Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie
February 15th, 2012
Microbiële biofilms zijn over het algemeen gevormd door verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen. Eencellige analyse van deze subpopulaties vereist het gebruik van fluorescerende reporters. Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren en controleren meerdere subpopulationswithin B. subtilis Biofilms met behulp van fluorescentie microscopie en flowcytometrie.
Het algemene doel van deze procedure is om de verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen te visualiseren en te kwantificeren die differentiëren in biofilms van het modelorganisme, bacillus subtles. Dit wordt bereikt door eerst transcriptionele reporters in het chromosoom van B subtles te plaatsen. Deze reporters worden uitsluitend geëxpresseerd in de subpopulatie van cellen die onderzocht worden.
De volgende stap is het bevorderen van de ontwikkeling van een biofilm door B subtles te laten groeien in het biofilm-inducerende medium, Ms GG gg. Na biofilmvorming worden de cellen uit de biofilm gedispergeerd en gefixeerd met para formaldehyde. De laatste stap van de procedure is het detecteren van het fluorescentiesignaal dat door enkele cellen van de microbiële gemeenschap wordt uitgezonden, met behulp van fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie.
Uiteindelijk laten de resultaten zien hoe cellen gespecialiseerd zijn in productie en secretie. De extracellulaire matrix die de biofilm vormt, is een andere subpopulatie dan de cellen die surfactant, het signaalmolecuul dat verantwoordelijk is voor de differentiatie van de subpopulatie van matrixproducenten, afscheiden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals kwantificering van transcriptie-expressie met behulp van Vita Ities-assays van microray-analyse, is dat het ons in staat stelt de genexpressie op enkelcelniveau te monitoren en met name kleine celpopulaties van cellen te visualiseren die gespecialiseerd zijn in het tot expressie brengen van een specifiek gen.
Deze genexpressies worden niet gedetecteerd bij het analyseren van de totale populatie. Integratieve plasmiden worden gebruikt voor het labelen van B subtles en een voorbeeld wordt hier getoond. PTAA, de promotor van de genen die verantwoordelijk zijn voor de productie van tass.
Een matrix-eiwit wordt gekloond in de vector met behulp van de restrictieplaatsen ECO R één en Hindi drie. De expressie van het CFP-reportergen is nu onder de controle van ptap A om de procedure voor het labelen van B te beginnen, lineariseer het integratieve plasmide door middel van enzymatische vertering. Het aanbevolen restrictie-enzym is XH oh één wanneer het integratieve plasmide klaar is, induceer natuurlijke competentie in B subtlest stam 1 68 door de cellen vijf uur lang te laten groeien in competentie-inducerend medium bij 37 graden Celsius.
Voeg het gelineariseerde plasmide toe aan de cultuur van competente B subtlest-cellen en incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Na twee uur, plateer de cellen op agar met spect mycine en incubeer een nacht bij 37 graden Celsius. Het B subtles-chromosoom heeft twee neutrale loci, Amy, E, E en LAC A, die kunnen worden gebruikt om reporter-fusies te integreren zonder de ontwikkeling van de biofilm te beïnvloeden. Het gelineariseerde PKM 0 0 8-plasmide integreert in het genoom van B subtles door dubbele recombinatie.
De volgende stap is het overbrengen van de reporter van de gelabelde stam naar een stam die in staat is om biofilms te vormen met behulp van het SPP één phage-transductieprotocol. Voor het doel van deze video worden alleen de belangrijkste stappen in het protocol getoond. Laat de donor stam 1 68, die de reporter-fusie bevat, groeien in TY-medium bij 37 graden Celsius tot de cultuur de vroege stationaire fase bereikt bij 200 microliter cellen tot 100 microliter verdunde phage-voorraad in een glazen buis.
En laten we staan bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Pipet vervolgens hete TY zachte agar in de buis en meng grondig door te vortexen. Verspreid voorzichtig op een verse TY-plaat en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende acht tot zestien uur om phage-halo's te laten ontstaan.
Om de phage-halo's te verzamelen, voeg drie milliliter TY-medium toe aan de plaat en gebruik de glazen pipet om de bovenste agar te breken. Breng de agarsuspensie over in een 15 milliliter falconbuis. Vortex voorzichtig om de agar te breken en centrifugeer vervolgens gedurende 15 minuten bij 1000 G.
Breng het supernatant over in een nieuwe buis. Laat het supernatant passeren door een punt 22 micron-spuitfilter. Gebruik dit supernatant om een cultuur van de ontvangerstam te infecteren die in TY-medium is gekweekt.
Voeg 30 microliter supernatant toe aan 10 milliliter cultuur verdund met één op tien en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Centrifugeer vervolgens bij 5.000 RPM gedurende zeven minuten, resuspendeer de pellet in 200 microliter TY-medium en spreid het uit op een plaat met SPECT mycine plus 10 millimolar. Natriumcitraat.
Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 12 tot 36 uur. Selecteer een kolonie en laat deze een nacht groeien in vloeibaar LB bij 37 graden Celsius. Ten slotte, spot drie microliter van de nachtelijke cultuur op vast biofilm-inducerend medium.
Laat de cellen gedurende 72 uur groeien bij 30 graden Celsius. Na drie dagen groei zullen biofilms gevormd op het oppervlak van de Ms.GG-agar een complexe morfologische architectuur ontwikkelen in het oppervlak van de agar. Om deze procedure te beginnen, gebruik een tandenstoker of pincetten om de biofilm van het oppervlak van de MSGG-agar te verwijderen.
De consistentie van de biofilm zou het mogelijk moeten maken om deze van het oppervlak van de agar te pellen. In één stuk, plaats de biofilm in drie milliliter PBS-buffer, verspreid de biofilm door mild. Voer 12 pulsen uit met een uitvoer van drie en een amplitude van 0,7 seconden om de monsters te fixeren vóór enkelcelanalyse.
Resuspendeer 300 microliter van de celsuspensie in één milliliter, een 4%paraform aldehyde-oplossing, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende exact zeven minuten. Na de zeven minuten fixatie, was cellen in PBS-buffer drie keer. Resuspendeer ten slotte cellen in 300 microliter PBS-buffer voorafgaand aan fluorescentiemicroscopie.
Bereid een microscoopglas voor door 200 microliter van 0,8% agros over het glas te pipetten en het voorzichtig te bedekken met een ander glas. Verwijder na twee minuten voorzichtig het bovenste glas om een laag agros te verkrijgen die aan het glas op de bodem is gehecht. Twee microliters van gefixeerde cellen op het oppervlak van
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen in Bacillus subtilis biofilms te visualiseren en te kwantificeren. Door transcriptie-reporters en fluorescentietechnieken te gebruiken, kunnen onderzoekers deze subpopulaties effectief monitoren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiële biologie
- Biofilmonderzoek
- Cellulaire analyse
Achtergrond
- Microbiële biofilms bestaan uit gespecialiseerde celsubpopulaties.
- Single-cell analyse is essentieel voor het begrijpen van biofilmdynamiek.
- Fluorescente reporters worden gebruikt om deze subpopulaties te visualiseren.
- Bacillus subtilis dient als modelorganisme voor biofilmstudies.
Doel van de studie
- Om verschillende subpopulaties in B. subtilis biofilms te visualiseren.
- Om de differentiatie van gespecialiseerde cellen te kwantificeren.
- Om het begrip van de structuur van microbiële gemeenschappen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Invoegen van transcriptie-reporters in het B. subtilis chromosoom.
- Bevordering van biofilmontwikkeling met behulp van biofilm-inducerend medium.
- Dispergeer en fixatie van biofilmcellen met paraformaldehyde.
- Detectie van fluorescentiesignalen via microscopie en flowcytometrie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van verschillende celsubpopulaties.
- Kwantificering van gespecialiseerde celdifferentiatie in biofilms.
- Demonstratie van effectief gebruik van fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie.
- Inzichten in de structuur van microbiële gemeenschappen.
Conclusies
- Het protocol maakt gedetailleerde analyse van biofilmsubpopulaties mogelijk.
- Fluorescente reporters zijn cruciaal voor het bestuderen van microbiële dynamica.
- Deze methode kan worden toegepast op andere microbiële systemen voor soortgelijke studies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry enables precise quantification of specialized bacterial subpopulations, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach enhances predictive confidence in microbial community behavior, informing target validation and assay development for anti-biofilm strategies. The method's adaptability to other microbial models broadens its portfolio impact across infectious disease and microbiome research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of functionally distinct cell subpopulations within biofilms.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing matrix producers from surfactin producers at single-cell resolution.
- Improves predictive confidence in target selection by revealing spatial and temporal organization of microbial communities.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of gene expression heterogeneity in prokaryotic systems.
Screening & Assay Development
- Provides validated biological systems for downstream screening of anti-biofilm compounds.
- Delivers quantitative, reproducible outputs through flow cytometry and fluorescence microscopy.
- Enables standardization of reporter-based assays for high-content screening platforms.
- Supports reliable evaluation of compound effects on specific biofilm subpopulations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by capturing phenotypic heterogeneity in microbial communities.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by enabling single-cell resolution analysis.
- De-risks translational advancement by providing quantitative biomarkers of biofilm differentiation.
- Supports risk-adjusted decisions for advancing anti-biofilm candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly for anti-biofilm and microbiome-targeted programs.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by quantifying gene expression in specialized subpopulations.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for evaluating compound effects on biofilm architecture.
- Analytics: Delivers quantitative single-cell readouts for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and continuity across model systems when studying microbial heterogeneity.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to diverse microbial models and research objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial target validation.
- Operational Value: Standardizes single-cell analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-biofilm and microbiome assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, fluorescence microscopy, and flow cytometry.
- Demands access to calibrated flow cytometers and high-sensitivity fluorescence imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization of reporter constructs and analytical protocols.
- Adaptable to other microbial models with appropriate reporter integration strategies.
- Potential limitations include detection thresholds for rare subpopulations and need for rigorous controls.
