke IgE-antilichamen. Leg daarna de trachea bloot en gebruik een gebogen schaar om een pad eronder vrij te maken. Plaats de punt van een gebogen pincet onder de trachea en knoop vervolgens een stuk hechtdraad in een losse halve knoop rond de trachea op een lage positie in de keel.Zodra de draad op zijn plaats zit, wordt er een kleine incisie in de trachea boven de knoop gemaakt en wordt er voorzichtig een canule in het gat ingebracht. Druk deze vervolgens zachtjes naar voren tot deze de ingang van de longen bereikt. Trek de knoop aan en voltooi deze.Sluit vervolgens een spuit van 1 mL met PBS aan op de canule en injecteer de vloeistof voorzichtig in de longen. Let erop dat de longen opblazen. Zorg ervoor dat de longen niet te veel worden gevuld, om ruptuur te voorkomen.Zuig de spoelvloeistof op, waarbij de canule voorzichtig wordt gedraaid of iets dieper wordt gedrukt als er weerstand wordt gevoeld. Zodra de vloeistof is verzameld, wordt de spuit losgekoppeld en de vloeistof overgebracht naar een buisje op ijs. Herhaal de procedure tweemaal met verse PBS.Na deze procedure kunnen de luchtwegcellen door centrifugatie worden geïsoleerd, zoals hier wordt getoond. De luchtwegen van muizen die zijn gesensitiseerd en uitgedaagd met volin bevatten veel meer totale cellen dan die van controlemuizen. Met behulp van diff-quick-kleuringen kunnen eosinofielen, neutrofielen, alveolaire macrofagen en lymfocyten worden onderscheiden en geteld.Daarnaast is te zien dat behandelde muizen na de ontwikkeling hogere spiegels van voline-specifieke IgE-antilichamen ontwikkelen in het serum en het bronchoalveolaire lavagevloeistof. Dit diermodel heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van astma om de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze belangrijke ziekte te onderzoeken in een praktisch muismodel.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Herhaalde metingen van knaagdieren respiratoire fysiologie en bemonstering van de luchtwegen ontstekingscellen wenselijk zijn, maar over het algemeen niet haalbaar. Hier beschrijven we een herhaalbare methode voor het mondeling intuberen muizen dat herhaalde metingen van de luchtwegen hyperreactiviteit en de bemonstering van de luchtwegen ontstekingscellen vergunningen.

Een reversibele, niet-invasieve methode voor Airway Resistance Metingen en bronchoalveolaire lavage Fluid Sampling in Muizen

Het huidige protocol bevat een gedetailleerde stap-voor-stap beschrijving van de vereiste om metingen van de ademhalingswegen mechanica, alsmede de beoordeling van de luchtwegen voor geïnhaleerde methacholine in muizen met behulp van de geforceerde oscillatie techniek (flexiVent voeren procedures; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canada).

Evaluatie van Respiratory System Mechanics in Muizen met behulp van de Gedwongen Oscillatie techniek

Terwijl in vitro studie van gastheer-pathogeen interacties de karakterisering van specifieke immuunresponsen mogelijk maakt, zijn in vivo modellen vereist om de effecten van complexe responsen te observeren. Door gebruik van Candida albicans blootstelling gevolgd door Pseudomonas aeruginosa-gemedieerde longinfectie, hebben we een muismodel gevestigd van microbiële interacties betrokken bij de pathogeniteit van ventilateur-geassocieerde pneumonie.

Bestuderen van microbiële gemeenschappen<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen<em&gt; Candida albicans</em&gt; En<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In het Airways

De hier beschreven werkwijze maakt het mogelijk om visualisatie van IL-8 promotorafhankelijke ontstekingsactivering in de longen van muizen door middel van niet-invasieve bioluminescentie beeldvorming (BLI). Het zelfde dier kan meerdere keren tot BLI worden onderworpen tot maximaal twee maanden vanaf de tijd van afgifte van het luciferase reporterconstruct.

Een IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model voor de<em&gt; In Vivo</em&gt; Lange termijn monitoring van inflammatoire reacties

Het doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde beschrijving van de aanbevolen procedures voor het evalueren van de ademhalingsfunctie in bewuste muizen door dubbele-kamer plethysmography.

Beoordeling van de ademhalingsfunctie in bewuste muizen door Double-kamer Plethysmography

De hier ingevoerde protocol kunnen karakterisering van de homing longcapaciteit van primaire menselijke lymfocyten in vivo inflammatoire voorwaarden. Pulmonaire infiltratie van adoptively overgedragen menselijke immune cellen in een muismodel van allergische ontsteking kan worden beeld en gekwantificeerd door licht vel fluorescentie microscopie van chemisch gewiste longweefsel.

Geavanceerde Imaging van longkanker Homing menselijke lymfocyten in een experimenteel In Vivo Model van allergische ontsteking op basis van licht vel microscopie

Milieuallergenen zoals huisstofmijt (HDM) bevatten vaak microbiële stoffen die aangeboren immuunreacties activeren om allergische ontstekingen te reguleren. Het hier gepresenteerde protocol toont de identificatie aan van dsRNA-soorten in HDM-allergenen en karakterisering van hun immunogene activiteiten bij het moduleren van eosinofiele longontsteking.

Identificatie en karakterisering van immunogene RNA-soorten bij HDM-allergenen die eosinofiele longontsteking moduleren

Een hoog platform kan ratten zonder beperking repareren en de acupunten op de rug volledig blootleggen tijdens acupunctuurmanipulatie. Dit artikel beschrijft methoden voor de fabricage van het hoge platform, stelt een rattenmodel van astma vast en meet veranderingen in de ademhalingsfunctie met behulp van een niet-invasief en real-time plethysmografiesysteem voor het hele lichaam (WBP).

Acupunctuur in een Rattenmodel van Astma

Dit protocol beschrijft een meerkleurige immunofluorescentietechniek voor het evalueren van het rattenmodel van allergische rhinitis.

Immunofluorescerende etikettering in neusslijmvliesweefselsecties van allergische rhinitis-ratten via veelkleurige immunoassay

Hier beschrijven we de meting van hoest met behulp van een niet-invasief en real-time plethysmografie van het hele lichaam (WBP) -systeem en de normatieve procedures voor het oogsten van weefselmonsters van muizen en introduceren we enkele methoden om luchtwegontsteking te beoordelen.

Methoden voor het detecteren van hoest en luchtwegontsteking bij muizen

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een muismodel met hoestovergevoeligheid, dat als ideaal model kan dienen voor het bestuderen van de mechanismen van chronische hoest.

Oprichting van een muismodel met hoestovergevoeligheid via inademing van citroenzuur

Leer een muizenmodel van allergie-geïnduceerde astma met ovalbumine-sensibilisatie en luchtweguitdaging. Deze methode meet methylcholine-respons en IgE-niveaus voor onderzoek naar astma-therapieën.

Muizenmodel van Allergen Induced Astma

Meer video's verkennen