Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

Het algemene doel van deze procedure is om de analyse van de neuronale differentiatie van menselijke neurale progenitorcellen, gekweekt in een driedimensionale omgeving, te versnellen. Dit wordt bereikt door de cellen eerst te kweken in de zelf-assemblerende peptide-gebaseerde hydrogel Pure Matrix. Vervolgens worden de cellen uit de driedimensionale scaffolds vrijgemaakt.

In de derde stap wordt als laatste de immunofytochemische kleuring van de cellen uitgevoerd. De cellen worden geteld via flowcytometrische analyse. Uiteindelijk kan de mate van neuronale differentiatie of de mate van apoptose worden bepaald via de flowcytometrische analyse voor respectievelijk neuronale of apoptotische markers.

Met deze techniek is de kwantificering van neurale differentiatie veel sneller en de Optane-gegevens zijn gebaseerd op een bredere basis en microfotografische technieken. Plaats voor het inkapselen van cellen in de pure matrix eerst een gesteriliseerd glazen dekglas met een diameter van 13 millimeter in elk van twee putjes van een celkweekplaat met vier putjes. Bewaar de plaat vervolgens in een cleanbench voor later gebruik. Detacheer daarna de humane neurale progenitorcellen of H NPCs door 2,5 milliliters vers bereide trypsine toe te voegen.

Voeg een benzon-oplossing toe aan de kweekschaal en incubeer de cel-suspensie bij 37 °C en 5% CO2. Stop na vijf minuten de reactie met een trypsine-inhibitor benzon-oplossing. Centrifugeer vervolgens de losgekoppelde cellen gedurende vijf minuten bij 3000 ×g bij kamertemperatuur, resuspendeer het resulterende pellet in vijf milliliter van een 10% sucrose-oplossing en was de cel-suspensie vervolgens onder dezelfde centrifugecondities.

Nadat het Resus-supernatans is afgegoten, wordt de pellet gesuspendeerd in de sucrose-oplossing tot een uiteindelijke celconcentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter. Meng nu zo snel mogelijk 60 µL van de celsuspensie met oplossing één, breng 120 µL van deze suspensie over naar de conische buis met oplossing twee, meng dit zorgvuldig en breng vervolgens onmiddellijk 100 µL van het mengsel aan op elk van de dekglasjes in de vier-wellplaat. Voeg tot slot langzaam 200 µL celkweekmedium toe aan elke well.

Voeg na twee tot drie minuten opnieuw 200 µL celkweekmedium toe aan de wells om de zelfassemblage van de matrix te initiëren. Incubeer de cellen gedurende één uur bij 37 °C op het verwarmde gedeelte van uw clean bench. Vermijd het verplaatsen van de celkweekplaat zoveel mogelijk nadat de matrices zijn geassembleerd en gebruik een 1000 µL pipet om het grootste deel, maar niet al het medium te verwijderen om te voorkomen dat de matrices uitdrogen.

Was daarna de matrices gedurende 10 minuten met 500 µL vers medium. Verwijder tot slot het wasmedium. Voeg nog eens 500 µL medium toe en plaats de kweekplaat in een incubator.

Indien mogelijk, bewaar de matrices in een eigen incubator om onbedoeld schudden van de structuren op de eerste dag van het kleuringsexperiment te voorkomen. Verwijder het medium uit de matrices met een 1000 µL pipet en was de scaffolds vervolgens één keer gedurende vijf minuten met PBS.

Verwijder vervolgens de PBS en voeg 400 µL paraldehyde toe aan elke put om de matrices te fixeren en incubeer deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Nadat de scaffolds zijn gefixeerd, worden ze gedurende vijf minuten gewassen met 500 µL PBS. Incubeer de structuren vervolgens in blokkeringsbuffer gedurende zes tot negen uur, waarbij de buffer elke twee tot drie uur wordt vervangen, met een laatste incubatie gedurende de nacht in verse blokkeringsbuffer bij 4 °C; verwijder de volgende dag de blokkeringsbuffer.

Voeg de antilichaamoplossing toe aan de wells en incubeer de matrices opnieuw gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Verwijder nu de primaire antilichaamoplossing en was de scaffolds in 500 µL PBS gedurende acht uur, waarbij het PBS elke twee uur wordt ververst, en vervolgens gedurende de nacht bij vier graden Celsius met vers PBS. Verwijder na de nachtelijke wasbeurt het PBS en incubeer de scaffolds gedurende vier uur bij kamertemperatuur in het donker met de secundaire antilichaamoplossing.

Was de monsters vervolgens vier tot zes keer met PBS gedurende één uur per keer, en incubeer de structuren daarna in verse PBS bij vier graden Celsius in het donker gedurende de nacht. Voeg nu 50 microliters MOE all dab co toe aan de microscoopglaasjes om deze voor te bereiden op het monteren van de matrices. Monteer vervolgens voorzichtig een dekglas op elk glaasje.

Gebruik ten slotte een fluorescentiemicroscoop om individuele micrografieën en Zacks te verkrijgen, vergelijkbaar met de H NPCs die groen kleuren voor de expressie van de neuronale marker bèta-drie tubuline, zoals hier getoond. Na het wassen van de scaffolds met 500 µL HBSS gedurende één minuut, wordt een 1000 µL pipette gebruikt om de scaffolds over te brengen naar een 15 mL conische buis. Resuspendeer vervolgens de celoplossing meerdere keren met een 1000 µL pipette om de matrices mechanisch te verbreken en centrifugeer de scaffoldoplossing daarna bij 3000 ×g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten; verwijder het supernatant met een pipette en resuspendeer het pellet vervolgens in 500 µL trypsine-benzine-oplossing door meerdere keren op en neer te pipetteren.

Incubeer de cellen vervolgens bij 37 °C. Stop de reactie na vijf minuten met één milliliter trypsineremmer. Pipetteer de Benzonase-oplossing na het centrifugeren van de cel-suspensie onder dezelfde centrifugecondities meerdere keren op en neer.

Verwijder eventuele resten van de matrix door de cellen twee keer te wassen met twee milliliter HBSS-buffer. Verwijder tot slot aggregaten door de celsuspensie onder dezelfde omstandigheden door een 70 micron celzeef te centrifugeren en verzamel de cellen in celkweekmedium. Begin met het fixeren van de gedisaggregeerde cellen in 1% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een schudapparaat.

Centrifuge vervolgens de cellen en resuspendeer de pellet in wasbuffer. Centrifugeer de cellen daarna 10 minuten bij 350 ×g bij 4 °C en resuspendeer de resulterende pellet in 25 µL van de antilichaamoplossing. Incubeer de celsuspensie gedurende twee uur bij kamertemperatuur op een schudapparaat.

Voeg vervolgens 300 µL pon-buffer direct toe aan de monsters en was de cel-suspensies vervolgens twee keer onder dezelfde centrifugeercondities. Voeg na de tweede wasbeurt 25 µL van het secundaire antilichaam toe en incubeer de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker. Nadat de cellen nog twee keer met saponine-buffer zijn gewassen, wordt de pellet opnieuw gesuspendeerd in 500 µL wasbuffer voor flowcytometrische analyse.

In deze figuur worden H NPC's ingekapseld in een pure matrix getoond; de cellen groeien in sferen, dicht opeengepakte structuren waarbij de diameter van de sferen tot enkele honderden microns kan bedragen. Tussen de sferen kunnen bundels van uitlopers worden waargenomen die door de cellen zijn gevormd, zoals aangegeven door de witte pijlen. Hoewel individuele cellen nauwelijks te herkennen zijn, groeien cellen die zijn ingekapseld in een pure matrix aangevuld met laminine in minder dichte structuren en zijn ze homogener verdeeld, zoals in deze figuur te zien is; in minder dichte gebieden kunnen zelfs individuele cellen worden herkend, zoals aangegeven door de zwarte pijlen. Hier zijn H NPC's gedifferentieerd gedurende vier dagen in een met laminine aangevulde pure matrix, groen gekleurd voor de expressie van de neuronale marker.

Bèta drie tubuline wordt getoond om het percentage positieve cellen te evalueren. Het totale aantal cellen kan worden bepaald door de celkernen te tellen, die hier blauw zijn gekleurd met DAPI. Deze microfotografie is de volledige projectie van een Z-stack van beelden die zijn gemaakt met een fluorescentiemicroscoop.

Cellen die uit de matrix zijn vrijgemaakt, kunnen opnieuw worden uitgeplaat, bijvoorbeeld op dekglasjes zoals getoond in deze figuur, voor verdere functionele studies. Deze microfoto toont cellen die in 3D zijn gekweekt nadat ze waren onderworpen aan de eerder genoemde vrijmakingsprocedure en gedurende drie dagen zijn gekweekt. De kleuring voor bèta drie tubuline in rood onthult een vergelijkbare morfologie met de cellen die in het 3D-steunstructuur werden gehuisvest, waarbij ongekleurde cellen als negatieve controle werden gebruikt.

De GA, hier weergegeven als het zwarte kader, werd ingesteld voor de daaropvolgende analyse van bèta-tubuline 3-positieve cellen; in deze dotplot verschijnen de positieve cellen binnen het zwarte kader in het rechtergedeelte van de x-as, en een intermediaire populatie in het gestippelde kader, die zeer waarschijnlijk celdebris vertegenwoordigt, kan eveneens worden waargenomen. Een vergelijking tussen handmatige celtelling en enumeratie via flowcytometrie wordt getoond in deze laatste figuur. Een veel hoger aandeel positieve cellen kan worden gedetecteerd via flowcytometrische analyse, zoals aangegeven door de open zwarte vierkantjes, dan doorgaans kan worden geteld via handmatige telling, zoals aangegeven door de gesloten zwarte driehoekjes.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe poreuze metrieken worden gebruikt voor de cultivatie van edge MPC's in een 3D-scaffold, en hoe de cellen uit de scaffold worden vrijgemaakt voor flowcytometrische analyzers.