Name: Primaire Microglia Isolatie van Mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Leer primaire microglia isoleren uit neonatale rattenhersenen via mechanische disruptie en gemengde gliale cultuur. Deze methode levert hoge zuiverheid en levensvatbare cellen op voor in vitro studies naar microgliale functie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gefinancierd door de intramurale programma aan de geüniformeerde diensten Universiteit.

1. Dissectie van neonatale rat hersenweefsel <ol><li> Chill Leibovitz L-15 geconditioneerde media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% pen / strep) tot 4 ° C. Warm kweekmedia (DMEM + 10% FBS + 1% penicilline / streptomycine) tot 37 ° C. Bereid 4 60x15 mm petrischaaltjes met 4-5 ml van de geconditioneerde L-15 media op ijs. Steriliseer alle chirurgische instrumenten met 100% ethanol. </li><li> Spoel de P2 neonatale rap pups met 70% ethanol. (Neonatale jonge ratten tussen de P1-P5 kan gebruikt worden in dit protocol.) </li><li> Snel onthoofden een rat pup met steriele scherpe schaar en onmiddellijk vallen de kop in 70% ethanol. Herhaal dit voor een totaal van 5 jonge ratten vervolgens over kop in de zoutoplossing. </li><li> Verwijder de hele hersenen van de hoofden en plaats in een petrischaal met 4 - 5 ml L-15 oplossing (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) op ijs. </li><li> Herhaal de procedures 1,2 tot 1,4 voor de overige pups in het nest. </li><li> Verwijder de hersenvliezen van de hersenen en overdragen van de desIRED hersenweefsel (dat wil zeggen, cortex, cerebellum, hele hersenen, enz.) in een nieuwe petrischaal met 4-5 ml L-15 oplossing (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) op ijs. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Gemengde glia cel Bevolking <ol><li> Zonder schadelijke hersenweefsel met een schaar of een mes, over te dragen het weefsel met een 10 ml pipet op een steriele 50 ml conische buis. </li><li> Centrifugeer conische bij 2.500 RCF gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Zuig bovenstaande vloeistof. Voeg 4-5 ml vers L-15 media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep). </li><li> Pipetteer weefsel op en neer 10 keer met een steriele pipet van 10 ml. </li><li> Plaats een cel zeef (100 um poriën) op een verse 50 ml conische buis. Pipetteer weefsel en neer eenmaal met een steriele 5 ml pipet en met de pipet vlak in de cel zeef, afgezien van het materiaal door de cel zeef in de conische buis. </li><li> Spoel de cel zeef met 4-5 ml vers L-15 media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep). </li><li> Centrifugeer conische met gespannen cellen 2500 RCF gedurende 5 min bij 4 ° C. </li></ol> 3. Plating en onderhoud van de Gemengde glia cel culturen <ol><li> Voor elke rat brain pup verwerkt bereiden 1 steriele T-75 kolf door 12 ml kweekmedium (DMEM + 10% FBS + 1% penicilline / streptomycine) in elke kolf. </li><li> Zuig het supernatans van de gepelleteerde cellen en voeg 5-6 ml van de cultuur media om de cel pellet. Pipetteer en neer 10 keer met 10 ml pipet. </li><li> Breng een gelijk volume celsuspensie elk T-75 fles. </li><li> Incubeer flessen in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C in totaal 1-3 weken. </li><li> Kolven moet eerst gedurende 5 dagen en op de vijfde dag het kweekmedium vervangen in elke kolf met 12 ml vers medium en teruggaan naar de incubator. Vervolgens elke 3 dagen vervangen geconditioneerde media in elke kolf met 12 ml vers medium tot confluentie bereiken. Dit moet te doenne zorgvuldig zonder contact met de bodem van de flessen waarin de cellen hechten. </li></ol> 4. Isolatie en beplating van primaire Microglia <ol><li> Na het gemengde gliale culturen zijn volledig confluent, verwijder flessen uit de incubator en bedek fles caps met parafilm om de gasuitwisseling te voorkomen met omgevingslucht. </li><li> Schudkolven 100 rps (Lab Companion SI-600, Jeio Tech) gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Verzamelen media uit flessen met een 10 ml pipet zonder dat de astrocyten laag op het oppervlak kolf. Plaats de media in 50 ml conische buizen. Voeg verse media om de kolven en terug te keren kolven op de incubator. </li><li> Centrifugeer conisch bij 2500 RCF gedurende 5 min bij 4 ° C. </li><li> Zuig supernatant van alle conisch. Celpellets zijn hoge zuiverheid microglia cellen. Hersuspenderen pellets in 1 ml microglia plating media (DMEM + 10% FES + 1% penicilline / streptomycine). </li><li> Tel de celdichtheid in de geresuspendeerde media meteen hemocytometer. </li><li> Voeg een zodanige hoeveelheid van microglia plating media om een ​​2 x 10e5 cellen per ml dichtheid te bereiken. Plaat geschikt voor experimentele analyse. </li><li> Laat microglia een nacht aan te sluiten. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Het protocol hierboven beschreven resulteert in een hoge zuiverheid primaire microglia culturen. Zoals bepaald door immunohistochemie voor een macrofaag / microglia cel-specifieke marker (Iba1), vergulde microglia culturen zijn&gt; 90% zuiver (figuur 2). Daarnaast kleuring voor astrocyten, oligodendrocyten en neuron-specifieke markers demonstreert minimale vervuiling (figuur 2). Na de oprichting van gemengde gliale celculturen, kan microglia worden geïsoleerd door schudden tot 4 opeenvolgende keer. De eerste microglia isolatie levert ongeveer 2,2 x 106 cellen / ml of circa 9 miljoen cellen per 10 kolven en de verwachte opbrengst afneemt met de opeenvolgende shake. Microglia geïsoleerd met behulp van deze methode zijn met succes gebruikt om de fagocytose vermogen, functie zoals stikstofoxide productie, en neuronale toxiciteit (figuur 3) 13-14 onderzoeken. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig1.jpg" /> Figuur 1. Overzicht van het protocol voor het bereiden van gemengde gliale celculturen en isolatie van primaire microglia. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig2.jpg" /> Figuur 2. Isolatie van hoge zuiverheid microglia, zoals bevestigd door immunohistochemische analyse met behulp van microglia (IBA-1, rood), astrocyten (GFAP, groen), neuron (Neun, rood) en oligodendrocyt (CC1, rood) specifieke markers. Kleuring voor DNA van cellen in kweek met DAPI (blauw) wordt ook getoond. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig3.jpg" /> Figuur 3. Microglia geïsoleerd in de methode described zijn in een aantal analyses, inclusief maar niet beperkt tot fagocytose assays, functie assays en neurotoxiciteit. In deze studies hebben wij gevonden dat microglia (IBA-1 positieve, groen), bij blootstelling aan controle (A) of LPS (B) behandeld media hun fagocytose van fluorescent gemerkte latex bolletjes (rood), die kan worden gekwantificeerd verhogen ( C). Verder kan LPS (1ng/ml) behandeling verhogen stikstofmonoxide microglia (D). Tot slot, via zowel transwell insert-gescheiden of direct microglia-neuron culturen, hebben we ontdekt dat microglia geïncubeerd met LPS kan neuronale celdood zoals gemeten door lactaat dehydrogenase (LDH) release (E, F).

<ol><li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+physiology%3A+unique+stimuli%2C+specialized+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
<li>Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroglial+activation+repertoire+in+the+injured+brain%3A+graded+response%2C+molecular+mechanisms+and+cues+to+physiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).</li>
<li>Loane, D. J., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in neurotrauma.</a> Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).</li>
<li>Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+inflammation+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration.</a> Cell. 140, 918-934 (2010).</li>
<li>Pocock, J. M., Liddle, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+signalling+cascades+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease.</a> Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).</li>
<li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li>
<li>Barger, S. W., Basile, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+microglia+by+secreted+amyloid+percursor+protein+evokes+release+of+glutamate+by+cystine+exchange+and+attenuates+synpatic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function.</a> J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+primary+microglia%3A+isolation%2C+culturing%2C+and+selected+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17(2010).</li>
<li>Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+flow+cytometric+characterization+of+newborn+mouse+brain-derived+microglia+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro.</a> J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).</li>
<li>Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+newborn+rabbit+brain-derived+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).</li>
<li>Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+fetal+brain-derived+microglia+in+in+vitro+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture.</a> Neuroscience. 41, 149-158 (1991).</li>
<li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus%3A+immunophenotypic+and+functional+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li>
<li>Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptor+5+activation+inhibits+microglial+associated+inflammation+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity.</a> Glia. 57, 550-560 (2009).</li>
<li>Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+modulates+microglial+reactivity+and+neurotoxicity+by+inhibiting+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase.</a> J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Hoewel dit protocol wordt routinematig gebruikt om zuivere en gezonde microglia voor onderzoek experimenten te produceren, zal een zorgvuldige afweging van technische aspecten tijdens de kritieke delen van de procedure de variabiliteit te minimaliseren in de geïsoleerde microglia. In de eerste plaats tijdens de dissectie van het hersenweefsel van de neonatale rat, pups, het werken in een tijdig is nodig om hypoxische en ischemische schade aan het weefsel te minimaliseren. Het is echter ook belangrijk de meningitis bekle...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Petrischalen </td><td> Fisher merk </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> Sharp ontleden schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14094-11 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 7b tang-standaard tips, gebogen, 11cm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11270-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 tang-standaard tips, recht, 11 cm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml conische centrifugebuizen </td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml serologische pipetten </td><td> Grenier Bio Een </td><td> 606180 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml serologische pipetten </td><td> Grenier Bio Een </td><td> 607180 </td><td></td></tr><tr><td> 100 micrometer steriele nylon cel zeef </td><td> Valk </td><td> 35-2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm2 weefselkweekflessen </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Minimaal essentieel Dulbecco&#39;s medium (DMEM) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz&#39;s L-15-medium </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td> Foetale paarden serum </td><td> Visser </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> 100% ethanol </td><td> De Warner Graham Company </td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing, 10X, pH 7,4 </td><td> Kwaliteit Biologische, inc. </td><td> 119-069-131 </td><td> 1X in steriel, gedestilleerd water </td></tr><tr><td> Biohazard zakken </td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser Wetenschappelijk </td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> 6-well celkweek platen met cellBIND oppervlak </td><td> Corning </td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

primaire microglia isolatie van mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia met ongeveer 12% van het totale cellulaire populatie in de hersenen van zoogdieren. Hoewel neuronen en astrocyten worden beschouwd als de belangrijkste celtypes van het zenuwstelsel, microglia een belangrijke rol spelen in de normale hersenfysiologie door het bewaken van weefsel voor vuil en ziekteverwekkers en onderhouden van homeostase in het parenchym via fagocytaire activiteit 1,2. Microglia worden geactiveerd tijdens een aantal van letsel en aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve ziekte, traumatisch hersenletsel, en het zenuwstelsel infectie 3. Onder deze activerende voorwaarden, microglia verhogen hun fagocytische activiteit, ondergaan morpohological en proliferatieve veranderingen, en het actief scheiden reactieve zuurstof en stikstof soorten, pro-inflammatoire cytokines en chemokines, vaak het activeren van een paracriene of autocriene lus 4-6. Aangezien deze microglia responsen bijdragen aan de ziekte pathogenese in neurologische aandoeningen, onderzoek gericht op microglia is gerechtvaardigd. Door de cellulaire heterogeniteit van de hersenen, is technisch moeilijk om voldoende microgliale monstermateriaal verkrijgen met hoge zuiverheid in in vivo experimenten. De huidige onderzoek naar de neuroprotectieve en neurotoxische functies van microglia vereisen een routine technische methode om consistent te genereren zuivere en gezonde microglia met voldoende rendement voor de studie. We presenteren, in tekst en video, een protocol om zuiver primaire microglia isoleren van gemengde glia culturen voor een verscheidenheid van stroomafwaartse toepassingen. Kortom, deze techniek maakt gebruik van gescheiden hersenweefsel van neonatale rat pups te produceren gemengde gliale celculturen. Na de gemengde gliale culturen te bereiken confluentie, worden primaire microglia mechanisch geïsoleerd van de cultuur door een korte duur van schudden. De microglia worden geplaat bij hoge zuiverheid voor experimenteel onderzoek. Het principe en het protocol van deze methodiek zijnbeschreven in de literatuur 7,8. Daarnaast zijn alternatieve methoden voor het primaire microglia isoleren goed 9-12 beschreven. Gehomogeniseerde hersenweefsel kan worden gescheiden door dichtheid gradiënt centrifugatie de primaire microglia 12 opleveren. De centrifugeren is gemiddelde lengte (45 min) en kan cellulaire schade en activering, alsmede, veroorzaken verrijkte microglia en andere cellulaire populaties. Een ander protocol is gebruikt om primaire microglia isoleren verschillende organismen bij langdurige (16 uur) schudden terwijl in cultuur 9-11. Na schudden, wordt de media supernatant gecentrifugeerd om microglia te isoleren. Deze langere twee-staps isolatie methode kan ook verstoren microgliale functie en activering. We voornamelijk gebruik maken van de volgende microglia isolatie-protocol in ons laboratorium voor een aantal redenen: (1) primaire microglia te simuleren in vivo biologie meer trouw dan vereeuwigd knaagdieren microglia cellijnen, (2) Nominale mechanische verstoring zo min mogelijk cellulaire disfunctie of activatie en (3) een voldoende opbrengst kan worden verkregen zonder passage van de gemengde gliale celculturen. Het is belangrijk op te merken dat dit protocol hersenweefsel maakt gebruik van de neonatale rat pups te isoleren microglia en dat het gebruik van oudere ratten te isoleren microglia kan aanzienlijk het rendement, activering status, en functionele eigenschappen van geïsoleerde microglia beïnvloeden. Er is bewijs dat ouder is verbonden met microglia disfunctie, verhoogde neuroinflammatie en neurodegeneratieve aandoeningen, hebben tot nu eerdere studies gebruikt ex vivo volwassen microglia beter inzicht in de rol van microglia in neurodegeneratieve ziekten is waar veroudering belangrijke parameter. Echter, ex vivo microglia niet in cultuur gehouden worden voor langere tijd. Hierdoor wordt in dit protocol wordt de levensduur van primaire microglia in cultuur moet worden opgemerkt dat de microglia d gedragenifferently van volwassen microglia en in vitro studies dient zorgvuldig te worden overwogen wanneer vertaald naar een in vivo setting.

Het isoleren van primaire microglia van de cellulaire heterogeniteit van de hersenen is essentieel om hun rol te onderzoeken in zowel fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol beschrijft een mechanische isolatie en gemengde celkweek techniek die hoge opbrengst en een hoge zuiverheid, levensvatbare primaire microgliale cellen voor<em&gt; In vitro</em&gt; Studie-en downstream-toepassingen.

Primaire Microglia Isolatie van Mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel

Microglia maken ongeveer 12% uit van de totale cellulaire populatie in de hersenen van zoogdieren. Hoewel neuronen en astrocyten worden beschouwd als de belangrijkste ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van primaire microgliacelculturen uit de hersenen van pasgeboren ratten. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen te isoleren en de hersenvliezen te verwijderen. De tweede stap is het homogeniseren van de hersenen en het uitplaten van de gemengde gliacultuur in T 75-flessen.Vervolgens worden de kolfjes 10 tot 14 dagen geïncubeerd totdat een astrocytenmonolaag confluentie heeft bereikt. De laatste stap is het schudden van de kolfjes om de microglia die bovenop de astrocytenmonolaag groeien los te maken, wat resulteert in een gezuiverde microglia-cultuur. Uiteindelijk kunnen primaire microglia met een hoge zuiverheid worden gebruikt in daaropvolgende in vitro enkelcelculturen en co-cultuuranalyses.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de Perico-gradiëntmethode, is dat de minimale mechanische disruptie microgliële dysfunctie of activatie minimaliseert, waardoor microglia voor experimenten gedurende weken na de initiële preparatie kunnen worden gegenereerd. Ik zal deze procedure demonstreren samen met Tammy Tero, een promovendus in het laboratorium van Dr. Clifton Dau guard. De microglia-culturen met een hoge zuiverheid die via dit protocol worden verkregen, kunnen worden gebruikt in in vitro experimenten om de functie van microglia te bestuderen onder normale fysiologische omstandigheden, cũng als onder pathologische ziekteomstandigheden.De responsiviteit van microglia op weefselschade en inflammatoire stimuli is direct relevant voor neurologisch letsel en neurodegeneratieve aandoeningen. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben omdat zij niet gewend zijn om de meninges tijdig van het hersenweefsel te verwijderen, wat noodzakelijk is om fibroblastcontaminatie in de primaire microglia-culturen te verminderen. Daarnaast moet er zorgvuldig worden gewerkt om de astrocytenmonolaag niet te beschadigen tijdens het schudden van de kolfjes en het hanteren van de microglia-culturen.Ter voorbereiding op de procedure wordt L 15-medium afgekoeld tot 4 °C, klaargezet in Petri-schalen van 60 bij 15 millimeter met L 15-medium en op ijs geplaatst. Verwarm het kweekmedium tot 37 °C en zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten zijn gesteriliseerd. Na het onthoofden van een P1 tot P5 rattenpup met een schaar, wordt de kop in 70% ethanol geplaatst.Nadat de koppen van vijf rattenpups zijn verzameld, worden de koppen overgebracht naar een zoutoplossing. Verwijder de volledige hersenen uit elke kop door voorzichtig incisies te maken aan beide zijden van de schedel boven de oren, waarna de hersenen worden uitgetrokken en in een van de Petrischalen met L 15-medium op ijs worden geplaatst. Zodra de eerste vijf hersenen naar L 15 op ijs zijn overgebracht, kunnen de volgende vijf pups op dezelfde wijze worden verwerkt totdat alle hersenen zijn verzameld.Verwijder de hersenvliezen door voorzichtig een rand van het vlies met een pincet vast te pakken en dit behoedzaam van de onderliggende cortex af te pellen. Het is essentieel om de hersenvliezen grondig en zo snel mogelijk te verwijderen. Breng na het verwijderen van de hersenvliezen elk van de hersenen over naar een schone Petrischaal met L 15 medium op ijs.Gebruik een pipet van 10 milliliter om het hersenweefsel en het medium uit de plaat op te zuigen in een steriele conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 2 500 RCF bij vier graden Celsius. Zuig na centrifugatie het supernatant af.Gebruik vervolgens een steriele pipet van 10 milliliter om het supernatant te verwijderen. Resuspendeer het pellet in vier tot vijf milliliter vers L 15 medium en pipetteer het medium en het weefsel 10 keer op en neer. Plaats vervolgens een cellzeef met poriën van 100 micron op een nieuwe conische buis van 50 milliliter.Gebruik een steriele pipet van vijf milliliter om de weefselsuspensie herhaaldelijk op en neer te pipetteren, en breng vervolgens het materiaal met de pipet tegen de celzeef aan om het door de zeef in de conische buis te dispenseren. Spoel de zeef met vier tot vijf milliliter vers gekoeld L 15-medium. Centrifugeer vervolgens bij 2.500 RCF gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Bereid voor elk verwerkt brein van een rattenpup een steriele T 75-fles voor door in elke fles 12 milliliters voorverwarmd kweekmedium toe te voegen. Aspireer vervolgens het supernatant van de gepelletteerde cellen en voeg vijf tot zes milliliters kweekmedium toe aan de celpellet; pipetteer dit 10 keer op en neer met een 10 milliliter pipette. Draag vervolgens een gelijk volume van de celsuspensie over naar elke T 75-fles.Incubeer de kolven in een incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 °C gedurende één tot drie weken, waarbij de cellen de eerste vijf dagen na het initiële uitplaten ongestoord blijven. Vervang na vijf dagen het geconditioneerde medium in elke kolf door 12 ml vers medium om confluentie te bereiken. Dit moet zeer voorzichtig gebeuren zonder de bodem van de kolf aan te raken waar de cellen aan hechten.Zodra de gemengde gliale culturen volledig confluent zijn, haalt u de kolf uit de incubator. Bedek de doppen van de kolven met parafilm om gasuitwisseling met de omgevingslucht te voorkomen en plaats de kolven gedurende een uur in een schudincubator ingesteld op 100 RPS en 37 °C. Nadat het uur is verstreken, gebruikt u een 10 ml pipet om het medium uit de kolven te verzamelen zonder de astrocytenlaag te verstoren en brengt u dit over in 50 ml conische buizen. Voeg vers medium toe aan de kolven en plaats deze terug in de incubator.Centrifuge de buizen gedurende vijf minuten bij 2.500 RCF op vier graden Celsius, aspireer het supernatant en resuspendeer de cellen in één milliliter microglia-platingmedium. Tel vervolgens de cellen met een hemocytometer volgens standaardprocedures. Zodra het aantal cellen is bepaald, voegt u een geschikt volume microglia-platingmedium toe om de gewenste celconcentratie te bereiken.Een concentratie van 2 × 10⁵ cellen per milliliter per plaat is geschikt voor het experiment; plaats de platen terug in de incubator om de microglia gedurende de nacht te laten hechten. De cellen zijn immunogekleurd met een antilichaam specifiek voor IBA1, een microgliamarker, welke rood verschijnt.Er is minimale contaminatie van de cultuur met neuronale cellen, zoals aangetoond door deze microscopische afbeelding van immunokleuring met een antilichaam voor de nieuwe NA neuronale marker, die rood verschijnt. Het preparaat is tegengekleurd met DPI om alle celkernen blauw te kleuren. Deze afbeelding toont immunokleuring met GFAP en astrocyte-marker.De astrocyten kleuren groen. Hier zien we een afbeelding van de microglia-cultuur die immunogekleurd is met een antilichaam specifiek voor CC1, een oligodendrocytenmarker. De oligodendrocyten kleuren rood.Dit histogram toont de resultaten van de kwantificering van elk celtype. Er is te zien dat de geplaatste microgliaculturen meer dan 90% puur zijn. Deze fluorescentiemicroscoopafbeelding toont een microgliacultuur die immunogekleurd is voor IBA one.De rode gebieden zijn fluorescent gelabelde latexbolletjes. De hier getoonde microgliacultuur is behandeld met één nanogram per milliliter lipopolysacharide, en het is te zien dat de microglia de fluorescent gelabelde latexbolletjes hebben gefagocyteerd. Hier worden de resultaten van de fagocytose-assay weergegeven in een histogram.Een toename van fagocytose wordt waargenomen na behandeling met LPS. Deze figuur laat zien dat de productie van stikstofmonoxide in microgliacultures ook toeneemt na toevoeging van LPS. Tot slot zijn zowel directe als met transwell-inserts gescheiden microglia-neuronencultures gevoelig voor een toename van celdood na incubatie met LPS, zoals gemeten via de afgifte van lactaatdehydrogenase. Zodra het eerste deel van deze techniek onder de knie is, kan het proces tot aan het uitplaten in T 75-flasks in anderhalf uur worden voltooid, en kan de volledige procedure binnen twee weken worden uitgevoerd.Een andere overweging bij de optimalisatie van dit protocol is het bepalen van de tijdsduur. Gemengde gliaculturen moeten worden onderhouden voordat primaire microglia worden geïsoleerd voor het uitplaten, na de vestiging van culturen met een hoge zuiverheid. Met deze procedure kan de functie van microglia in vitro worden beoordeeld; de productie van stikstofmonoxide, de afgifte van cytokinen en chemokinen, alsofase-activiteit kunnen allemaal worden bepaald en gemeten met behulp van routinematige laboratoriumassays.Dankzij de ontwikkeling van deze procedure kunnen onderzoekers in het veld van de neurowetenschappen de activiteit van microglia in een homogene cellulaire omgeving verkennen en hun rol onder verschillende neurologische omstandigheden onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u primaire microgliaculturen bereidt uit de hersenen van pasgeboren ratten. Eerst worden de hersenen geïsoleerd en de hersenvliezen verwijderd, waarna de hersenen worden gehomogeniseerd en in kolfjes worden geplaatst; vervolgens worden de kolfjes 10 tot 14 dagen geïncubeerd totdat een astrocytenmonolaag confluentie heeft bereikt.De laatste stap is het schudden van de kolven om de microglia die bovenop de astrocytenmonolaag groeien los te maken, wat resulteert in een gezuiverde microglia-cultuur.

primary-microglia-isolation-from-mixed-glial-cell-cultures-neonatal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a method for isolating and culturing microglia from rat brains. It entails separating microglia from other neuronal and non-neuronal cells using plates coated with a monoclonal antibody specific to microglia.

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free Media

The video demonstrated the method of isolating and culturing cells from a neonatal mouse brain. It involved enzymatic and mechanical dissociation of the brain, followed by culturing in growth media lacking neuronal growth factor to obtain a mixed glial population.

Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain

Schetsen we methoden voor de efficiënte en snelle isolatie / cultuur van levensvatbare microglia uit de neonatale cerebrale cortex en volwassen ruggenmerg. De dissectie en beplating van corticale microglia kan worden bereikt binnen 90 minuten, met de daaropvolgende microglia oogst plaatsvindt ~ 10 dagen na de eerste dissectie.

Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen

Hier presenteren we een protocol microglia van postnatale muizen pups isolaat (dag 1) voor in vitro experimenten. Deze geïmproviseerde winmethode genereert zowel hoge opbrengst en zuiverheid, een significant voordeel boven alternatieve werkwijzen die breed experimenten met het oog op toelichting van microgliale biologie maakt.

Snelle en Geraffineerde CD11b magnetische Isolatie van Primary Microglia met verbeterde zuiverheid en veelzijdigheid

Inspanningen om microglial functie in detail te begrijpen hebben belemmerd door het ontbreken van microglial cultuur modellen die de eigenschappen van volwassen in vivo microglia recapituleren. Dit protocol beschrijft een aanpak van het isolement en cultuur ontworpen om robuust voortbestaan van zeer vertakte volwassen rat microglia voorwaarden gedefinieerd-medium.

Isolatie en cultuur van knaagdier Microglia ter bevordering van een dynamische vertakt morfologie in serumvrij Medium

Hier presenteren we een protocol voor in vitro isolatie van meerdere gliacelpopulaties van een muis CNS. Deze methode maakt de segregatie van regionale microglia, oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten mogelijk om de fenotypen van elk in verschillende cultuursystemen te bestuderen.

Dissectie en isolatie van Murine Glia uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel

Dit protocol is een efficiënte, kosteneffectieve en robuuste methode voor het isoleren van primaire microglia van levend, volwassen, menselijk hersenweefsel. Geïsoleerde primaire menselijke microglia kan dienen als een instrument voor het bestuderen van cellulaire processen in homeostase en ziekte.

Het verkrijgen van Human Microglia uit volwassen menselijke hersenweefsel

Primaire microgliaculturen worden vaak gebruikt om nieuwe ontstekingsremmende moleculen te evalueren. Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare en relevante methode om microglia magnetisch te isoleren van pasgeboren pups.

Magnetische isolatie van microgliale cellen van neonate muis voor primaire celculturen

Dit protocol beschrijft een microglia-neuronale co-cultuur die is opgezet uit primaire neuronale cellen geïsoleerd uit muizenembryo's op embryonale dagen 15-16 en primaire microglia gegenereerd uit de hersenen van neonatale muizen op postnatale dagen 1-2.

Genereren en co-cultureren van primaire microglia en corticale neuronen van muizen

Leer primaire microglia isoleren uit neonatale rattenhersenen via mechanische disruptie en gemengde gliale cultuur. Deze methode levert hoge zuiverheid en levensvatbare cellen op voor in vitro studies naar microgliale functie.

Primaire Microglia Isolatie van Mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel

Meer video's verkennen