Name: Infectie van zebravis embryos met intracellulaire bacteriële pathogenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Leer micro-injectie van fluorescerende bacteriën in zebravis-embryo's voor live imaging van immuuncelinteracties. Deze methode maakt visualisatie van fagocytose en pathogeenlokalisatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Chao Cui bedanken, Floor de Kort, Esther Stoop en Ralph Carvalho voor afbeeldingen in figuur 4, Ulrike Nehrdich en Davy de Witt voor vissen zorg, en andere lab-leden voor nuttige discussies. Dit werk wordt ondersteund door het Smart Mix-programma van Nederland Ministerie van Economische Zaken en het Ministerie van Onderwijs, Cultuur en Wetenschap, de Europese Commissie 7e kader project ZF-GEZONDHEID (HEALTH-F4-2.010 tot 242.048), de Europese Marie-Curie netwerk voor initiële opleiding FishForPharma (PITN-GA-2011 tot 289.209), en door de Australische NHMRC (637.394). De Australische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde wordt ondersteund door subsidies van de staat regering van Victoria en de Australische regering.

<ol><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).</li>
<li>Davis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17, 693-702 (2002).</li>
<li>vander Sar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+as+a+model+host+for+the+real+time+analysis+of+Salmonella+typhimurium+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections.</a> Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).</li>
<li>Zakrzewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-specific+gene+functions+in+Spi1-directed+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity.</a> Blood. 116, 1-11 (2010).</li>
<li>Le Guyader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111, 132-141 (2008).</li>
<li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development. 126, 3735-3745 (1999).</li>
<li>Alibaud, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mycobacterium+marinum+TesA+mutant+defective+for+major+cell+wall-associated+lipids+is+highly+attenuated+in+Dictyostelium+discoideum+and+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos.</a> Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).</li>
<li>Carvalho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).</li>
<li>van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+the+zebrafish+host+transcriptome+response+to+acute+and+chronic+mycobacterial+infection+and+the+role+of+innate+and+adaptive+immune+components%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components.</a> Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. The Zebrafish Book. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , The University of Oregon Press. Eugene. (1993).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Brain+Ventricle+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Brain Ventricle Injection.</a> J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 49-56 (2011).</li>
<li>Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+and+functional+analyses+of+the+zebrafish+embryonic+innate+immune+response+to+Salmonella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection.</a> J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).</li>
<li>Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Stoop, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryo+screen+for+mycobacterial+genes+involved+in+the+initiation+of+granuloma+formation+reveals+a+newly+identified+ESX-1+component%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component.</a> Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).</li>
<li>Levraud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+zebrafish+IFN+receptor%3A+implications+for+the+origin+of+the+vertebrate+IFN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system.</a> Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).</li>
<li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).</li>
<li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).</li>
<li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo%3A+unlike+macrophages%2C+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).</li>
<li>van Soest, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).</li>
<li>Adams, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+tolerance+in+replicating+mycobacteria+mediated+by+a+macrophage-induced+efflux+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism.</a> Cell. 145, 39-53 (2011).</li>
<li>Ellett, F. L., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+quantification+of+fluorescent+leukocyte+numbers+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos.</a> Methods in Enzymology. , (2011).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).</li>
<li>Mathias, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation+by+retrograde+chemotaxis+of+neutrophils+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).</li>
<li>Gray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De infectie methoden beschreven in dit artikel worden vaak gebruikt om de functie van gastheer aangeboren immuniteit genen of bacteriële virulentie genen een te bestuderen. De intraveneuze micro-injectie methoden (protocollen 5 en 6.1) worden het meest gebruikt voor dergelijke studies. De caudale ader op het achterste bloed eiland is de meest geschikte locatie voor intraveneuze injectie van 1-dagen oude embryo&#39;s. Omdat de caudale ader wordt het moeilijker om door te dringen in een later stadium, geven wij de voorkeur het kanaal van Cuvier als intraveneuze injectie site voor embryo&#39;s op 2-3 dpf. In alle gevallen is het van cruciaal belang voor de embryo&#39;s te injecteren met een constante aantallen bacteriën, die moeten door platen injectie inocula worden gecontroleerd op kve tellen. De volgende aspecten moet worden beschouwd als reproduceerbare injecties te bereiken. Ten eerste is het essentieel om een ​​hoge kwaliteit glas microcapillaire injectienaalden. Als de naald te groot is, zal de injectie een lekke band gat groot genoeg te maken voor bloeden voor te komen ende geïnjecteerde bacteriën stromen van de bloedsomloop. Ten tweede moet bacteriën rechtstreeks geïnjecteerd worden in de bloedsomloop. Als de naald zich niet in de ader of als injectievloeistof spreads in de dooierzak uitbreiding moet het embryo weggegooid worden van het experiment. Ten derde, met behulp van PVP40 als een drager voor het injecteren van M. marinum zal helpen bij het ​​voorkomen van de bacteriën uit zinken in het glas naald. PVP40 verbetert de homogeniteit van de schorsing, wat resulteert in beter reproduceerbaar inocula tijdens de gehele duur van de injecties. PVP40 kunnen ook worden gebruikt voor S. typhimurium injecties, maar hier is minder belangrijk omdat de grotere en lichte fluorescentie van de bacteriën kan een visuele controle op de injectieplaats inoculum bij experimenten. Voor het oefenen van de injecties adviseren wij het gebruik van fenol rode kleurstof (1% v / v) of 1 micrometer fluorescerende bollen in verschillende kleuren verkrijgbaar (Invitrogen). Zodra de techniek onder de knie, duurt het ongeveer 30 minutes tot 50-100 embryo injecteren, zoals de tijd nodig voor het uitlijnen van de embryo&#39;s agarose platen en aanpassing van de bacteriële injectievolume. Terwijl de intraveneuze injecties in het bloed eiland (protocol 5) of in het kanaal van Cuvier (protocol 6.1) worden het meest gebruikt, zijn de alternatieve routes van de infectie wordt beschreven in deze video artikel nuttig gebleken om macrofagen en neutrofielen chemotaxis te bestuderen (protocollen 6.2, 6.3 en 6.4), de groei van verzwakte bacteriestammen (protocol 6.5) te bestuderen en het zebravis infectiemodel voor high-throughput toepassingen (protocol 6.6) 4-8 passen. De beschreven micro-injectie werkwijzen kunnen ook worden toegepast voor injecties virussen 18, 19, schimmelsporen 14, 20 of ziekteverwekkers (Maria Forlenza, persoonlijke communicatie). Een nuttige aanvulling op de injectie procedures beschreven in deze video artikel is een recent beschreven procedure voor subcutane injectie van bacteriën in zebrafish embryo 21. Deze procedure werd toegepast fagocytose door neutrofielen bacteriën, die efficiënt overspoelen bacteriën op weefseloppervlakken maar bestuderen, in tegenstelling tot macrofagen, vrijwel geen bacteriën fagocyteren bij injectie in het bloed of in fluïdum gevulde lichaamsholtes. Voor subcutane injecties embryo&#39;s worden geplaatst vergelijkbaar als bij de staart spier injecties beschreven in deze video artikel, maar de naald wordt ingebracht net onder de huid om de bacteriën te injecteren via een somiet. Het is belangrijk om te oordelen dat micro-injectie in wezen een kunstmatige route van infectie. Echter, vroege embryo zijn bestand tegen externe blootstelling aan bacteriële pathogenen. In feite, onderdompeling assays, waarbij embryo&#39;s ondergedompeld in een bacteriesuspensie, zijn niet reproduceerbaar in onze handen 22. Terwijl sommige embryo&#39;s kunnen besmet raken na onderdompeling, hebben wij een grote variatie in sterftecijfers en in de explicieteion van inflammatoire markers tussen individuele embryo dergelijke tests. De micro-injectie methoden die in dit artikel te bereiken reproduceerbaar infecties en zijn bijzonder nuttig om bacteriële interacties met gastheer aangeboren immuunsysteem cellen te bestuderen. Een efficiënte aanpak van de bacteriële infectie te kwantificeren in individuele embryo&#39;s is om de fluorescerende beelden van geïnfecteerde embryo&#39;s te analyseren met op maat gemaakte, toegewijde pixel kwantificering software 17, 23. Deze benadering is gebleken te correleren met de resultaten van cfu tellen na plating van geïnfecteerde embryo&#39;s. Zo hebben de relatieve veranderingen in leukocyten aantallen per embryo gekwantificeerd door digitale beeldanalyse in transgene leukocyten fluorofoor verslaggever lijnen; deze aanpak van toepassing zou zijn voor het kwantificeren van de gastheer leukopoietic reactie op infectie 24. De functie van ontvangst aangeboren immuunsysteem genen efficiënt in vivo onderzocht door het combineren van de beschreven infectie modellenmet morfolino knockdown. Morpholinos zijn synthetische antisense oligonucleotiden die specifiek RNA gericht en verminderen de expressie van de genproducten bij injectie in 1-cel stadium zebravisembryo&#39;s zoals in andere video artikelen in dit tijdschrift 10, 25. In morfolino knockdown studies is het van groot belang dat alle embryo te vergelijken groepen kunnen worden opgevoerd voor bacteriële injecties. Dit is vooral belangrijk omdat embryo&#39;s beschikken over een ontwikkeling van het immuunsysteem die steeds bevoegd in de tijd. Er zijn verschillende transgene reporter lijnen die momenteel beschikbaar zijn op de grote aangeboren immuunsysteem subsets, macrofagen en neutrofielen, in de zebravis embryo&#39;s te onderscheiden. De MPX en Lyz promotors zijn gebruikt om neutrofielen reporter lijnen 16, 26, 27 genereren en csf1r (FMS) en mpeg1 promoters zijn voor het produceren van macrofagen reporters 14, 28. Terwijl CSF1R (FMS) is bovendien uitgedrukt in xanthophores, mpeg1 expressie is uitsluitend in macrofagen. Zoals blijkt uit deze video artikel, de recent ontwikkelde mpeg1 reporter lijnen zijn zeer nuttig voor de beeldvorming bacteriële fagocytose door macrofagen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Leverancier </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Fenol Rood </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 228210 </td></tr><tr><td> Difco Middlebrook 7H10 agar </td><td> Becton, Dickenson and Company </td><td> 262710 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook OADC Verrijking </td><td> Becton, Dickenson and Company </td><td> 211886 </td></tr><tr><td> Difco Middlebrook 7H9 Bouillon </td><td> Becton, Dickenson and Company </td><td> 271310 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook ADC Verrijking </td><td> Becton, Dickenson and Company </td><td> 211887 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidon (PVP40) </td><td> Calbiochem, Merck KGaA </td><td> 529504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ Em&gt;-Phenylthiourea (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td></tr><tr><td> Ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout (tricaïne) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaque Agarose (lage smeltpunt agarose) </td><td> Lonza Inc </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 urn, fluorescerende (580/605)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 micrometer, geel-groen tl-licht (505/515)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

infectie van zebravis embryo&#39;s met intracellulaire bacteriële pathogenen

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebravis (Danio rerio) embryo&#39;s worden steeds meer gebruikt als model voor het bestuderen van de functie van de gewervelde aangeboren immuunsysteem in gastheer-pathogeen interacties 1. De belangrijkste celtypes van het aangeboren immuunsysteem, macrofagen en neutrofielen, ontwikkelen tijdens de eerste dagen van de embryogenese voor de rijping van de lymfocyten die nodig zijn voor adaptieve immuunresponsen. Het gemak van het verkrijgen van een groot aantal embryo&#39;s, de toegankelijkheid als gevolg van externe ontwikkeling, de optische transparantie van de embryonale en larvale stadia, een breed scala aan genetische tools, uitgebreide mutant middelen en de collecties van transgene reporter lijnen, dragen allemaal bij aan de veelzijdigheid van de zebravis model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) en Mycobacterium marinum kan intracellulair wonen in macrofagen en worden vaak gebruikt om gastheer-pathogeen interacties in de zebravis embryo&#39;s te bestuderen. De infectie processen beidebacteriële ziekteverwekkers zijn interessant om te vergelijken, omdat S. typhimurium-infectie is acuut en dodelijk binnen een dag, terwijl M. marinum infectie chronische en kan worden afgebeeld tot larvale stadium 2, 3. De site van micro-injectie van bacteriën in het embryo (figuur 1) bepaalt of de infectie snel zal systemische worden of zal in eerste instantie blijven gelokaliseerd. Een snelle systemische infectie kan worden vastgesteld door micro-injectie van bacteriën direct in de bloedsomloop via de caudale ader op het achterste bloed eiland of via het kanaal van Cuvier, een ruime verspreiding kanaal op de dooierzak het aansluiten van het hart naar de stam vaatstelsel. Op 1 DPF, wordt bij het embryo in dit stadium phagocytically actieve macrofagen hebben, maar neutrofielen zijn nog niet gerijpt, injecteren in het bloed eiland de voorkeur. Voor injecties op 2-3 DPF, wanneer embryo&#39;s hebben ook functionele (myeloperoxidase-producerende) neutrofielen, ontwikkelde de Duct van Cuvier heeft de voorkeur als thij de plaats van injectie. Om gerichte migratie van myeloïde cellen naar lokale infecties te bestuderen, kunnen bacteriën worden geïnjecteerd in de staart spier, otic blaasje, of achterhersenen ventrikel 4-6. Bovendien de notochorda, een structuur die lijkt zijn deuren myeloïde cellen erg gevoelig voor plaatselijke infectie 7. Een interessant alternatief voor high-throughput toepassingen is de injectie van bacteriën in de dooier van embryo in de eerste uren na de bevruchting 8. De combinatie van fluorescerende bacteriën en transgene zebravis lijnen met fluorescerende macrofagen of neutrofielen schept ideale omstandigheden voor een multi-color beeldvorming van gastheer-pathogeen interacties. Deze video artikel beschrijft gedetailleerde protocollen voor de intraveneuze en lokale infectie van de zebravis embryo&#39;s met S. typhimurium of M. marinum bacteriën en voor de daaropvolgende fluorescentie beeldvorming van de interactie met cellen van het aangeboren immuunsysteem.

Transparante zebravis embryo&#39;s hebben hun nut bewezen model hosts te visualiseren en functioneel onderzoek naar interacties tussen aangeboren immuunsysteem cellen en intracellulaire bacteriële pathogenen, zoals<em&gt; Salmonella typhimurium</em&gt; En<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt;. Micro-injectie van bacteriën en multi-color fluorescentie beeldvorming zijn essentiële technieken die betrokken zijn bij de toepassing van de zebravis embryo infectie modellen.

Infectie van zebravis embryo&#39;s met intracellulaire bacteriële pathogenen

Zebravisembryo's (*Danio rerio*) worden steeds vaker gebruikt als model voor het bestuderen van de functie van het aangeboren immuunsysteem van gewervelden bij de interactie tussen gastheer en pathogeen ...

Het algemene doel van deze procedure is om zebravisembryo's te micro-injecteren met fluorescerende bacteriën voor live-imaging van de interactie met immuuncellen van de gastheer. Dit wordt bereikt door eerst de injectienaald voor te bereiden en te vullen met bacteriële suspensies. Vervolgens worden de embryo's gefaseerd en uitgelijnd op een injectieplaat.Vervolgens wordt het bacteriële inoculum toegediend via een route om ofwel een lokale of een systemische bacteriële infectie te bewerkstelligen. Ten slotte worden de embryo's gemonteerd en afgebeeld. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de intracellulaire lokalisatie van bacteriële pathogenen binnen fluorescerende fagocyten van de transparante zebrafish-embryonale gastheer aantonen via fluorescentie- en confocale microscopie.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de immunologie, omdat het zebravissenembryo-model zeer krachtig is voor live-imaging van interacties tussen gastheer en pathogeen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat er veel oefening nodig is om reproduceerbaar bacteriën in de bloedsomloop van zebravissenembryo's te micro-injecteren voor een systemische infectie, of in specifieke compartimenten om lokale infecties te bewerkstelligen. Na het trekken van glazen microcapillaire naalden en het afschuinen van de punten onder een hoek van 45 graden, worden de zebravissenembryo's op 28 uur na bevruchting klaargezet door te controleren op een consistente bloedsomloop. De start van pigmentatie in het oog, een rechte staart en het hart dat zich net ventraal van het oog bevindt.Zodra de embryo's zijn geanestheseerd, wordt een micro loader-tip gebruikt om de naald te vullen met een eerder bereid bacterieel inoculum. Bevestig de gevulde naald aan een micromanipulator die aan een statief is verbonden en positioneer deze onder een stereomicroscoop. Stel de injectietijd in op 0,2 seconden en de compensatiedruk op 15 Hector Pascal.Stel de injectiedruk in tussen 700 en 900 Hector Pascal om het juiste injectievolume voor de gebruikte naald te verkrijgen. Zet de micromanipulator met de geladen naald in de juiste positie vóór het injecteren. Plaats de geanestheseerde embryo's op een vlakke 1% agarose injectieplaat en verwijder al het overtollige eikenwater.Gebruik vervolgens een haarlus-instrument om de embryo's voor elke injectie uit te lijnen. Verplaats de plaat tijdens de injecties handmatig om de embryo's zo te oriënteren dat hun staarten naar de naaldpunt wijzen. Plaats de naaldpunt direct boven de vena caudalis, dicht bij de urogenitale opening.Doorboor het periderm met de naaldpunt en injecteer de gewenste dosis fluorescent gelabelde bacteriën. Wij gebruiken ongeveer 250 colony forming units of CFUs van salmonella typhimurium en ongeveer 120 CFUs van mycobacterium marum. De geïnjecteerde bacteriële suspensie zal de bloedstroom via de coddle-ader naar het hart volgen; controleer of de injectie correct is uitgevoerd door direct na de puls te kijken naar een toenemend volume van het vaatstelsel.Controleer regelmatig of het injectievolume gedurende het experiment gelijk blijft. Om een controle voor de consistentie van de injecties gedurende het experiment te verkrijgen, injecteert u een druppel bacteriën direct op een druppel steriele PBS op bacteriegroeimedium. Plaat deze druppel na ongeveer elke 30e embryo-injectie uit en tel de bacteriële koloniën na incubatie.Om de CFU in het injectievolume te bepalen, gebruikt u een fluorescent stereomicroscoop om individuele fluorescerende styria-cellen te observeren die direct na injectie in de bloedstroom circuleren, en verwijdert u embryo's die niet correct zijn geïnjecteerd. Fluorescerende aggregaten van M marum-bacteriën zouden twee dagen na infectie zichtbaar moeten zijn en na verloop van tijd groter worden. Om in de ductus Cuvier te injecteren, lijnt u geanestheseerde embryo's uit die twee tot drie dagen na fertilisatie zijn.Wat betreft de injectie in de ductus Cuvier onder een hoek van 45 graden vanaf de dorsale zijde van het embryo, steekt u de naald in het beginpunt van de ductus Cuvier. Voor de injectiepositie in het ventrikel van het agenencefalus (hindbrain) kiest u een plek net dorsaal aan de locatie waar de ductus begint uit te wijden over de dooierzak. Anestheseer embryo's van 32 uur post-fertilisatie met hun dorsale zijde naar de naaldpunt gericht.Steek de naald vanuit een anterieure positie in het ventrikel van de rhombencephalon zonder het neurohelium aan te raken om in de staartspieren te injecteren. Positioneer geanestheseerde embryo's van één tot twee dagen post-fertilisatie met de staart gericht naar de naaldpunt en met de naald in een hoek van ongeveer 65 graden; injecteer in de spier boven de urogenitale opening voor injectie in de otische blaas. Orienteer geanestheseerde embryo's van twee tot drie dagen post-fertilisatie met de staarten gericht naar de naald.Inject onder een hoek van 65 graden en bij een lage druk om binnen één tot twee dagen in het snoer van de knoopknoppen te injecteren. Plaats embryo's na bevruchting zodanig dat de staart van de naald af wijst. Steek de naald door het spierweefsel van de staart in het snoer.Voor een eidooiersinjectie bij embryo's in het stadium van 16 tot 1000 cellen steekt u de naald door het chorion in het centrum van de eidooier om de infectie te beeldvormen. Anestheseer de geïnfecteerde embryo's in een met 1% augurous gelaagde petrischaal, bedekt met eiwater dat trica bevat. Gebruik een haarloop-instrument om de embryo's in de juiste positie voor beeldvorming onder een fluorescent stereomicroscoop uit te lijnen.Individuele fluorescerende s tym-cellen kunnen direct na injectie circulerend in de bloedbaan worden waargenomen. Indien een andere positie dan het laterale aanzicht vereist is, kunnen de embryo's worden gemonteerd in 1,5% methylcellulose; gebruik vervolgens een haarlus-instrument om het embryo in de gewenste positie te manipuleren om de infectie te beelden met een geïnverteerde confocale microscoop.Plaats een druppel laagsmeltend aeros op een schaaltje met glazen bodem. Plaats het geanestheseerde embryo in de aeros-druppel met een beperkte hoeveelheid eiwater en gebruik een haarloop-instrument om het embryo in positie te manipuleren. Laat het aeros stollen en dompel de aeros-druppel onder in eiwater dat trica bevat.Het monster is nu klaar voor confocale beeldvorming. De injectie van Salmonella typhimurium of Mycobacterium marinum bacteriën in het bloedeiland van embryo's op één dag na bevruchting resulteert in snelle fagocytose door macrofagen. De verspreiding van de relatief grote en helder fluorescentie-gemarkeerde DS.Red styriaanse bacteriën kan direct worden gevisualiseerd met stereoflourescentie en confocale beeldvorming twee uur na infectie, wat aantoont dat veel bacteriën worden gefagocyteerd door fluorescente macrofagen.Een injectiedosis van 250 CFU van wild-type styria induceert een sterke pro-inflammatoire respons en is binnen een dag letaal. In contrast hiermee leidt de intraveneuze injectie van erum tot een aanhoudende infectie waarbij geïnfecteerde macrofagen nauwe aggregaten vormen die worden beschouwd als de beginstadia van granulomen, het kenmerk van tuberculose. Confocale beeldvorming van een dergelijk granuloomachtig aggregaat in de transgene EG one EGFP-lijn op vijf dagen na infectie toont de intracellulaire groei van m cherry-gelabelde M num-bacteriën.Binnen de groen fluorescerende macrofagen kunnen bacteriën worden geïnjecteerd in het ventrikel van de achterhersenen, een compartiment dat 32 uur na fertilisatie vrij is van macrofagen. Injectie van 20 tot 100 M cherry-gelabelde M marum-bacteriën in dit compartiment leidt tot een snelle infiltratie door macrofagen die de bacteriën fagocyteren, zoals hier getoond. Door gebruik te maken van de transgene M-P-X-E-G-F-P leidt de injectie van ongeveer 20 CFU van Styria in de otische vesikel tot de aantrekking van neutrofielen drie uur na infectie. Hoewel deze respons niet wordt waargenomen bij PBS-controle-injecties, is de chorda dorsalis, die resistent lijkt te zijn tegen infiltratie door leukocyten, een permissief compartiment voor de groei van erum-mutanten die sterk verzwakt zijn wanneer ze in andere weefsels worden geïnjecteerd.Na injectie in de dooier van een dosis van 2240 CFU erum verspreiden de bacteriën zich over meerdere dagen in de embryonale weefsels en vormen granuloomachtige aggregaten, vergelijkbaar met die welke worden waargenomen bij de conventionele intraveneuze injectiemethode. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een juiste stadiering van de zebravissenembryo's cruciaal is, omdat het embryonale immuunsysteem tijdens de ontwikkeling steeds competenter wordt.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals transcriptoomprofilering en immunohistochemie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe het embryonale aangeboren immuunsysteem reageert op pathogene infecties.

infection-of-zebrafish-embryos-with-intracellular-bacterial-pathogens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De snelle ontwikkeling, de kleine oppervlakte en de transparantie van de zebravis zijn enorme voordelen voor de studie van aangeboren immuunsysteem controle op...

Niet-invasieve beeldvorming van gedissemineerde candidiasis in de zebravis Larven

Deze video beschrijft een techniek van intraperitoneale injectie, een methode voor het leveren van oplossingen in de buikholte van Adult Zebrafish.

Intraperitoneale injectie: een methode voor oplossingsafgifte in de buikholte van een volwassen zebravis

Source: Zhang, X., et al. A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates fluorescence imaging of zebrafish embryos injected with Staphylococcus aureus, enabling quantification of infection progression and bacterial distribution to assess the impact of biomaterial microspheres on host-pathogen interactions in vivo.

 Fluorescence Imaging of Biomaterial-Associated Bacterial Infection in Zebrafish Embryos

Source: Zhang, X. et. al., A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a zebrafish embryo model for studying infections linked to implanted biomaterials. Injecting Staphylococcus aureus with polystyrene microspheres enhances bacterial survival, confirming the infection-promoting role of implanted materials.

In Vivo Analysis of Implant-Associated Bacterial Infections Using Zebrafish Embryos

Source: Shi, J., et al., Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the procedure for preparing an Agrobacterium tumefaciens culture by inducing virulence gene expression with acetosyringone, followed by antibiotic removal through washing and resuspension, to generate a transformation-ready suspension for gene delivery into plant tissues.

Microinjection of Bacteria into the Caudal Vein of Zebrafish Embryos

Source: Bernut, A., et al., Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a protocol for isolating and quantifying Mycobacterium abscessus from an infected zebrafish embryo. The procedure involves embryo euthanasia, tissue lysis, and homogenization to release the bacteria, followed by centrifugation and resuspension in a surfactant buffer. Finally, the bacterial suspension is serially diluted, plated...

Isolation and Cultivation of Bacteria from Zebrafish Embryos to Assess Infection Load

Source: Flores, E., et al. Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the method of establishing a foodborne bacterial intestinal infection model in zebrafish larvae by feeding them paramecia infected with fluorescent E. coli.

Modeling Intestinal Infection in Zebrafish Larvae Using Foodborne Bacteria

Optisch transparante zebravis embryo's worden veel gebruikt om in realtime de interacties tussen pathogene micro-organismen en de aangeboren immuuncellen te bestuderen en te visualiseren. Micro-injectie van Mycobacterium abscessus, gecombineerd met fluorescentiebeeldvorming, wordt gebruikt om essentiële pathogene kenmerken zoals koordvorming in zebravis embryo's te onderzoeken.

Ontcijferen en Imaging Pathogenese en Cording van<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In zebravis embryo&#39;s

De huidige studie beschrijft een zebravis embryo model voor in vivo visualisatie en intravital analyse van biomaterial-geassocieerde infectie na verloop van tijd op basis van fluorescentie microscopie. Dit model is een veelbelovende aanvulling op zoogdieren dierlijke modellen zoals Muismodellen voor het bestuderen van de biomaterial-geassocieerde infecties in vivo.

Een zebravis Embryo Model voor In Vivo visualisatie en Intravital analyse van Biomaterial-geassocieerde goudhoudende Stafylokok infectie

Dit protocol beschrijft een techniek voor het visualiseren van macrofaag gedrag en overlijden in embryonale zebravis tijdens infectie met Mycobacterium de . Stappen voor de bereiding van bacteriën, infectie van de embryo's, en intravital microscopie zijn opgenomen. Deze techniek kan worden toegepast op de observatie van cellulaire gedrag en overlijden in soortgelijke scenario's met betrekking tot infectie of steriele ontsteking.

Visualisatie van macrofaag lytische celdood tijdens mycobacteriële infectie in zebravis-embryo's via Intravital microscopie

Er is momenteel een gebrek aan in vivo modellen die geschikt zijn voor screening van geneesmiddelen tegen chronische bacteriële infecties. Hier beschrijven we een protocol voor wondinfectie door een Pseudomonas aeruginosa klinisch isolaat om een persisterende infectie bij zebravislarven te genereren.

Modellering van persistente Pseudomonas aeruginosa-infectie bij gewonde zebravislarven

Leer micro-injectie van fluorescerende bacteriën in zebravis-embryo's voor live imaging van immuuncelinteracties. Deze methode maakt visualisatie van fagocytose en pathogeenlokalisatie mogelijk.

Infectie van zebravis embryo's met intracellulaire bacteriële pathogenen

Meer video's verkennen