Isolatie van oplosbare en onoplosbare oligomeren in het PrP Normal Human Brain

Het doel van deze procedure is het isoleren van het oplosbare en onoplosbare prion-eiwit of PRP uit alle ligamenten in het normale menselijk brein. Dit wordt bereikt door eerst menselijk hersenweefsel te homogeniseren en de fracties te isoleren. Vervolgens wordt een velocitiesedimentatie uitgevoerd in sucrose-stapsgradiënten.

Vervolgens wordt grootte-uitsluitingschromatografie uitgevoerd. Ten slotte wordt PRP gevangen met het gene five protein of G five P. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de isolatie van oplosbare en onoplosbare PRP of aggregaten uit het normale menselijke brein aantonen via ultracentrifugatie in sucrose-stapgradiënten, grootte-uitsluitingschromatografie en het vangen van PRP met G five P. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het onderzoek naar prionziekten, waaronder Creutzfeldt-Jakobziekte, bovine spongiforme encefalopathie en klinische wasting-ziekten. Bovendien kunnen ze inzicht bieden in de isolatie van oplosbare en onoplosbare eiwitaggregaten, niet alleen voor prionziekten, maar ook voor andere ziekten zoals de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson.

Over het algemeen zullen personen die onbekend zijn met deze methoden moeite hebben, omdat alle experimentele stappen belangrijk zijn en extra zorg vereisen. Een videodemonstratie van dit proces is cruciaal, aangezien de SEC Fi en de PRP-capturatie met G five P stappen zijn die moeilijk te beschrijven zijn en waarbij nauwkeurigere handelingen nodig kunnen zijn voor een correct resultaat. Om een hersenhomogenaat te bereiden, begint u met het toevoegen van 100 µL lysisbuffer aan 100 mg bevroren hersenweefsel; homogeniseer het weefsel op ijs met een gemotoriseerde stamper, vries het vijf minuten lang in op droogijs en homogeniseer het vervolgens opnieuw.

Maak een totaal hersenhomogenaat van 20% of 10% door respectievelijk 300 of 800 µL lysisbuffer toe te voegen. Centrifugeer het homogenaat met een tafelcentrifuge bij 1000 G gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verzamel de SNA in een SW 55 rotorcentrifuge en centrifugeer de S1-fractie bij 35.000 RPM gedurende één uur bij 4 °C.

Overdraag het supernatant naar een schone buis. Resuspendeer het detergent-onoplosbare pellet in lysisbuffer om monsters voor western blot voor te bereiden. Incubeer de S2- en P2-fracties met 50 µg/mL proteinase K gedurende één uur bij 37 °C.

Beëindig de digestie door vijf millimolair PMSF en SDS-monsterbuffer toe te voegen. Kook de monsters gedurende 10 minuten en laat ze vijf minuten afkoelen tot kamertemperatuur. Om velociteitssedimentatie uit te voeren, begint u met het incuberen van 450 microliter van de 20% S one-fractie met een gelijk volume 2% Sarco X-water op ijs gedurende 30 minuten in centrifugebuisjes van vijf milliliter. Voeg telkens 0,5 milliliter 60, 30, 25, 20, 15 en 10% sucrose toe; breng 0,4 milliliter van de geïncubeerde S one aan op de bovenkant van de 10 tot 60% sucrose.

Centrifugeer de stapgradiënten in een SW 55 rotor bij 48.000 RPM gedurende één uur bij vier graden Celsius vanaf de bovenkant van de buis. Verzamel 12 gelijke fracties van elk 283 µL. Gebruik 20 µL van elke fractie en een gelijk volume SDS-monsterbuffer.

Om monsters voor SDS-PAGE-gels voor te bereiden: kook de monsters gedurende 10 minuten en laat ze vervolgens vier minuten afkoelen. Centrifugeer de monsters bij 1000 G gedurende één minuut.

Vortex deze vervolgens voordat ze op een precast gel voor grootte-uitsluiting worden geladen. Chromatografie wordt gebruikt om de oligomere status van PRP-moleculen te bepalen. Begin met het laden van monstervolumes van 200 µL van zeven individuele moleculaire massamarkers op een kolom van 1 bij 30 van SUEx 200 HR-beads.

Gebruik het elutievolume van blauw dextran als het dode volume. Bereken de piek-elutievolumes van VE uit het chromatogram en de fractionele retenties. Bereken KAV, de partitiecoëfficiënt, met de vergelijking KAV is gelijk aan V minus V zero gedeeld door VT minus V zero.

Om een kalibratiecurve te genereren: zet de KAV van de eiwitstandaarden uit tegen het log molecuulgewicht van de standaarden. Breng vervolgens 200 µL van S one aan op de kolom bij een stroomsnelheid van 0,25 mL/min.

Was de kolom met lysisbuffer 1%cile en elueer fracties van 0,25 milliliter met behulp van een fractiecollector. Incubeer 125 microliters van elke fractie met 500 microliters voorkoelde methanol bij -20 °C gedurende twee uur. Centrifugeer de monsters bij 13.000 G gedurende 30 minuten bij 4 °C.

Resuspend het pellet in 20 µL SDS-monsterbuffer en kook dit gedurende 10 minuten. Laat afkoelen tot kamertemperatuur en scheid de eiwitten op 15% polyacrylamidegels. Gebruik de standaardcurve om de molecuulgewichten van de verschillende teruggewonnen PRP-soorten te extrapoleren om het G5P-molecuul aan de magnetische kralen te conjugeren.

Incubeer 100 µg G5P met 350 µL TOCI-geactiveerde magnetische beads in 1 mL PBS bij 37 °C gedurende 20 uur. Gebruik een externe magneet om de G5P-beads naar de wand van de Eppendorf-buisjes te trekken en verwijder de oplossing. Was de beads drie keer met 1 mL PBS met 0,1% BSA om aspecifieke binding te blokkeren.

Incubeer de G5P-geconjugeerde beads in één milliliter 0,2 M tris-HCl pH 7,4 met 0,1% BSA gedurende vijf uur bij 37 °C. Was de beads vervolgens drie keer. Verwijder de laatste wasstap en voeg één milliliter PBS toe om PRP te isoleren. Incubeer 100 µL van S1 of P2 met 60 µL G5B-geconjugeerde beads in één milliliter bindingsbuffer onder constante rotatie gedurende drie uur bij kamertemperatuur.

Plaats de buis op de magneet. Verwijder de oplossing en was de beads drie keer met wasbuffer. Verwijder de laatste wasstap en voeg SDS-monsterbuffer toe.

Verhit de beads gedurende vijf minuten bij 95 °C. Laad de monsters op 15% precast gels en run deze bij 150 volt gedurende ongeveer 80 minuten. Transfer de eiwitten naar PVDF bij 70 volt gedurende twee uur nadat de membranen zijn geblokkeerd in 5% melk in TBST.

Incubeer deze gedurende twee uur bij kamertemperatuur met de PRP-antilichamen. 3F4, 1E4, anti-N of anti-C. Na incubatie met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen wordt het membraan geïncubeerd met een chemiluminescentie-oplossing volgens de instructies van de fabrikant en wordt de film belicht, zoals hier te zien is, vergeleken met sporadische Creutzfeldt-Jakob-ziekte of CJD-monsters. Een kleine hoeveelheid onoplosbaar cellulair PRP werd gedetecteerd in de P2-fractie van normale hersenen.

Het grootste deel werd echter teruggewonnen in de S twee fractie. Onoplosbare PRP vormt ongeveer vijf tot 25% van de totale PRP, inclusief volledige lengte en aan de uiteinden getrunceerde soorten; analyses met behulp van sucrose-stapgradiënt sedimentatie onthulden dat hoewel de meeste PRPC uit niet-CJD-hersenen werd teruggewonnen in de bovenste fracties, kleine hoeveelheden PRP ook werden gedetecteerd in de onderste fracties negen 11 die normaal gesproken grote aggregaten bevatten. Een verscheidenheid aan pathogene PRP- of PRP SC-soorten, variërend van monomeren.

Kleinere ligamenten en grotere aggregaten werden geïsoleerd door gelfiltratie in de hersenen bij yakup-ziekte met CRUT-klep. Verrassend genoeg werd een kleine hoeveelheid grotere aggregaten met een moleculair gewicht groter dan 2000 kilodaltons ook aangetroffen in onoplosbare fracties van normale hersenen. Bovendien werden dimeren en tetrameren van PRPC niet alleen aangetroffen in onoplosbare fracties, maar ook in onoplosbare fracties.

Na behandeling met PK en PNGase. Het door G5P gevangen PRP werd gedetecteerd met het 1E4-antilichaam tegen PRP97 1 0 5 3. PK-resistente kernfragmenten, aangeduid als PRP*20, PRP*19 en PRP*7, werden gedetecteerd met een migratie van respectievelijk 20 kDa, 19 kDa en 7 kDa.

Er werd echter geen PRP gedetecteerd wanneer het one E four-antilichaam werd gepreïncubeerd met een synthetisch peptide met een sequentie die identiek is aan het one E four-epitoop, wat aangeeft dat de door one E four gedetecteerde banden PRP-fragmenten zijn. Het anti-C-antilichaam detecteerde twee verschillende PRP-fragmenten die migreerden bij rond 18 kilodaltons en rond 12 tot 13 kilodaltons. In aanvulling op PRP ETE 20 Once-methode.

Deze techniek kan in vier dagen worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de oplosbare en onoplosbare PRP-polyganen in de lagere menselijke hersenen kunt isoleren na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoek naar het lot van PIP-bevestigingsinformatie in de hersenen.