Name: Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Leer hoe u menselijke neurale progenitorcellen kweekt in een 3D-peptidehydrogel voor snelle analyse van neuronale differentiatie. Deze methode versnelt kwantificering via flowcytometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen Norman Krüger bedanken voor zijn uitstekende technische ondersteuning.

1. Deel 1: Cultuur van hNPCs in PuraMatrix <ol><li> Vooraf aan de generatie van een steiger met een PuraMatrix concentratie van 0,25% zonder laminine moet men de voorbereiding van de volgende oplossingen </li><li> Bereid een oplossing met 20% sucrose en een oplossing van 10% sucrose opgelost in steriel gedistilleerd water. </li><li> Voor oplossing een mix 120 ul van de 20% sucrose-oplossing met 120 ul van gedistilleerd water in een 1,5 ml conische buis. </li><li> Voor oplossing 2 mix 60 pl van de PuraMatrix oplossing met 60 ul van 20% sucrose oplossing in een 1,5 ml conische buis. </li></ol> Voor een preparaat van een steiger met een PuraMatrix concentratie van 0,25% aangevuld met laminine (8 ug per 100 ul Matrix) moet men de volgende oplossingen voor te bereiden. <ol class="lroman"><li> Voor oplossing een mix 72 ul van gedistilleerd water met 120 ul van 20% sucrose-oplossing en 48 ul laminine in een 1,5 ml conische buis. </li><li>Voor oplossing 2 mix 60 ul PuraMatrix oplossing met 60 ul van de 20% sucrose oplossing in een 1,5 ml conische buis. </li></ol><ol start="5"><li> Voor de inbedding van cellen in de PuraMatrix bereiden een vier-en celcultuur plaat en plaats een gesteriliseerde glazen dekglas (diameter 13 mm) in twee putten. Bewaar de plaat in de schone bank voor het latere gebruik. Glazen dekglaasjes worden alleen gebruikt voor de immunocytochemische studies. Als er geen immunocytochemische kleuringen zijn bedoeld, kan de stap worden overgeslagen. </li></ol> Ter voorbereiding van de hNPCs voor inkapseling in 3D steigers men ter voorbereiding van de volgende oplossingen. Verdun de Benzonase in de trypsine / EDTA-oplossing, met behulp van een verdunningsfactor van 1:10.000. Voor een Trypsin-Inhibitor/Benzonase oplossing te mengen: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + trypsine-remmer (0.5mg/ml). <ol start="6"><li> Maak de cellen door het toevoegen van 500 pi Trypsine / Benzonase oplossing en incubeer gedurende 5 min in een incubator (37 ° C, 5% CO 2). Stop de reactie met Trypsin-Inhibitor/Benzonase oplossing. Vervolgens centrifuge de vrijstaande cellen gedurende 5 min bij 3000 x g. Was de cellen met 5 ml 10% sacharoseoplossing en centrifuge opnieuw. Verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de cellen in 10% sucrose-oplossing, moet de laatste cel oplossing bevat 1x10 6 cellen / ml. </li></ol> De volgende stappen, 1,8 tot 1,11, gedaan moet worden zo snel mogelijk, vanwege de lage pH van de PuraMatrix oplossing, die mogelijk schadelijk zijn voor de cellen. <ol start="8"><li> Mix 60 pi celsuspensie met de oplossing: 1. </li><li> Voeg 120 ul van oplossing 1, waarin de cellen, de conische buis met oplossing 2 en meng voorzichtig. </li><li> Plaats 100 pi van het mengsel direct op elke dekglaasjes verbleven in het 4-well plaat. </li><li> Voeg langzaam 200 ul celcultuurmedium per goed en na 2-3 minuten nog een 200 pi. Hiermee start u de zelf-assemblage van de matrix. </li><li> Incubate cells bij 37 ° C, gedurende 1 uur in de schone bank op een verwarmingsplaat of het verwarmde gedeelte van uw schone bank. Zo veel mogelijk bewegen niet de plaat als dit kan schadelijk zijn voor de montage van de matrices. </li><li> Verwijder het merendeel van het medium, maar niet alle, om te voorkomen dat de matrices vallen droog, met een 1000 ui pipet. Voeg 500 ul medium om matrices te wassen gedurende 10 minuten. Verwijder tenslotte het medium en voeg 500 ul vers medium en plaats de cultuur plaat in een incubator (37 ° C, 5% CO 2). Als de matrices gevoelig zijn voor schokken de platen moeten worden verplaatst zo weinig mogelijk en opgeslagen, indien mogelijk, in een aparte incubator. </li><li> De hier gebruikte hNPCs waren verspreidden zich gedurende 7 dagen in de 3D-steigers en differentiatie is een initiatief van intrekking van de groeifactoren 13. Medium werd veranderd om de 2-3 dagen. </li></ol> 2. Deel 2: immunocytochemische kleuring van het hele matrices <ol><li> Van tevoren bij de kleuringsprocedure moet men voor te bereiden op: abvergrendeling bufferoplossing die bestaat uit 5% normaal geit serum en 0,3% van de Triton X-100 opgelost in PBS, een 4% paraformaldehyde oplossing op basis van 0,1 M PBS en indien nodig een oplossing met 4 &#39;,6-Diamidin-2&#39;-phenylindoldihydrochlorid ( DAPI) voor een kernen kleuren met 100 ng DAPI / ml opgelost in PBS. Monsters werden gemonteerd met een mengsel van Mowiol en DABCO. </li><li> Te wassen de matrices het medium verwijderen met een 1000 ui pipet en een keer was de steigers met PBS gedurende 5 minuten. </li><li> Om vast te stellen de steigers te verwijderen van de PBS en voeg 400 ul van paraformaldehyde (4% in 0,1 M PBS) aan elk putje en incubeer de matrices voor de 30 minuten bij kamertemperatuur. Vaste Stellingen kunnen worden opgeslagen in PBS aangevuld met 0,02% NaN 3 bij 4 ° C gedurende enkele weken tot enkele maanden. </li><li> Vooruitlopend op een verkleuring was de steigers met PBS gedurende 5 minuten. </li><li> Incubeer de steigers in het blokkeren van bufferoplossing. Het blokkeren van oplossing werd driemaal gewijzigd om de 2-3 uur en subsequently steigers werden geïncubeerd in het blokkeren oplossing over een periode &#39;s nachts bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de blokkering bufferoplossing en voeg het primaire antilichaam opgelost in PBS aangevuld met 1% normaal geit serum en incubeer de matrices &#39;s nachts bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het primaire antilichaam oplossing weg en was steigers vier keer voor 2 uur en vervolgens gedurende de nacht bij 4 ° C met PBS. </li><li> Verwijder de PBS en voeg de oplossing met het secundaire antilichaam, opgelost in PBS aangevuld met 1% normaal geit serum, gedurende 4 uur bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Was de monsters met PBS 4-6 keer gedurende 1 uur en vervolgens gedurende de nacht bij 4 ° C in het donker. </li><li> Voor een kernen vlekken kan men toevoegen 400 ul van de DAPI oplossing gedurende 30 minuten. </li><li> De monsters moet men microscoop dia&#39;s te monteren. Voeg 50 ul Mowiol / Dabco op de objectglaasjes. Verwijder de dekglaasjes van de 4-wells plaat en zorgvuldig leg ze op de montage medium. </li><li> Hier hebben we gebruik gemaakt van een Biozero 8000microscoop (Keyence, Duitsland, Karlsruhe) om een ​​enkele microfoto en z-stacks te verkrijgen. Elke stapel bevat 30 afzonderlijke foto&#39;s met een afstand van 1-2 um. Met behulp van de bijbehorende analyse-software de onscherpte die inherent zijn aan fluorescentie werd verwijderd voordat vol projecties van de z-stacks werden geproduceerd. </li></ol> 3. Deel 3: Release van hNPCs uit de steigers voor flowcytometrie-analyse <ol><li> Vooraf aan de release van de cellen van steigers was de steigers met 500 pi HBSS. </li><li> Breng de steigers door middel van een 1000 ui pipet aan op een 15 ml conische buis met celkweekmedium. </li><li> Te verstoren de steigers mechanisch resuspendeer de cel oplossing meerdere malen met een 1000 ui pipet en vervolgens de oplossing centrifuge bij 3000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet, voeg 500 ul van trypsine / Benzonase oplossing en resuspendeer de celpellet meerdere malen. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 5 minutenbij 37 ° C in de trypsine / Benzonase oplossing. Om te stoppen met de reactie voeg 1 ml Trypsin-inhibitor/Benzonase-oplossing en pipetteer op en neer meerdere malen. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie 5 min bij 3000 xg, verwijder het supernatant en was de cellen met 2 ml HBSS buffer. Herhaal deze stap twee keer. Deze procedure zal verwijderen matrix puin. </li><li> Passeren de celsuspensie oplossing via een cel zeef (poriegrootte 70 micrometer) om aggregaten te verwijderen en het verzamelen van de cellen in celkweek medium. De verkregen cellen kunnen worden gezaaid weer bijvoorbeeld op dekglaasjes voor functionele studies als patch clamp of fluometric metingen. Voor de verwerking van de cellen voor flowcytometrie, onmiddellijk de cellen (zie 4.1). </li></ol> 4. Deel 4: Kwantificering van βIII-tubuline positieve cellen door flowcytometrie <ol><li> Bevestig de vrijgekomen cellen verkregen in stap 3.7 met 1% PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 3000 xg en uitneeme het supernatant. Indien nodig, kunnen de cellen bereid zijn om te worden bewaard bij 4 ° C voor latere analyse. Daarom hersuspenderen cellen in wasbuffer (PBS aangevuld met 0,5% BSA en 0,02% Na-azide). </li><li> Om verder te gaan met de voorbereiding voor de flowcytometrie, centrifuge de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 350 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 25 ul van het antilichaam oplossing. Daarom is de eerste antilichaam wordt gemengd met saponine buffer bij een concentratie 1:100 bijvoorbeeld βIII-tubuline. De saponine buffer bestaat uit PBS met een saponine concentratie van 0,5%, een BSA concentratie van 0,5% en een Na-azide concentratie van 0,02%. </li><li> Incubeer de celsuspensie met het eerste antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een shaker. Als een negatieve controle voor te bereiden een monster zonder de eerste antilichaam. </li><li> Voor de eerste wasstap direct toe te voegen 300 ul saponine buffer naar de cellen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 min bij 350 x g. Voor de tweede wasstap, gooihet supernatant, voeg 300 ul buffer en centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 min bij 350 x g. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 25 ul oplossing die het secundaire antilichaam (bijv. Alexa Fluor 647, 1:1000, opgelost in saponine buffer). Incubeer cellen met het secundaire antilichaam 1 uur op kamertemperatuur, in het donker. </li><li> Voor de eerste wasstap direct toe te voegen 300 ul saponine buffer naar de cellen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 min bij 350 x g. Voor de tweede wasstap, gooi het supernatant, voeg 300 ul buffer en centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 min bij 350 x g. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 pi wasbuffer voor de flowcytometrie-analyse. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Een voorbeeld van hNPCs gekweekt in de zelf-assemblage hydrogel scaffold PuraMatrix is ​​weergegeven in figuur 1. De hNPCs groeien in sferische achtige structuren in ongewijzigde PM. In deze cultuur staats,-cellen kan nauwelijks worden erkend in een transmissie-licht, hoewel bundels van de processen tussen de bollen zichtbaar zijn (fig. 1A). Afhankelijk van de cultuur voorwaarden van het gebruikte celtype, kan de matrix bijvoorbeeld worden aangepast door toevoeging van laminine. Voor de hNPC cellijn ReNcell VM (Millipore) laminine nodig is om een ​​groei patroon met minder dichte aggregaten, maar een meer homogene verdeling van de cellen (fig. 1B) veroorzaken. Onafhankelijk van wijzigingen, kan de matrix worden gebruikt om bijvoorbeeld neuronale differentiatie te bestuderen. Figuur 1C toont een kleuring van de hNPCs voor de neuronale marker βIII-tubuline. In dit voorbeeld is de cellen werden gekweekt gedurende 7 dagen in de matrix en vervolgens gedifferentieerd gedurende 4 dagen, waar differentiatie werd geïnduceerd door intrekking van de groeifactoren EGF en bFGF. Cell 13 lichamen en een dicht netwerk van processen opgebouwd door de cellen kunnen worden makkelijk te herkennen. Maar het is duidelijk dat een kwantificering van het aantal cellen is tijdrovend, omdat een groot aantalfoto&#39;s van verschillende regio&#39;s van de matrix moet worden geanalyseerd, het verkrijgen van een betrouwbare gegevensbank voor een statistische analyse. In fig. 1D ziet men een voorbeeld van cellen uit de matrix vrijkomt en vervolgens gevlochten op dekglaasjes. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor functionele studies. De release van de cellen van de 3D-steigers biedt de mogelijkheid om verschillende parameters te analyseren als uitdrukking van marker-eiwitten of overleving van de cellen door AnnexinV / PI vlekken of een TUNEL assay. Figuur 2 toont een voorbeeld van een flowcytometrie-analyse van het percentage van βIII-tubuline + cellen. De negatieve controle (cellen die niet gemarkeerd voor βIII-tubuline) is weergegeven in figuur 2A. Deze controles worden gebruikt om de poort voor de latere detectie van βIII-tubuline + cellen (fig. 2B) te bepalen. Een vergelijking van een handmatige telling van cellen en een analyse van flowcytometrie is weergegeven in figuur 2C. Het percentage βIII-tubuline + cellen werd bepaald tenINED door het tellen van het totaal aantal cellen (door middel van een nucleaire DAPI kleuring) en het aantal βIII-tubuline + cellen in de fluorescentie foto&#39;s. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig1.jpg" /> Figuur 1. hNPCs gekweekt in de zelf-assemblage peptide hydrogel PuraMatrix. A) hNPCs ingekapseld in PuraMatrix (PM) groeien in sferische, dichte verpakt structuren, waarbij de diameter van de bollen kan oplopen tot enkele honderden micrometer. Tussen de bollen kan men herkennen bundels van processen door de cellen (pijlen) gebouwd. B) De cellen ingekapseld in PuraMatrix aangevuld met laminine (PML) groeien in minder dichte structuur, meer homogeen verdeeld. In de laminine aangevuld matrix kan men enkele cellen herkennen in minder dichte gebieden (pijlen), maar het is nauwelijks mogelijk te kwantificeren van het aantal cellen. C) hNPCs gedifferentieerd voor 4 dagen in PML express neuronale marker, zoals βIII-tubuline (groen). Aan evaluatieste van het percentage positieve cellen moet men het totale aantal cellen te bepalen door een kernen kleuring, zoals DAPI (blauw). De microphotograph presenteert de volledige projectie van een z-stack van de foto&#39;s die met Biozero-8000 microscoop. D) De cellen uit de matrix vrijkomt kan worden ingedeeld op bijvoorbeeld dekglaasjes voor de verdere functionele studies. De microphotograph toont cellen gekweekt voor 3D, en vervolgens de release procedure. De kleuring voor βIII-tubuline (rood) laat een vergelijkbare morfologie van de cellen gehost in de 3D-schavot. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig2.jpg" /> Figuur 2. Flowcytometrie analyse cellen vrijgelaten uit PuraMatrix. Om de tijdrovende kwantificering van microfoto&#39;s gebruikten we een protocol om cellen gekweekt in PuraMatrix die toegang geeft tot een snellere analyse door flowcytometrie los te overwinnen. A) ongekleurde cellen werden gebruikt als negatieve controle, naar de gate (zwart frame) ingesteld voor de analyse achterafvan bijvoorbeeld βIII-tubuline cellen. B) Om het percentage van βIII-tubuline + cellen van dezelfde poort, gelegen in de negatieve controle, werd gebruikt kwantificeren. Positieve cellen in het rechter gedeelte van de x-as, waar ook een tussentijdse populatie werd waargenomen (stippellijn), het meest waarschijnlijk vertegenwoordigen celresten. C) De vergelijking van handmatige geteld cellen en cellen geteld door flow cytometrie bleek een veel groter deel van de positieve cellen, waar de tijd afhankelijk van het aantal βIII-tubuline + was vergelijkbaar, met vermelding van de betrouwbaarheid van de flow cytometrie protocol.

<ol><li>Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+3D+tissue+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer.+Biol%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures.</a> Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).</li>
<li>Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+peptide+scaffolds+for+3-d+tissue+cell+cultures+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine.</a> Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).</li>
<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture%3A+building+a+better+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell Culture: building a better matrix.</a> Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).</li>
<li>Hauser, C. A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).</li>
<li>Teng, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+recovery+following+traumatic+spinal+cord+injury+mediated+by+a+unique+polymer+scaffold+seeded+with+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).</li>
<li>Silva, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+differentiation+of+neural+progenitor+cells+by+high-epitope+density+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers.</a> Science. 303, 1352-1355 (2004).</li>
<li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+ONE%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).</li>
<li>Taraballi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine-spacers+influence+functional+motifs+exposure+and+self-assembling+propensity+of+functionalized+substrates+tailored+for+neural+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures.</a> Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).</li>
<li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).</li>
<li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+oligopeptide+matrices+support+mammalian+cell+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment.</a> Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).</li>
<li>Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+significantly+enhance+osteoblast+proliferation%2C+differentiation+and+3-D+migration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+ONE%22%5BJournal%5D)">Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration.</a> PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).</li>
<li>Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compatibility+of+human+fetal+neural+stem+cells+with+hydrogel+biomaterials+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro.</a> Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).</li>
<li>Ortinau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Eng.+Online%22%5BJournal%5D)">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).</li>
<li>Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PuraMatrix+Encapsulation+of+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).</li>
<li>Morgan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+neurons+derived+from+human+neural+progenitor+cells+by+veratridine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine.</a> Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).</li>
<li>Giese, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+and+the+effect+of+oxygen+during+proliferation+and+differentiation+of+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells.</a> BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).</li>
<li>Schmöle, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+indolylmaleimide+acts+as+GSK-3beta+inhibitor+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).</li>
<li>PuraMatrix, B. D. Peptide Hydrogel. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPuraMatrix%2C+BD+%22Guidelines+for+Use%22">Guidelines for Use</a>. Catalog No 354250, BD. (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het gebruik van 3D-scaffolds biedt de mogelijkheid om de ontwikkeling van verschillende celtypes studie in een celkweek situatie dichter bij de in vivo situatie. Echter, met betrekking tot de analyse van bijvoorbeeld neuronale differentiatie of functionele studies men moet een aantal obstakels overwinnen om betrouwbare gegevens voor bijvoorbeeld de kwantificering van celtypen te krijgen. Hier beschrijven we de cultuur van hNPCs in het peptide hydrogel op basis van steiger PuraMatrix...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> PuraMatrix peptide hydrogel </td><td> BD Bioscience </td><td> 354250 </td><td></td></tr><tr><td> Muis laminine I </td><td> Cultrex </td><td> 400-2009090 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Sigma </td><td> S9378-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Normaal geit serum </td><td> Dako </td><td> X0907 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Biochrom AG </td><td> L 1825 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-088 </td><td> Balanced Salt Hanks &#39;Solution 1X </td></tr><tr><td&gt; ΒIII-tubuline antilichaam </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-51670 </td><td> Muis, monoklonale, 1:500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> Een 11029 </td><td> Goat α muis, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 </td><td> Invitrogen </td><td> Een 11031 </td><td> Goat α muis, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> Een 21235 </td><td> Goat α muis, 1:1000 </td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 Reagens </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> DABCO </td><td> Aldrich </td><td> D2 ,780-2 </td><td> 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octaan 98% </td></tr><tr><td> Cel zeef </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> 70 urn poriegrootte </td></tr><tr><td> Saponine </td><td> Merck </td><td> 7695 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine/ EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase 250 U / pl </td><td> Merck </td><td> 1.01654.0001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-remmer </td><td> Sigma </td><td> T6522 (500 mg) </td><td></td></tr><tr><td> 20% HSA </td><td> Octapharma </td><td> Human-albumine Kabi 20% </td><td></td></tr></tbody></table>

teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale zelf-assemblage peptide hydrogel

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

De invloed van de 3-dimensionale (3D) steigers op de groei, proliferatie en tenslotte neuronale differentiatie is van groot belang om nieuwe methoden te vinden voor cel-gebaseerde en gestandaardiseerde therapieën in neurologische aandoeningen of neurodegeneratieve ziekten. 3D-structuren wordt verwacht dat zij een omgeving te bieden veel dichter bij de in vivo situatie dan 2D-culturen. In het kader van de regeneratieve geneeskunde, de combinatie van biomateriaal steigers met neurale stamcellen en stamcellen is veelbelovend als een therapeutisch instrument. 1-5 Cultuur systemen emuleert een drie dimensionale omgeving is aangetoond dat de proliferatie en differentiatie invloed in verschillende types van stengel en progenitorcellen. Hierin de vorming en functionalisering van de 3D-microenviroment is belangrijk om te bepalen het overleven en het lot van de ingesloten cellen. 6-8 Hier gebruikten we PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), een peptide op basis van hydrogel schavot,die goed wordt beschreven en gebruikt om de invloed van een 3D-omgeving op verschillende celtypen te bestuderen. 7,11-14 PuraMatrix kan eenvoudig worden aangepast en de synthetische fabricage van de nano-vezels zorgt voor een 3D-cultuur systeem van hoge betrouwbaarheid, die is in aanvulling xeno-vrij. Onlangs hebben we bestudeerden de invloed van de PM-concentratie op de vorming van het schavot. 13 In deze studie de gebruikte concentraties van PM had een directe invloed op de vorming van de 3D-structuur, die werd gedemonstreerd door atomaire kracht microscopie. Een volgende analyse van de overleving en differentiatie van de hNPCs onthulde een invloed van de gebruikte concentraties van PM over het lot van de ingesloten cellen. Echter, de analyse van de overleving of de neuronale differentiatie door middel van immunofluorescentie technieken bezitten een aantal hindernissen. Te winnen betrouwbare gegevens, moet men het totaal aantal cellen te bepalen binnen een matrix om het relatieve aantal van bijvoorbeeld het verkrijgen. neuronale cellen gekenmerkt door βIII-tubuline. Deze voorwaarden een techniek om de steigers in alle drie dimensies analyseren door een confocale microscoop of een vergelijkbare techniek als fluorescentie microscopen in staat om z-stacks van het monster te nemen. Bovendien is deze vorm van analyse is zeer tijdrovend. Hier laten we zien een methode om cellen van de 3D-steigers release voor de latere analyse, bijvoorbeeld door flowcytometrie. In dit protocol menselijke neurale stamcellen (hNPCs) van de ReNcell VM cellijn (Millipore USA) werden gekweekt en gedifferentieerde in 3D-steigers bestaande uit PuraMatrix (PM) of PuraMatrix aangevuld met laminine (PML). In onze handen een PM-concentratie van 0,25% was optimaal voor de teelt van de cellen 13, maar de concentratie zou kunnen worden aangepast aan andere soorten cellen. 12 De vrijgekomen cellen kunnen worden gebruikt voor bijvoorbeeld immunocytochemische studies en vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie. Dit versnelt de analyse en de moopnieuw over, de verkregen gegevens rusten op een bredere basis, het verbeteren van de betrouwbaarheid van de gegevens.

Hier beschrijven we het gebruik van een zelf-assemblage drie-dimensionale steiger aan de cultuur menselijke neurale stamcellen. We presenteren een protocol bij de cellen van de steigers vrij te worden geanalyseerd vervolgens bijvoorbeeld door flowcytometrie. Dit protocol kan worden aangepast aan andere soorten cellen om gedetailleerde mechanistisch studies uit te voeren.

Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

De invloed van driedimensionale (3D) scaffolds op de groei, proliferatie en uiteindelijk de neuronale differentiatie is van groot belang om nieuwe ...

Het algemene doel van deze procedure is om de analyse van de neuronale differentiatie van menselijke neurale progenitorcellen, gekweekt in een driedimensionale omgeving, te versnellen. Dit wordt bereikt door de cellen eerst te kweken in de zelf-assemblerende peptide-gebaseerde hydrogel Pure Matrix. Vervolgens worden de cellen uit de driedimensionale scaffolds vrijgemaakt.In de derde stap wordt als laatste de immunofytochemische kleuring van de cellen uitgevoerd. De cellen worden geteld via flowcytometrische analyse. Uiteindelijk kan de mate van neuronale differentiatie of de mate van apoptose worden bepaald via de flowcytometrische analyse voor respectievelijk neuronale of apoptotische markers.Met deze techniek is de kwantificering van neurale differentiatie veel sneller en de Optane-gegevens zijn gebaseerd op een bredere basis en microfotografische technieken. Plaats voor het inkapselen van cellen in de pure matrix eerst een gesteriliseerd glazen dekglas met een diameter van 13 millimeter in elk van twee putjes van een celkweekplaat met vier putjes. Bewaar de plaat vervolgens in een cleanbench voor later gebruik. Detacheer daarna de humane neurale progenitorcellen of H NPCs door 2

cultivation-human-neural-progenitor-cells-3-dimensional-self

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Eenvoudige technieken worden beschreven voor de snelle productie van microfabricated neurale cultuur systemen met behulp van een digitale microspiegeltjes voor dynamische masker projectie lithografie op regelmatige celcultuur substraten. Deze cultuur systemen kunnen meer representatief zijn voor natuurlijke biologische architectuur, en de beschreven technieken kan worden aangepast voor tal van toepassingen.

Fabricage van micropatterned Hydrogelen voor Neurale Cultuur Systems met behulp van Dynamic Mask Projectie Fotolithografie

Dit protocol laat zien methoden die worden gebruikt om 2D-en 3D-omgevingen tot stand in de speciaal ontworpen electrotactic kabinet, kan volgen...

Electric Field-gecontroleerde Directed migratie van neurale stamcellen in 2D-en 3D-omgevingen

This video showcases the development and differentiation of human neural stem cells within a three-dimensional scaffold. A laminin coating on the scaffold promotes cell attachment, while a growth factor-free neural medium induces cell differentiation into neural progenitor cells, which extend their processes within a porous architecture in multiple directions, forming a three-dimensional...

Differentiating Human Neuronal Stem Cells into 3D Culture Using a Porous Scaffold

This video demonstrates a technique to establish a three-dimensional culture of glial cells. Rat-brain-derived glial cells are encapsulated within a photocrosslinkable polymer matrix containing extracellular matrix components. Upon incubating in a growth medium, the glial cells proliferate within the supporting matrix to create a three-dimensional culture.

Establishing a Three-Dimensional Culture of Rat Brain-Derived Glial Cells

Wij demonstreren de ontwikkeling van zelf geassembleerde, driedimensionale bundels van lengterichting uitgelijnde astrocytic waarin en processen binnen het omhulsel van een roman biomaterial. Deze "levende steigers", het tentoonstellen van micron-schaal diameter nog uitbreiding centimeter lengte, kan dienen als proefnetwerken neurologische mechanismen bestuderen of vergemakkelijken van neuroregeneration door leiding neuronale migratie en/of axonale ontworpen vastloper.

Drie-dimensionale weefsel ontworpen uitgelijnd Astrocyt netwerken vergemakkelijken zenuwstelsel regeneratie te recapituleren Developmental mechanismen

Hierin presenteren wij een protocol voor de 3D cultuur van rat hersenen-afgeleide glia cellen, met inbegrip van astrocyten, oligodendrocyten en microglia. We tonen primaire celculturen, methacrylated hyaluronzuur (HAMA) hydrogel synthese, HAMAphoto-polymerisatie en cel inkapseling en monster verwerking voor confocale en scanning elektronen microscopische beeldvorming.

Verbeterd 3D Hydrogel culturen van primaire gliacellen voor In Vitro modellering van Neuroinflammation

Hier presenteren we een protocol voor 3D-cultuur systemen bij het zelf monteren van peptide steigers ter bevordering van de differentiatie van dedifferentiated menselijke articulaire chondrocyten in kraakbeen-achtig weefsel.

Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers

In dit protocol, wij streven ernaar om te beschrijven een reproduceerbare methode voor combineren losgekoppeld menselijke pluripotente stamcel afgeleid neuronen en astrocyten samen in 3D bol cocultures, behoud van deze gebieden vrij zwevende voorwaarden, en daarna het meten van synaptic circuit activiteit van de bollen met immunoanalysis en multielectrode serie opnamen.

Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Hier bieden wij een methode voor het analyseren van het gedrag van de groeiende axonen in 3D-matrices, het nabootsen van hun natuurlijke ontwikkeling.

Generatie van 3-D collageen-based hydrogels om axonale groei en gedrag te analyseren tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel

Hier presenteren we een protocol om 3D-gebioprinte coculturen van iPSC-afgeleide neuronen en astrocyten te produceren. Dit cocultuurmodel, gegenereerd in een hydrogelsteiger in formaten met 96 of 384 putjes, toont een hoge levensvatbaarheid na het printen en neurietuitgroei binnen 7 dagen en toont de expressie van rijpheidsmarkers voor beide celtypen.

Driedimensionale bioprinting van menselijke iPSC-afgeleide neuron-astrocyt coculturen voor screeningstoepassingen

Leer hoe u menselijke neurale progenitorcellen kweekt in een 3D-peptidehydrogel voor snelle analyse van neuronale differentiatie. Deze methode versnelt kwantificering via flowcytometrie.

Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

Meer video's verkennen