Name: Lange-termijn Lethal toxiciteit Test met de Schaal- Artemia franciscana /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Leer een gestandaardiseerde methode voor het beoordelen van langetermijnlethale toxiciteit (14 dagen) bij Artemia franciscana. Dit protocol helpt onderzoekers om de ecologische impact van chemische stoffen op mariene organismen te evalueren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Geproduceerd door Loredana Manfra van Instituut voor milieubescherming en onderzoek (Ispra-Department of Environmental Quality Monitoring) en Federica Savorelli van regionale agentschap voor milieubescherming (Emilia-Romagna, Italië). Referentie leden voor de sub-werkgroep over de Artemia schaaldieren binnen de biologische methoden Groep - Saltwater / brak water en sediment van de UNICHIM Commissie op de waterkwaliteit (het instituut voor de technische normen die in de chemische sector). Videografie en te bewerken, Marco Pisapia van Ispra (Web Unit). Productie Coördinatie door Anna Maria Cicero en Erika Magaletti van Ispra (Department of Environmental Quality Monitoring). We willen het Gewestelijk Agentschap bedanken voor milieubescherming van Emilia-Romagna, Ferrara Branch, de biologische methoden Groep - Saltwater / BrakWater en sediment van de UNICHIM Commissie op de waterkwaliteit en Luciana Migliore, Tor Vergata Universiteit (Rome) voor hun medewerking, Rossella Boscolo en Massimo Gabellini van Ispra (Afdeling Preventie en tegengaan van de effecten) voor hun financiële steun, Fabio Matassa en de London School van de talen in Rome voor hun taalkundige ondersteuning.

1. Methode Standaard De testen zijn blootgesteld Artemia larven met een interval van stof concentraties of een monster voor het bepalen van de concentratie of verdunning niveau dat zou leiden tot de dood van 50% van de organismen (LC 50) blootgesteld gedurende 14 dagen aan bepaalde voorwaarden deze methode. Indien nodig en mogelijk is, kan bovendien het volgende worden bepaald: a) de concentratie niveau dat de dood van 20% van de blootgestelde organismen (LC 20) veroorzaakt; b) de hoogste geanalyseerd concentratie die geen vaststelling van een hogere sterftecijfer dan die van de negatieve controle (NOEC), de laagste geteste concentratie die bepaalt na 14 dagen een hogere sterftecijfer dan die van de negatieve controle (LOEC). 2. Testen Materiaal 2,1 Artemia eieren Om testen uit te voeren, Artemia franciscana </em&gt; Larven van minder dan 48 uur oud (nauplii) zijn vereist, in de eerste fase II of III, op basis van pas uitgekomen eieren 5. Certified eieren of cysten gebruikt om tests te ondersteunen in de handel verkrijgbaar, bijvoorbeeld van de Quality Assurance Research Division, US Environmental Protection Agency, Cincinnati OH 45268, USA of van het Laboratorium voor Biologisch Onderzoek van Waterverontreiniging, Universiteit Gent, België. 2,2 Water verdunning Synthetische zout kan worden gebruikt als verdunningswater bereid door pa reagentia of een commercieel verkrijgbare formulering met gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Zout mengsels voor het creëren van de ideale zout water zijn commercieel verkrijgbaar, zoals de Instant Ocean mengsels. Het verdient aanbeveling het verdunningswater met een zoutgehalte gelijk aan 35 (± 2) voeding en een gehalte aan opgeloste zuurstof van meer dan 80% van de waarde van verzadiging en een temperatuur van 25 (± 2) endeg; C. Na 48 uur beluchten en filtratie van filters met een porositeit van ten minste 0,45 urn, kan de verdunning worden opgeslagen maximaal 30 dagen in het donker bij een temperatuur van 0-4 ° C. 2,3 algen cultuur Het verdient aanbeveling die test organismen voeden zich met Dunaliella tertiolecta microalgen, die exponentieel groeien en te bereiken dichtheden van 1.3x10 6 - 2.0x10 6 cellen / ml. Testen op milieu monsters vereist culturen met een dichtheid hoger dan 2.0x10 6 cellen / ml 6. Er wordt gesuggereerd dat Dunaliella tertiolecta groeit in een cultuur die media die zeewater (30 (± 2) PSU en 20 (± 1) ° C) met toevoeging van essentiële voedingsstoffen, mineralen en vitaminen. Sommige aanduidingen op de algen media samenstelling en bereiding worden gerapporteerd in de bijlage. De eerste celdichtheid wordt voorgesteld ongeveer 10 5 cellen / ml. De algen cultuur in stand wordt gehouden in eenkamerthermostaat op 20 (± 1) ° C, verlicht met fluorescentielampen 3000 (± 300) lx, met een fotoperiode verhouding van 16 uur licht en 8 uur donker. Andere fytoplanktonsoorten kunnen ook worden gebruikt voor het voederen maar het zou moeten vergelijkende studies maken met deze fytoplanktonsoorten de &quot;equivalent&quot; soorten vinden Dunaliella tertiolecta omdat de experimentele omstandigheden (bv. eerste celdichtheden licht verlichting, temperatuur, de samenstelling van cultuur media en belichtingstijd) varieert tussen fytoplankton soorten. Naast de tolerantie van de microalg verschillende verontreinigingen dient te worden beschouwd, aangezien de verontreinigende effect op de groei en ontwikkeling van fytoplankton effect ook de Artemia&#39;s. 2,4 Referentiestof De verwijzing stof in deze test is natriumdodecylsulfaat. 2,5 Laboratoriumglaswerk <ol><li> Testen containers met 100 ml borosilicaatglas bekers (18 voor het testen en 18 voor het overbrengen van oplossingen uit te voeren). </li><li> Een kolf (bijvoorbeeld 500 ml kolf) om de standaard oplossing te bereiden. </li><li> Zes flessen (bijv. 200 ml flesjes) het testen oplossingen voor te bereiden. </li><li> Glazen of polystyreen diameter van 5 cm petrischaaltjes met verwijderbare omvat wordt gebruikt voor het activeren van de cysten en de overdracht van de Artemia uitkomen schotel het testen containers. </li><li> Glas Pasteurpipetten (met tips afgerond door vlam) voor het overbrengen van de nauplii. </li><li> Glas canules of Pasteur 3 ml wegwerp plastic pipetten (te snijden) voor het overbrengen van Artemia. </li><li> Micropipetten en gegradueerde pipetten om de test oplossingen voor te bereiden. </li><li> Zes afgestudeerde cilinders (bv 50 ml cilinders) voor het overbrengen van het testen van oplossingen van de kolven op thij testen containers. </li></ol> 3. Cyste Activering 3.1. Platen met cysten + gieten van water Om proeforganismen genereren, 20 mg van cysten geplaatst in een Petri schaal die 12 ml verdunningswater 48 uur vóór de test. 3.2. Incubatie in het licht en in het donker De Petri-schaal wordt op 25 (± 2) ° C en een 4000 (± 1000) lux (lumen per vierkante meter) lichtintensiteit gedurende een uur. 3.3. Vervangen medium met de microscoop Na 24 uur worden de arcering larven overgebracht naar een nieuwe petrischaal gevuld met kunstmatige water. De overdracht wordt uitgevoerd met behulp van de microscoop, dat wil zeggen met behulp van een lichtbron, zodat het uitkomen, phototropic larven migreren naar de lichtbundel. Een glazen Pasteur pipet wordt gebruikt om de transfer, zodat alleen de opkomende larven are overgedragen en niet de cysten en de larven nog membranen. 3.4. Incubatie in het donker De schotel met de larven in een donkere thermostatische kamer voor 24 uur bij 25 (± 2) ° C. 4. Voorbereiding van Testing Solutions 4.1. Wegen van de stof + over te dragen aan de kolf Het verdient aanbeveling de standaardoplossing voor het testen stof bereid door 0,5 g van de stof in een 500 ml kolf. De kolf wordt gevuld met gedeïoniseerd of gedestilleerd water en de oplossing wordt geroerd totdat het testen stof volledig is opgelost. Oplossingen worden bereid bij de tenzij hij niet bekend of de stof stabiel in oplossing is. In dat geval kan de standaardoplossing bereid tot twee dagen vóór de test. 4.2. Voorbereiden van de negatieve controle, het toevoegen van verdunningswater en algen wiste van de pipet van 10 ml De negatieve controle bereid in een kolf (bijv. 200 ml) door toevoeging van een aliquot van de algensuspensie de verdunningswater zodat een dichtheid van 10 5 cellen / ml wordt verkregen. 4.3. De voorbereiding van de test-oplossingen: het toevoegen van verdunningswater, algen en standaardoplossing Er wordt gesuggereerd dat onderzoek oplossingen worden bereid in vijf 200 ml flacons van toevoegen van de standaard oplossing aan het verdunningswater in de hoeveelheden gespecifieerd zodat de gewenste concentratie te testen verkregen. Om de organismen voeden kan aliquots Dunaliella tertiolecta microalgae suspensie kunnen worden gebruikt en toegevoegd aan een dichtheid van 10 5 cellen / ml bereikt wanneer de test-oplossingen worden bereid. De volgende volgorde van toevoeging is aan te bevelen: verdunningswater, algensuspensie en standaard oplossing. Na de bereiding van testoplossingen zij moeten worden gebruikt in de test zo spoedig mogelijk. 4.4. Overdracht van oplossingen van de kolf met het testen van containers, dan naar de petrischalen Gelijke hoeveelheden (50 ml) van de testoplossingen worden ingevoerd in de test met gebruikmaking van de containers maatcilinder. Drie replica&#39;s voor elke concentratie worden gemaakt. Voor elke reeks proeven wordt controle container bereid met een hoeveelheid verdunningswater gelijk aan het volume van de testoplossingen. Gelijke volumes (ongeveer 12 ml) van de testoplossingen worden ingevoerd in de Petrischalen. Voor elke reeks proeven wordt controle petrischaal gebruikt. 5. Voorbereiding voor het testen 5.1. Nauplii de II-III fase Achtenveertig uur na cyste activering van de nauplii bereiken II-III larvale stadium zijn dan bruikbaar voor testen. 5.2. Nauplii overdracht de platen met de microscoop De Petri-schaal voor cyste<html> activering wordt uit de thermostatische kamer. Een kleine hoeveelheid larven worden overgebracht naar de platen met de controle en de testoplossingen. Deze taak wordt uitgevoerd met de microscoop met behulp van een pipet voldoende grote diameter, zodat de organismen niet beschadigd. In deze fase van de test, kan de overdracht worden uitgevoerd met een glazen Pasteur pipet (met afgeronde punt door de vlam) en een zijwaarts geplaatste lichtbron dat de Artemia aanmoedigt samen te voegen. 5.3. Nauplii overdracht van de platen in de test container met de microscoop Ten larven worden van de testoplossingen Petri schalen in de test containers. Ook deze operatie worden uitgevoerd door gebruikmaking van de pasteurpipet en microscoop. Het verdient aanbeveling een volume van ten hoogste 1 ml overgebracht tijdens het passeren van larven niet de totale hoeveelheid van testsysteem beïnvloeden. e_step &quot;&gt; 5.4. Volle containers bedekt met parafilm Het testen bekers worden bedekt met parafilm (waarbij een opening luchtdoorlaat) en op een temperatuur van 25 (± 2) ° C gedurende de gehele duur van de test en een verlichting van 900 (± 100) lx met een fotoperiode verhouding van 14 uur licht tot 10 uur van de duisternis. 6. Het vervangen van de Medium and Food Supplement 6.1. Survival rate control Twee dagen na de test gestart en na 5, 7, 9 en 12 dagen wordt de Artemia onder de microscoop de overleving te verifiëren en het medium en het voedingssupplement vervangen. Aantal levende organismen geteld in elke test container. Na observatie onder de microscoop en lichte mechanische stimulatie (bijvoorbeeld het aanraken van de larven met een glas Pasteur pipet) organismen die wat beweging vertonen geen voor ongeveer 10 seconden moet worden als dood beschouwd. 6.2. Voorbereiding van een testoplossing met algen bemonstering met een 10 ml pipet en bemonstering van de stof worden getest met een micropipet. Het overbrengen van oplossingen uit de kolf op de proef containers Bij het testen moet de testoplossingen periodiek worden vervangen en bereid op dezelfde dag als ze worden gebruikt. Testoplossingen worden gemaakt van de standaardoplossing eerder bereid. 6.3. Artemia-overdracht, gebruik te maken van een snee Pasteur pipet, van de oude test containers aan de drie nieuwe containers De overdracht van Artemia wordt uitgevoerd met behulp van een pipet met een voldoende grote diameter, zodat geen de organismen beschadigen. Tijdens deze fase kan een 3 ml kunststof Pasteur pipet (te snijden) worden gebruikt. 6.4. Larven in een bekerglas met of dood of levend Artemia Na 1<html> 4 dagen blootstelling aan het einde van de test wordt het aantal overlevende larven geteld en geregistreerd op het werkblad. LC 50 en / of LC 20, worden NOEC en LOEC van 14 dagen, berekend en geregistreerd, evenals het vertrouwen van grenswaarden voor de 95% in voorkomend geval, en berekeningsmethoden. 7. Representatieve resultaten Aan het einde van de proef (14 dagen) berekenen percentage mortaliteit in elke concentratie volgens de volgende formule: (M s / N) * 100 Waar: M s is gemiddeld aantal gestorven individuen in het geanalyseerde monster N is het totale aantal blootgestelde personen Tabel 1 geeft een voorbeeld van gegevens van test (14d) met Artemia blootgesteld aan natriumdodecylsulfaat. <table border="1"><tbody><tr><td> Concentraties (mg / l) </td>&quot;&gt; Aantal overleden personen in elke replica </td><td> Mortaliteit (%) </td></tr><tr><td></td><td> Ik </td><td> II </td><td> III </td><td></td></tr><tr><td> Negatieve controle </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1,56 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3,12 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> 6,25 </td><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 27 </td></tr><tr><td> 12,5 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 25,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 50,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Bovendien bepalenLC 50-waarde van een grafische Gaussiaanse logaritmische plot of met behulp van passende statistische methoden (bijvoorbeeld Spearman-Karber of Probit-methode). De berekening van LC 50 de gegevens van tabel 1 8,18 (7,15 tot +9.37) mg / l. Als de maximale concentratie geteste veroorzaakt een lager sterftecijfer van 50%, moet je niet overgaan tot de berekening van de LC 50-waarde die dan zou zijn onbetrouwbaar of zelfs niet-berekenbaar. In dit geval evenwel wenselijk de test herhaald door uitbreiding van het assortiment geteste concentraties. Ook kan de LC 50 waarde meer kunnen uitgedrukt als groter dan de hoogste geteste concentratie mogelijk wijst het percentage mortaliteit bij de hoogste geteste concentratie en de hoogste concentratie die overeenkomt met een geen effect. De resultaten worden als geldig beschouwd als aan het eind van het testen van de volgende voorwaarden is voldaan: <ol class="lalpha"><li> de controle van de gemiddelde sterftecijferis ≤ 20%; </li><li> waarbij gebruik natriumdodecylsulfaat de LC 50 na 14 dagen is opgenomen in de 8,0 (± 5) mg / l interval. </li></ol> Als de bovenstaande voorwaarden niet is voldaan, moeten alle gegevens die zijn verkregen met dezelfde batch van organismen worden als ongeldig beschouwd en testen herhaald.

<ol><li>Togulga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Short-Term+Toxicity+of+Two+Toxicants+to+Artemia+Nauplii%5BTitle%5D)+AND+%22Tr.+J.+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii.</a> Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).</li>
<li>Persoone, G., Wells, P. G. Artemia in aquatic toxicology: a review. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPersoone%2C+G+%22Artemia+Research+and+its+Applications.+Morphology%2C+Genetics%2C+Strain+characterization+Toxicology%22">Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology</a>. Sorgeloos, P. , Universita Press. Belgium. 259-275 (1987).</li>
<li>Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+genus+Artemia+in+ecotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Envir.+Poll%22%5BJournal%5D)">Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing.</a> Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).</li>
<li>APAT IRSA-CNR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Metodi+analitici+per+le+acque+Manuali+e+Linee+guida+29%2F2003%22">Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003</a>. Terzo Metodo, 8060(2003).</li>
<li>Sorgellos, P., Wielen, C. R. emiche-V. anD. er, Persoone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Artemia+nauplii+for+toxicity+tests+%C3%A2%E2%82%AC%E2%80%9C+a+critical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotox.+Env.+Saf%22%5BJournal%5D)">The use of Artemia nauplii for toxicity tests â€“ a critical analysis.</a> Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).</li>
<li>Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Set+up+of+a+standard+methodology+for+14-day+bioassay+on+Artemia+franciscana+and+A.+parthenogenetica%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Amb%22%5BJournal%5D)">Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica.</a> Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).</li>
<li>Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+toxicity+of+arsenic+to+the+Great+Salt+Lake+brine+shrimp%2C+Artemia+franciscana%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotox.+Environ.+Saf%22%5BJournal%5D)">Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana.</a> Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).</li>
<li>Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+a+chronic+site-specific+water+quality+standard+for+selenium+in+the+Great+Salt+Lake%2C+Utah%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA.</a> Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).</li>
<li>Qualitá dell'acqua - Determinazione della tossicitá letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Commissione+UNICHIM+%22Qualit%C3%A1+dell%27acqua%22+Gruppo+di+Lavoro+%22Metodi+Biologici%22+Sottogruppo+%22Acque+salate%2Fsalmastre+e+sedimenti%22%22">Commissione UNICHIM "Qualitá dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti"</a>. , UNICHIM. (2010).</li>
<li>Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cholinesterases+and+evaluation+of+the+inhibitory+potential+of+chlorpyrifos+and+dichlorvos+to+Artemia+salina+and+Artemia+parthenogenetica%5BTitle%5D)+AND+%22Chem%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica.</a> Chem. 48, 563-569 (2002).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Artemia is een van de meest waardevolle testorganismen beschikbaar voor ecotoxicologische tests en onderzoek tot nu toe gedaan kunnen we stellen dat het mogelijk is om de ondersteuning van meerdere opties met betrekking tot Artemia gebruik in de toxicologie en ecotoxicologie. De kenmerken van dit organisme te zetten in een geschikte soorten voor bioassays zijn: een brede geografische spreiding, een hoog aanpassingsvermogen aan ongunstige milieu-omstandigheden en gevarieerde voedingsstoffen, relatief ee...

Geproduceerd door Loredana Manfra van Instituut voor milieubescherming en onderzoek (Ispra-Department of Environmental Quality Monitoring) en Federica Savorelli van regionale agentschap voor milieubescherming (Emilia-Romagna, Italië). Referentie leden voor de sub-werkgroep over de Artemia schaaldieren binnen de biologische methoden Groep - Saltwater / brak water en sediment van de UNICHIM Commissie op de waterkwaliteit (het instituut voor de technische normen die in de chemische sector). Videografie en te bewerken, Marco Pisapia van Ispra (Scientific Advisory Services en Documentatie). Productie Coördinatie door Anna Maria Cicero en Erika Magaletti van Ispra (Department of Environmental Quality Monitoring). We willen het Gewestelijk Agentschap bedanken voor milieubescherming van Emilia-Romagna, Ferrara Branch en de BiologiCal Methoden Groep - Saltwater / brak water en sediment van de UNICHIM Commissie voor de Kwaliteit van het water voor hun medewerking, Rossella Boscolo en Massimo Gabellini van Ispra (Afdeling Preventie en tegengaan van de effecten) voor hun financiële steun, en de London School van de talen in Rome voor hun taalkundige ondersteuning. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Productnummer </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4390 </td></tr></tbody></table> Bijlage De algen media moet worden bereid met behulp van analytische kwaliteit reagentia. Een liter voedingsoplossing wordt bereid door 300 g NaNO 3, 30 g KH PO 2 4 en 20 g NH4CI in gedestilleerd water. Vier eerste oplossing (A, B, C, D) Van mineralen als volgt bereid: <ul><li> Een liter oplossing &quot;A&quot; met 30 g ZnSO 4 H 2 O 25 g van CUSO4 5 H 2 O 30 g CoSO 4 7 H2 O en 20 g MnSO 4 H2O in gedestilleerd water; </li><li> Een liter oplossing &quot;B&quot; met 50 g FeCl3 • 6 H2O in gedestilleerd water; </li><li> Een liter oplossing &quot;C&quot; met 25 g Na 2 MoO 4 • 2 H2O in gedestilleerd water; </li><li> Een liter oplossing &quot;D&quot; met 50 g di Na2EDTA • 2 H2O in gedestilleerd water. </li></ul> Een liter van een definitieve oplossing van mineralen (oplossing &quot;E&quot;) wordt verkregen toevoeging aliquots van de bovengenoemde oplossingen gedestilleerd water. De volgorde van toevoeging aanbevolen: 100 ml &quot;D&quot;, 10 ml &quot;C&quot;, 10 ml &quot;B&quot; en 10 ml &quot;A&quot;. Drie initiatievenl oplossingen (F, G, H) van vitaminen worden als volgt bereid: <ul><li> Een liter oplossing &quot;F&quot; met 100 mg van biotine in gedestilleerd water; </li><li> Een liter oplossing &quot;G&quot; met 10 g thiamine in gedestilleerd water; </li><li> Een liter van de oplossing &quot;H&quot; met 100 mg cobalamine in gedestilleerd water. </li></ul> Een liter uiteindelijke oplossing een vitaminen (oplossing &quot;I&quot;) wordt verkregen 10 ml van de eerste drie oplossingen gedestilleerd water. Een liter van algen media bereid door 1 ml van de voedingsoplossing, 1 ml van de minerale uiteindelijke oplossing (oplossing &quot;E&quot;) en 1 ml van de vitamine uiteindelijke oplossing (oplossing &#39;I&#39;) in zeewater. Dit laatste kan verkregen worden door het oplossen pa reagentia of een commercieel verkrijgbare formulering met gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Zout mengsels voor het creëren van de ideale zout water zijn commercieel verkrijgbaar, zoals de Instant Ocean mengsels. Het aanbevelingDed het gebruik van een zeewater met een zoutgehalte van 30 (± 2) PSU en de temperatuur van 20 (± 1) ° C.

lange-termijn lethal toxiciteit test met de schaal- artemia franciscana</em

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Onze onderzoeksactiviteiten gericht op het gebruik van biologische methoden voor de evaluatie van de milieukwaliteit, met bijzondere aandacht voor zout / brak water en sediment. De keuze van de biologische indicatoren moeten gebaseerd zijn op betrouwbare wetenschappelijke kennis en, eventueel, van de beschikbaarheid van gestandaardiseerde procedures. In dit artikel presenteren we een gestandaardiseerd protocol dat het mariene schaaldieren Artemia gebruikt om de toxiciteit van chemische stoffen en / of van het mariene milieu matrices te evalueren. Wetenschappers stellen dat de pekelkreeftjes (Artemia) is een geschikte kandidaat voor de ontwikkeling van een standaard bioassay voor wereldwijd gebruik. Een aantal kranten zijn gepubliceerd op de toxische effecten van verschillende chemische stoffen en toxische stoffen op artemia (Artemia). Het grote voordeel van deze schaal voor de toxiciteit studies is de algehele beschikbaarheid van de droge cysten, deze kan onmiddellijk worden gebruikt bij het testen en moeilijke teelt is niet vereist <sup&gt; 1,2. Cyste op basis van toxiciteit testen zijn goedkoop, continu beschikbaar, eenvoudig en betrouwbaar en zijn dus een belangrijk antwoord op routine behoeften van toxiciteit screening, voor industriële controle-eisen of voor regelgevende doeleinden 3. De voorgestelde methode houdt in de sterfte als eindpunt. Het aantal overlevenden werden geteld en het percentage van de sterfgevallen werden berekend. De larven werden als dood beschouwd als ze een interne of externe beweging niet vertonen tijdens de enkele seconden van observatie 4. Deze procedure werd gestandaardiseerd testen referentiestof (natriumdodecylsulfaat), ongeveer resultaten worden in dit werk. Dit artikel hoort een video, die de prestaties van de procedurele toxiciteit beschrijft, waarin alle stappen die verband houden met het protocol.

Dit onderzoek betreft de ontwikkeling en standaardisatie van een waardevolle methodologische protocol op lange termijn (14 dagen) dodelijke toxiciteit die wordt uitgeoefend door chemische stoffen, industrieel afvalwater of in de riolering en vloeibare milieu monsters op de zoutwater schaaldieren te bepalen,<em&gt; Artemia franciscana</em&gt;.

Lange-termijn Lethal toxiciteit Test met de Schaal- Artemia franciscana</em

Onze onderzoeksactiviteiten richten zich op het gebruik van biologische methoden voor de evaluatie van de milieukwaliteit, met specifieke aandacht voor zout/brak ...

Wij zijn Laura Manfra en Federica Selli, onderzoekers van het Higher Institute for Environmental Protection and Research, ISRA, afdeling Environmental Quality Monitoring Laboratory of Phytoplankton, echo Toxicology and Ecology. Onze onderzoeksactiviteiten richten zich op het gebruik van biologische methoden voor de evaluatie van de milieukwaliteit, met specifieke aandacht voor zout water, brak water en sediment. Onze meest recente studie betreft de ontwikkeling en standaardisatie van een waardevol methodologisch protocol om de langetermijn letale toxiciteit (14 dagen) te bepalen die wordt uitgeoefend door chemische stoffen, industrieel afval, afvalwater of rioolwater en vloeibare milieu-monsters op het zoutwaterkreeftje artia Franciscan.Deze video beschrijft de uitvoering van procedurele toxiciteitstesten. Onze testen houden in dat artia-larven worden blootgesteld aan een reeks substantiatieconcentraties of een testmonster met als doel de concentratie- of verdunningsniveaus te bepalen die leiden tot de dood van 50% van de blootgestelde organismen gedurende 14 dagen, waarbij voldaan wordt aan de door deze methode gedefinieerde voorwaarden. Indien nodig en mogelijk kunnen ook de volgende aspecten worden bepaald.De concentratie die leidt tot de dood van 20% van de blootgestelde organismen, de hoogste geanalyseerde concentratie die geen hogere mortaliteit veroorzaakt dan die van de negatieve controle, en de laagste geteste concentratie die na 14 dagen een hogere mortaliteit veroorzaakt dan die van de negatieve controle. Voor het uitvoeren van de testen had ons team Franciscan-larven nodig van minder dan 48 uur oud in stadium twee of drie, verkregen uit vers uitgekomen eieren. U kunt synthetisch zout water gebruiken als verdunningswater, bereid door erkende reagentia van analytische kwaliteit of een commercieel verkrijgbare formulering op te lossen in gedestilleerd of gedeïoniseerd water.Na 48 uur variatie en filtratie door filters met een porositeit van ten minste 0,45, kan de verdunning maximaal 30 dagen in het donker worden bewaard. Bij een temperatuur van 0,4 graden moeten de testorganismen worden gevoed met Ella Ter microalgen, die exponentieel groeien met dichtheden tussen 1,3 × 10⁶ en 2,0 × 10⁶ cellen/ml. De referentiestof in deze test is natriumdodecylsulfaat.Naast de gebruikelijke laboratoriumapparatuur heeft u ook de volgende testcontainers nodig, waaronder borosilicaatglas bekerglazen van 100 millimeter, een maatkolf van 500 millimeter voor het bereiden van de standaardoplossing, zes maalkolven van honderd millimeter voor het bereiden van de testoplossingen, glazen of polyglazen Petri-schalen met een diameter van vijf centimeter en afneembare deksels voor het activeren van de cysten en het overbrengen van de artia van het uitbroedingsschal naar de testcontainers. Glazen Pasteurpipetten, waarvan de punten met een vlam zijn afgerond voor het overbrengen van de nauplii, glazen kanulepipetten of drie disposable plastic pipetten van drie milliliter die worden afgeknipt voor het overbrengen van de artia, micropipetten en maatpipetten voor het bereiden van de testoplossingen. Zes maatcilinders van 50 milliliter voor het overbrengen van testoplossingen van de kolven naar de testcontainers om de testorganismen te genereren.Plaats 48 uur voor de test 20 milligram cysten in een Petrischaal met 12 milliliters verdunningswater. Houd de schaal gedurende één uur op 25 graden en bij een lichtintensiteit van 4 000 lumen per vierkante meter. Na 24 uur worden de uitgekomen larven overgebracht naar een nieuwe Petrischaal gevuld met kunstwater.Voer de overdracht uit met de microscoop en gebruik een lichtbron, zodat de uitkomende fototrope larven naar de lichtbundel migreren. Gebruik een glazen Pasteurpipet voor de overdracht en zorg ervoor dat u alleen de pasgeboren larven overbrengt en niet de cysten zelf of larven die zich nog in membranen bevinden. Plaats de schaal met de larven gedurende nog eens 24 uur bij 25 °C in een donkere thermostaatkamer.De standaardoplossing voor de te testen stof moet worden bereid door een halve gram van de stof op te lossen in een maatkolf van 500 milliliter. Vul deze aan met gedeïoniseerd of gedestilleerd water en roer tot de stof volledig is opgelost. Oplossingen moeten op het moment van gebruik worden bereid, tenzij bekend is dat de stof stabiel is in oplossing.In dat geval kunt u de standaardoplossing tot twee dagen voor de test voorbereiden. U moet de negatieve controle voorbereiden in een kolf van 200 milliliter door een adequate hoeveelheid algensuspensie aan het verdunningswater toe te voegen, zodanig dat u een dichtheid van 10⁵ cellen per milliliter verkrijgt. De testoplossingen moeten worden bereid in kolven van 100 milliliter door de standaardoplossing in de gespecificeerde hoeveelheid aan het verdunningswater toe te voegen, zodat u de gewenste concentraties voor de tests verkrijgt.Om de organismen te voeden, dient u een hoeveelheid suspensie van duna teta microalgen te gebruiken; voeg deze toe bij het bereiden van de testoplossingen totdat een dichtheid van 10⁵ cellen/ml is bereikt. Voordat u begint, raden wij aan om deze volgorde van toevoeging aan te houden: verdunning, water, algensuspensie en vervolgens de standaardoplossing. Breng met behulp van de maatcilinder gelijke hoeveelheden, 50 ml, van de testoplossingen over in de testcontainers.Maak voor elke concentratie drie replica's voor elke reeks tests. Bereid een controlecontainer voor met een hoeveelheid verdunningswater die gelijk is aan het volume van de testoplossingen. Breng gelijke volumes van ongeveer 12 milliliters van de testoplossingen aan in de Petrischalen.Maak voor elke reeks tests een controle-petrischaal. 48 uur na de activatie van de cysten bereiken de nylen het tweede en derde larvale stadium en zijn nu bruikbaar voor tests. Haal de petrischaal die is gebruikt voor de activatie van de cysten uit de thermostaatkamer.Breng een kleine hoeveelheid larven over naar de Petrischalen met de controle- en de testoplossingen. In deze fase van de test kunt u de overdracht uitvoeren met een glazen Pasteurpipet, waarvan de punt met een vlam is afgerond, en een zijdelings geplaatste lichtbron die de artia aanzet tot aggregatie. Breng 10 larven over vanuit de testoplossingen.Petrischalen naar de testcontainers. Voer deze bewerking ook uit met behulp van de pipet en microscoopglas; dek de testbekers af met parafilm, waarbij een opening voor luchtpassage wordt gelaten, en houd deze gedurende de gehele testperiode op een temperatuur van 25 °C. Gebruik een verlichting van 900 lumen per vierkante meter met een fotoperiode van 14 uur licht en 10 uur donker, beginnend twee dagen na de start van de test.Observe vervolgens na 5, 7, 9 en 12 dagen de artia onder de microscoop en verifieer hun overlevingspercentage. Tijdens het testen moeten organismen die gedurende ongeveer 10 seconden geen beweging vertonen als dood worden beschouwd; vervang het medium en de voedingssupplementen. U moet de testoplossingen periodiek vervangen, waarbij u deze bereidt op dezelfde dag als waarop ze worden gebruikt.Stel de testoplossingen samen uit de standaardoplossing die u eerder heeft bereid. Voer de ARTIA-overdracht uit met een EPI PET met een voldoende grote diameter om te voorkomen dat de organismen tijdens deze fase worden beschadigd. U kunt een plastic posterpijp-pett van drie millimeter gebruiken, die na 14 dagen blootstelling kan worden doorgesneden.Tel aan het einde van de test het aantal overlevende larven en noteer het resultaat op uw werkblad. Bereken de lc 50 en/of lc 20, NOEC en LOEC na 14 dagen en rapporteer deze waarden. Betrouwbaarheidsgrenzen van 95% waren passend, evenals de gehanteerde berekeningsmethoden.Indien aan het einde van de test de volgende voorwaarden zijn vervuld: de gemiddelde mortaliteit van de controles is minder dan of gelijk aan 20% bij gebruik van natriumdodecylsulfaat en de LC₅₀ na 14 dagen valt binnen het interval van 8,0 mg/L. Als aan de voorafgaande voorwaarden niet is voldaan, moeten alle gegevens die met dezelfde batch organismen zijn verkregen als ongeldig worden beschouwd en moet de test worden herhaald.

long-term-lethal-toxicity-test-with-the-crustacean-artemia-franciscana

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video introduceert een overlevingstest op korte termijn die een behandeling op acute toxiciteit test of een genetische stam test op resistentie tegen een toxische aandoening.  Het voorbeeldprotocol toont een voorbeeld overlevingstest waarbij wormen worden getest op hun vermogen om oxidatieve stress veroorzaakt door paraquat (PQ) te weerstaan.

C. elegans Overlevingstest: een toxiciteitstest op korte termijn

Een protocol wordt beschreven voor in vivo detectie van effecten van mitochondriale remmers in het modelorganisme Caenorhabditis elegans en voor identificatie van potentiële versterkende verbindingen. Dit protocol kan worden gebruikt om geneesmiddelenbibliotheken te screenen op verbindingen die de mitochondriale functie moduleren.

Een Screenbare<em&gt; In Vivo</em&gt; Test voor Mitochondriale Modulators gebruik van Transgene Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Blootstelling aan toxische stoffen in het milieu kan acuut ontwikkeling met effecten op lange termijn beïnvloeden. Gedetailleerde protocollen worden geleverd om te illustreren een strategie met behulp van een effectieve lab-model om te bestuderen van het effect van vroege embryonale blootstelling aan Bisfenol A. Wij bieden vruchtbaarheid en gedrags tests om de doelmatigheid van onze toxische blootstelling bio-tests.

Gedrags- en reproductieve gevolgen van embryonale blootstelling aan toxische stoffen in lage dosis op lange termijn

In dit werk beschrijven we een acute, chronische en multigeneratie bioassay om te bestuderen van de effecten van gemeenschappelijke en gecombineerde stressoren op de Turquoise poolfish Nothobranchius furzeri. Dit protocol is ontworpen om te bestuderen levensgeschiedenis eigenschappen (sterfte, groei, vruchtbaarheid, gewicht) en kritieke thermische maximum.

Protocol voor Acute en chronische ecotoxiciteit testen van de Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

In dit protocol, we laten zien hoe fokken Astyanax mexicanus volwassenen, verhogen van de larven en geheel-mount immunohistochemistry op post larvale vissen te vergelijken van de fenotypen van oppervlak en grot morphotypes uitvoeren.

De Mexicaanse Tetra Astyanax mexicanus in te zamelen voor de analyse van de fenotypen van de Post-larval en geheel-mount Immunohistochemistry

Zebravis embryo's worden gebruikt voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen. Ze ontwikkelen zich extern en zijn gevoelig voor chemicaliën, waardoor subtiele fenotypische veranderingen kunnen worden opgespoord. Het experiment vereist slechts een kleine hoeveelheid stof, die direct wordt toegevoegd aan de plaat die embryo's bevat, waardoor het testsysteem efficiënt en kosteneffectief is.

Snelle evaluatie van de toxiciteit van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo's

Dit werk is gericht op het evalueren en herzien van de Artemia salina letaliteit bioassay procedure, ook geïdentificeerd als pekel garnalen letaliteit ashality assay. Deze eenvoudige en goedkope methode geeft informatie over de algemene toxiciteit (beschouwd als een voorlopige toxiciteitsevaluatie) van monsters, namelijk natuurlijke producten.

Letaliteit Bioassay met behulp van Artemia salina L.

Hier presenteren we een protocol om geïsoleerde individuele nematoden op vaste media te kweken voor levenslange fysiologische parametertracking en fluorescentiekwantificering. Dit kweeksysteem omvat een palmitinezuurbarrière rond putten met één worm om te voorkomen dat dieren vluchten, waardoor aversieve interventies mogelijk zijn, waaronder pathogene bacteriën en chemische stressoren.

Langetermijnkweek van individuele Caenorhabditis elegans op vaste media voor longitudinale fluorescentiemonitoring en aversieve interventies

Het artikel stelt een nieuwe in vitro methode voor voor de snelle en gevoelige beoordeling van de toxiciteit en ecotoxiciteit van polluenten, gebaseerd op de beweeglijkheid van Mytilus galloprovincialis hemocyten. De methode heeft tot doel bij te dragen tot de ontwikkeling van meer ethische en sensitieve toxicologische en ecotoxicologische blootstellingsproeven.

Een toxicologische en ecotoxicologische test op basis van de hemocytenmotiliteit van mossel (Mytilus galloprovincialis)

Dit protocol beschrijft een screeningprocedure voor geneesmiddelen bij zebravislarven 3-7 dagen na de bevruchting, gevolgd door morfologische beoordeling.

Screening van kleine moleculen en toxiciteitstesten bij zebravislarven in een vroeg stadium

Leer een gestandaardiseerde methode voor het beoordelen van langetermijnlethale toxiciteit (14 dagen) bij Artemia franciscana. Dit protocol helpt onderzoekers om de ecologische impact van chemische stoffen op mariene organismen te evalueren.

Lange-termijn Lethal toxiciteit Test met de Schaal- Artemia franciscana

Meer video's verkennen