Name: Genotypering van plantaardige en dierlijke monsters zonder voorafgaande DNA-zuivering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Leer Direct PCR voor genotypering van planten en dieren zonder DNA-zuivering. Deze methode bespaart tijd en kosten bij moleculair biologisch onderzoek met Arabidopsis en muizen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Voor de Arabidopsis monsters en de betrokken PCR-primers wij danken Professor Jaakko Kangasjärvi en zijn groep, The Plant Stress Groep, Plant Biology, Department of Biosciences, Universiteit van Helsinki. De experimenten met de traditionele methode werden uitgevoerd door mevrouw Airi Lamminmäki. Transgene muis monsters werden verstrekt door Dr Jaana Vesterinen, Instituut voor medische biologie / biochemie, Universiteit van Helsinki. Harris Uni-Core en Harris snijmat zijn handelsmerken van Shunderson Communications Inc Alle andere handelsmerken zijn het eigendom van Thermo Fisher Scientific Inc en haar dochterondernemingen.

1. Genotypering van Arabidopsis Plant Personen met Direct Protocol <ol><li> De dCAPS genotyperingstest direct in op de Arabidopsis plant blad eerst formuleren 20 of 50 ul PCR reactie met de Phire Plant Direct PCR Kit zoals beschreven in Tabel 1. </li><li> Daarna, snijd een 0,50 mm pons van een Arabidopsis plant blad met behulp van de Harris Uni-Core en Harris snijmat. Houd de puncher stevig, drukt u op de snijkant in het weefsel en draai de puncher heen en weer. </li><li> Druk op de zuiger om de punch disc uit te werpen in een PCR-reactiemengsel. Zorg ervoor dat het monster valt in de PCR-oplossing en plakt niet aan de buis muren. </li><li> Reinig de snijkant van de puncher na elk monster om kruisbesmetting te voorkomen door dompelen in 2% NaClO oplossing. Druk op de zuiger op en neer een paar keer en wrijf de snijkant met een schone papieren handdoek. De snijmat moet ookgespoeld tussen de monsters. </li><li> Vervolgens gebruik van een Thermo Scientific Piko 24-well Thermal Cycler en Thermo Scientific Piko PCR Plate de PCR reacties met de fietsomstandigheden beschreven in tabel 2 uitgevoerd. De PCR reacties kunnen worden uitgevoerd in conventionele PCR thermocyclers. </li><li> Na PCR, spin down het plantmateriaal. Breng 5 ul van het supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg 4 pi water en 1 pl restrictie-SspI. Meng voorzichtig en kort draaien tot inhoud op de bodem van de buis. Incubeer het reactiemengsel gedurende een uur bij 37 ° C. Inactiveren het restrictie-enzym door incubatie bij 65 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Wanneer amplificeren DNA rechtstreeks uit plantenweefsel, de PCR producten omvatten planten-en PCR-afgeleide componenten die kunnen interfereren met de restrictiedigestie enzym. Daarom kan het nodig zijn een verdunnen (bijvoorbeeld 1:2 of 1:3 in water) en het PCR product te zuiveren voordat thij daaropvolgende digestie, bijvoorbeeld door een geschikte commerciële kit zoals Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit. </li><li> Na restrictie-enzym digestie, analyseren de resulterende fragmenten op agarose gel. Voeg 2,5 ul 5x loading buffer aan de reactie en uitvoeren agarose gelelektroforese met 10 ul van het verkregen mengsel. </li></ol> 2. Versterken specifieke DNA-fragmenten van 15-jaar oude Oak Leaves met behulp van het verdunningssysteem Protocol <ol><li> Om te beginnen, snijd een 2 mm punch van eiken blad. </li><li> Plaats het monster in 20 ul van Dilution Buffer geleverd met de Phire Plant Direct PCR Kit. Reinig de snijkant van de puncher en snijmat als voorheen. </li><li> Plet het blad monster met een 100 ul pipet door het kort tegen de buiswand. Afhankelijk van het plantmateriaal, de verdunning protocol werkt soms beter zonder deze te beschadigen het monster. </li><li> Kort draaien de monsters in een microcentrifuge tot tHij reacties zijn op de bodem van buizen. </li><li> Het supernatant kan direct worden gebruikt in de PCR, of kan worden verdund 1:10 of 1:100 in steriel water afhankelijk van het type monster. Gebruik 0,5 pl tot 1 ul van het supernatant of verdunnen als sjabloon voor een 20 pi PCR-reactie. Bereid de reactie als beschreven in tabel 1. </li><li> Zodra de reacties worden bereid, gebruik van een Thermo Scientific Piko 24-well Thermal Cycler en Thermo Scientific Piko PCR Plate de PCR reacties met de fietsomstandigheden beschreven in tabel 2 uitgevoerd. De PCR reacties kunnen worden uitgevoerd in conventionele PCR thermocyclers. </li><li> Na PCR, voeg 5 pl 5x loading buffer aan de reactie en uitvoeren agarose gelelektroforese met 15 pi van het resulterende mengsel. </li></ol> 3. Genotypering van transgene muizen met behulp van het verdunningssysteem Protocol <ol><li> Begin de verdunning protocol over transgene muizen door het plaatsen van een 2 mm punch van de mouse oor in 20 pl Dilution Buffer die 0,5 pi DNARelease Additive geleverd met de Phire Animal Tissue Direct PCR Kit. </li><li> Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 2 min, gevolgd door 2 min incubatie bij 98 ° C. </li><li> Kort draaien de monsters in een microcentrifuge tot de reacties op de bodem van buizen. </li><li> Gebruik 1 pi supernatant als de template voor een PCR reactie 20 pi, bereid zoals beschreven in Tabel 3. Elke supernatant die niet direct worden gebruikt, kan worden overgebracht naar een nieuwe buis en opgeslagen bij -20 ° C. </li><li> Vervolgens gebruik van een Thermo Scientific Piko 24-well Thermal Cycler en Thermo Scientific Piko PCR Plate de PCR reacties met de fietsomstandigheden beschreven in Tabel 4 voeren. Opnieuw kan de PCR reacties worden uitgevoerd in conventionele PCR fietsers. </li><li> Na PCR, voeg 5 pl 5x loading buffer aan de reactie en uitvoeren agarosegelelektroforese wi 15 pi van het resulterende mengsel. </li></ol> 4. Representatieve resultaten In de techniek dCAPS de restrictieplaats in de SNP plaats wordt geïntroduceerd of vernietigd met een PCR primer met een of meer mismatches aan het doel DNA. Genotypering van Arabidopsis planten individuen werd uitgevoerd met de dCAPS techniek direct van blad stoten. De geamplificeerde producten werden geknipt en de resulterende fragmenten waaruit het genotype van elk individu werden geanalyseerd door gelelektroforese (figuur 2). In dit voorbeeld werden de 160 bp PCR producten die de SNP-plaats van belang (G of A allel) in het Arabidopsis genoom geamplificeerd uit plantaardige bladuitsnijdingen de Phire Plant Direct PCR Kit. De voorwaartse primer bevatte een mismatch op het 3&#39;-uiteinde, waardoor een SspI-specifieke restrictieplaats in het doelwit DNA, die de SNP plaats (A allel) maar nietin het andere allel van de SNP (Figuur 2B). Verdunning protocollen nodig zijn voor veeleisende plantmateriaal, zoals eikenblad, vanwege de hoge concentratie van fenolische verbindingen. Met de verdunning hier beschreven protocol werd het 297 bp fragment van chloroplast DNA geamplificeerd met de 3-staps protocol. Eikenblad specimens met verschillende verdunningen zijn weergegeven in figuur 3, naast positieve en negatieve controles. De Phire Animal Tissue Kit Direct PCR werd toegepast met een uitdagende protocol waarin slechts een primer set was voor amplificatie van twee fragmenten gebruikt met een groot formaat voortvloeiende verschil in overvloedige opbrengsten van beide juiste grootte van 1.500 bp producten voor transgene muizen en 200 bp voor wild type muizen (figuur 4). De zwakkere bovenste band met heterozygote muizen door concurrentie van beide templates (allelen) voor hetzelfde primerpaar, maar de genotyping resultaten zijn eenduidig. De stabiliteit van de monsters bereid met de verdunning protocol werd ook getest. De resultaten tonen aan dat de verdunning monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende ten minste een jaar. Bovendien heeft herhaalde vries / dooicycli geen significante invloed op de reactie (Figuur 5). Ook getoond is de sterke amplificatie van muizenoor weefselmonsters met Phire DNA Polymerase en Direct PCR methode ten opzichte van hot start Taq polymerase en gezuiverd DNA (Figuur 6). <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Componenten </td><td fo:width=".75in"> 20 ui reactiemengsel </td><td fo:width=".75in"> 50 ul reactie </td><td fo:width=".75in"> Eindconc. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> In 20 ui </td><td> In 50 ul </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire Plant PCR Buffer </td><td> 10 pi </td><td> 25 pi </td><td> 1x </td></tr><tr><td> primer A </td><td> X pi </td><td> X pi </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> primer B </td><td> X pi </td><td> X pi </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> Phire Hot Start II-DNA-polymerase </td><td> 0,4 pl </td><td> 1 pi </td><td></td></tr><tr><td> Voorbeeld / directe protocol </td><td></td><td> 0,50 mm punch </td><td></td></tr><tr><td> Voorbeeld / verdunning protocol </td><td> 0,5-1 ul </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1.<html> Reactie-omstandigheden voor Plant PCR gebruikt in dit protocol. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Cycle Stap </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Tijd </td><td fo:width=".4in"> Cycli </td></tr><tr><td> Initiële denaturatie </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denaturerende Gloeien * Uitbreiding </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sec 5 sec 20 sec </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Laatste verlenging </td><td> 72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min houden </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Cycling voorwaarden voor Plant PCR gebruikt in dit protocol. * De Tm calculator oposcientific.com / pcrwebtools &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.thermoscientific.com / pcrwebtools wordt aanbevolen het bepalen van de Tm voor primers voor gebruik met Phire Hot Start II DNA Polymerase. de aanbevolen temperatuur voor annealing primers ≤ 20 nt is gelijk aan de lagere Tm die de webtool. primers voor&gt; 20 nt, met een hybridisatietemperatuur 3 ° C lager dan de lagere Tm door de webtool. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Componenten </td><td fo:width=".75in"> 20 ui reactiemengsel </td><td fo:width=".75in"> Eindconc. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> In 20 ui </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire dierlijk weefsel PCR Buffer </td><td> 10 pi </td><td> 1x </td></tr><tr><td> primer A </td><td> X pi </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> primer B </td><td> X pi </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> Phire Hot Start II-DNA-polymerase </td><td> 0,4 pl </td><td></td></tr><tr><td> Voorbeeld / verdunning protocol </td><td> 1 pi </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 3. Reaction voorwaarden voor dierlijk weefsel PCR gebruikt in dit protocol. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Cycle Stap </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Tijd </td><td fo:width=".4in"> Cycli </td></tr><tr><td> Initiële denaturatie </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denaturerende Gloeien * Uitbreiding </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sec 5 sec 20 sec ≤ 1 kb 20 sec / kb&gt; 1 kb </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Laatste verlenging </td><td>72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min Houden </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabel 4. Cycling voorwaarden voor dierlijk weefsel PCR gebruikt in dit protocol. * De Tm rekenmachine <a href="http://www.thermoscientific.com/pcrwebtools" target="_blank">www.thermoscientific.com / pcrwebtools</a> wordt aanbevolen het bepalen van de Tm voor primers voor gebruik met Phire Hot Start II DNA Polymerase. De aanbevolen annealing temperatuur primers ≤ 20 nt is gelijk aan het laagste Tm door de webtool. Voor primers&gt; 20 nt, met een hybridisatietemperatuur 3 ° C lager dan de lagere Tm door de webtool. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Directe PCR workflow. Direct PCR kan worden uitgevoerd met twee alternatieve protocollen. In de directe protocol een kleine hoeveelheid monster wordt direct aan de PCR reactie. De verdunning protocol gebruikt een korte pre-incubatiestap voor PCR om DNA vrij te maken uit het monster. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Genotypering van Arabidopsis planten personen met dCAPS techniek direct van blad stoten. A) Figuur 2A toont het principe van de dCAPS assay uitgevoerd. De restrictieplaats in de SNP plaats wordt geïntroduceerd of verwijderd door PCR met een primer met een of meer mismatches aan het doel DNA. De PCR-producten worden gedigereerd en de resulterende fragmenten blijkt het genotype van elk individu wanneer geanalyseerd door elektroforese. B) 0,50 mm ponsen van bladeren werden direct in 50 pi PCR-reacties. Het 160 bp PCR producten die de SNP-plaats (G of A allel) werden geamplificeerd met primers invoering van een unieke Sspl plaats van de A-allel. Het ongezuiverde PCR producten werden spijsverteringted met Sspl restrictie-enzym. Resulterende fragmenten werden geanalyseerd op een 3% agarose gel. Laan M is de grootte marker, banen A en G corresponderen met de SNP allelen van elk monster. De verkregen resultaten werden bevestigd door conventionele analyse van DNA extractie gevolgd door PCR en restrictiedigestie (data niet getoond). De negatieve controle reacties zonder template DNA werden in testopstelling en uitgevoerd op een aparte agarose gel in parallel met de werkelijke PCR reacties voordat de vertering (data niet getoond). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3.jpg" alt="Figuur 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3highres.jpg" /> Figuur 3. Verdunning protocol met eikenblad. Uit de verdunning protocol werd gebruikt om de 297 bp fragment van chloroplast DNA in eikenblad monsters (3 stappen protocol, annealing bij 62 ° C) amplificeren bij verschillende verdunningen (1:100, 1:10, 1 : 1 en 2:1) en positieve en negatieve controles [C +: positieve controle van gezuiverd DNA (Arabidopsis), C-: negatieve controle zonder template DNA]. Het monster nomenclatuur is de monstername site (steden in Finland) en het monster nummering. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Genotypering van transgene muizen met een primer paar met de verdunning protocol. Ear weefsels van negen individuele muizen (lanen 1-9) werden in 20 ui Dilution Buffer met inbegrip DNARelease Additive. Na incubaties bij kamertemperatuur en 98 ° C, 1 pi supernatant werd gebruikt als een template in de PCR-reactie 20 pl. Fragment maten: 1.500 bp (transgene) en 200 bp (wildtype). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. Monsters bereid volgens de verdunning protocol zijn stabiel voor langdurige opslag. Monsters van muisoor weefsels waren inc<html> ubated in 20 pl Dilution Buffer met inbegrip DNARelease Additieve en onderworpen aan herhaalde bevriezing / ontdooien (laan 1), bewaard bij -20 ° C gedurende een jaar (baan 2), of direct gebruikt voor PCR (laan 3). Het geamplificeerde fragment maten waren 900 bp, 1500 bp en 3200 bp. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig6.jpg" alt="Figuur 6" /> Figuur 6. Phire dierlijk weefsel Direct PCR Kit presteert beter dan een commerciële DNA-zuivering in combinatie met een warme start Taq DNA-polymerase. Vier amplicons (0,5-1,5 kb) werden geamplificeerd uit muisoor weefsels met behulp van de verdunning protocol van Phire dierlijk weefsel Direct PCR Kit. Ter vergelijking werd eerst gezuiverd DNA met een commerciële DNA extraction kit en dezelfde fragmenten werden geamplificeerd met behulp van een hot start Taq DNA polymerase volgens aanbevelingen van de fabrikant. Alleen met de Phire dierlijke weefsel Direct PCR Kit waren alle vier de amplicons met succes versterkt. t &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig7.jpg" alt="Figuur 7" /> Figuur 7. Universele vergelijking van de werkstroom schatting van times / verbruikte reagentia. Thermo Scientific Direct PCR benadering wordt vergeleken met de DNA isolatie benadering de extractiebuffer benadering en de PCR buffer benadering. De geschatte tijd voor elke benadering voor de PCR stap wordt weergegeven in rood. De Thermo Scientific Direct PCR aanpak duurt slechts 0 tot 4 minuten voor de monstervoorbereiding voorafgaand aan de PCR. Onder elke methode worden de verbruikte reagentia genoemd. De Thermo Scientific Direct PCR benadering maakt gebruik van de minste hoeveelheid van de reagentia in vergelijking met de andere methoden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3844/3844fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> .

<ol><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li>
<li>Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+isolation+of+high+quality+genomic+DNA+from+fruit+trees+and+conifers+using+PVP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.</a> Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).</li>
<li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCAPS%2C+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms%3A+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).</li>
<li>Michaels, S. D., Amasino, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+method+for+detecting+single-nucleotide+changes+as+polymorphic+markers+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR.</a> The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).</li>
<li>John, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+isolation+of+RNA+and+DNA+from+plants+containing+polyphenolics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).</li>
<li>Wang, Z., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+mouse+tails%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from mouse tails.</a> BioTechniques. 41, 410-412 (2006).</li>
<li>Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+High+Molecular+Weight+DNA+for+Reliable+Genotyping+of+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice.</a> BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).</li>
<li>Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+Leaves+Using+AnyDirect+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory%22">Molecular Cloning: A Laboratory</a>. , 2nd ed, CSH Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+method+for+sampling+and+extraction+of+mouse+DNA+for+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR.</a> Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).</li>
</ol>

Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Thermo Fisher Scientific, Inc

De Direct PCR aanpak gedemonstreerd hier zorgt voor PCR-amplificatie rechtstreeks van kleine hoeveelheden ongezuiverde monsters, het verminderen van de tijd die nodig is en vereenvoudiging van de workflow voor plant en dier genotypering (figuur 7). Ook hier blijkt het gebruik van de verdunning protocol in combinatie met de Direct PCR benadering (figuur 3). De verwatering protocol wordt aangeraden met moeilijke monsters (bijvoorbeeld oudere bladeren, planten die bevatten storende verbindingen) of met een lange (of GC-rijke) amplicons. Dit protocol is bijzonder nuttig wanneer een nieuw Direct PCR experiment, waardoor optimalisatie van de reactie. Het protocol kan dienen als middel om soms moeilijkheden zoals lage productopbrengsten door verschillen in weefselmateriaal en / of gebruikte primers pakken. Bovendien wanneer meerdere reacties van hetzelfde monster gebruik van de verdunning protocol zorgt het gehele monster niet verbruikt in eenreactie. Met het oog op DNA te zuiveren van planten voor PCR, de conventie was om cellysis gevolgd door DNA-isolatie met behulp van diverse componenten die zouden kunnen interfereren met PCR-analyse 8 uit te voeren. Voor bijzondere uitdaging planten met hoge fenolische gehalte toevoeging van polyvinylpyrrolidon werd traditioneel gebruikt om de verbindingen die aan DNA binden na cellysis 2,5 verwijderen. Zoals duidelijk hier kunnen deze ingewikkelde, tijdrovende stappen worden vermeden door gebruik van de PCR Phire Plant Direct Kit om het doelwit DNA te detecteren. Cellysis en DNA isolatie stappen overbruggen gevoelige technieken dCAPS direct van Arabidopsis bladeren (figuur 2). Zoals hier aangetoond, de verdunning protocol beheert effectief de aanwezigheid van problematische componenten die kunnen interfereren met PCR (figuur 3). Traditioneel, een voorwaarde voor dier genotypering was isolatiop genomisch DNA van dierlijk weefsel door een giftige, tijdrovend proces gekenmerkt door een langdurige incubatie met proteinase K de huid en bindweefsel, gevolgd door extractie met organisch oplosmiddel, alcohol precipitatie en centrifugatiestappen 6,9,10 verteren. Zoals hier aangetoond worden vereenvoudigd dit proces bereikt door gebruik van de Phire Animal Tissue Direct PCR Kit, waardoor transgene muizen worden gegenotypeerd zonder DNA zuivering (Figuur 4). Het voorbeeld die in dit artikel is bijzonder uitdagend slechts een primer set werd gebruikt voor amplificatie van twee fragmenten met een groot verschil in grootte. Ondanks aangeboren het protocol moeilijkheden gebruik van de PCR Direct benadering in combinatie met de eenvoudige verdunning protocol resulteerde in hoge opbrengsten van de twee PCR producten (figuur 4). PCR gebaseerde detectie target DNA heeft vele toepassingen in onderzoek, inclusief genotype analyse omde rol van genen in de ontwikkeling, fysiologie en ziekte. Door de inhibitor tolerantie van de gespecialiseerde DNA polymerasen, kunnen de protocollen worden voltooid in minimale tijd zonder DNA zuivering.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Phire Plant Direct PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-130 </td><td> 200 reacties (50 pl elk) </td></tr><tr><td> Phire Animal Tissue Direct PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-140 </td><td> 200 zoveel mogelijk te beperken (50 pl elk) </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0,35 mm (roze) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-180S / L </td><td> Aantal: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0,50 mm (blauw) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-185S / L </td><td> Aantal: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Cutting Mat 6,4 × 7,6 cm </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-190 </td><td> Aantal: 5 </td></tr><tr><td> Sspl </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> ER0771 </td><td> 100 pl (100 reacties) </td></tr><tr><td> Piko 24-Well Thermal Cycler </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Well Piko PCR-platen </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR Purification Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 preps 250 preps </td></tr></tbody></table>

genotypering van plantaardige en dierlijke monsters zonder voorafgaande dna-zuivering

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Direct PCR benadering vergemakkelijkt PCR amplificatie direct van kleine hoeveelheden ongezuiverde monsters, en wordt hier reeds een aantal plantaardige en dierlijke weefsels (figuur 1). Direct PCR is gebaseerd op speciaal ontworpen Thermo Scientific Phusion en Phire DNA polymerasen die een dubbelstrengs DNA bindend domein dat hen unieke eigenschappen zoals hoge tolerantie van remmers omvatten. PCR-gebaseerde doel DNA-detectie heeft tal van toepassingen in plantenonderzoek, met inbegrip van plantaardige genotype analyse en verificatie van transgenen. PCR uit plantenweefsel gaat van oudsher een eerste DNA-isolatie stap, die dure of toxische reagentia. Het proces is tijdrovend en verhoogt het risico op kruisbesmetting 1, 2. Omgekeerd door Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit het doelwit DNA kan gemakkelijk worden gedetecteerd, zonder DNA extractie. In het model aangetoond hier eenvoorbeeld van afgeleide gekloofd versterkt polymorf sequentie analyse (dCAPS) 3,4 gebeurd rechtstreeks van Arabidopsis bladeren van de planten. dCAPS genotyperingsproducten kan worden gebruikt om enkelvoudige nucleotide polymorfismen (SNPs) te identificeren door SNP allel-specifieke restrictie-endonucleasedigestie 3. Sommige gewasmonsters doorgaans moeilijker tijdens directe PCR methoden zoals ze componenten die interfereren met PCR, zoals fenolverbindingen. In deze gevallen wordt een extra stap aan de verbindingen te verwijderen traditioneel vereist 2,5. Hier wordt dit probleem ondervangen door een snelle en eenvoudige verdunning protocol gevolgd door directe PCR-amplificatie (figuur 1). Vijftien jaar oude eiken bladeren worden gebruikt als een model voor uitdagende planten als de als model bevat een hoog gehalte aan fenolische verbindingen met inbegrip van tannines. Gentransfer in muizen is in grote lijnen gebruikt om de rol van genen in ontwik studerenpment, fysiologie en ziekte van de mens. Het gebruik van deze dieren is screening op de aanwezigheid van het transgen, meestal met PCR. Traditioneel betekent dit een tijdrovende DNA isolatiestap, waarbij DNA voor PCR analyse wordt gezuiverd uit het oor, de staart of teen weefsels 6,7. Echter, met de Thermo Scientific Phire dierlijk weefsel Direct PCR Kit transgene muizen worden gegenotypeerd zonder voorafgaande DNA-zuivering. In dit protocol transgene muis genotypering direct verkregen uit muizenoor weefsels, zoals hier aangetoond een uitdagende bijvoorbeeld wanneer slechts een primer set wordt gebruikt voor amplificatie van twee fragmenten verschillen sterk in grootte.

De Direct PCR hier gepresenteerde benadering vergemakkelijkt PCR-amplificatie rechtstreeks van kleine hoeveelheden ongezuiverd planten-en dierlijk weefsel.

Genotypering van plantaardige en dierlijke monsters zonder voorafgaande DNA-zuivering

De Direct PCR-methode maakt PCR-amplificatie direct vanuit kleine hoeveelheden ongezuiverde monsters mogelijk, en wordt hier gedemonstreerd voor verschillende planten en ...

Het algemene doel van deze video is om drie voorbeelden te demonstreer van PCR-amplificatie direct vanuit kleine hoeveelheden ongezuiverde monsters, waaronder plant- en dierlijke weefsels. Directe PCR kan worden uitgevoerd met twee alternatieve protocollen. In het directe protocol wordt een minimale hoeveelheid ongezuiverd monster direct aan de PCR-reactie toegevoegd, terwijl het verdunningsprotocol een korte pre-incubatiestap vóór de PCR vereist om DNA uit het monstermateriaal vrij te maken.In het eerste voorbeeld wordt de genotypering van arabidopsis uitgevoerd met behulp van het directe protocol. Er wordt een allelspecifieke restrictieplaats geïntroduceerd in het doel-DNA, waarna allelspecifieke enkelvoudige nucleotidepolymorfismen worden geïdentificeerd na digestie met restrictie-endonucleasen. Vervolgens wordt het verdunningsprotocol gebruikt om eerst specifieke DNA-fragmenten uit 15 jaar oude eikenbladeren te amplificeren, en daarna transgene muizen direct te genotyperen vanuit muisoorweefsel.In alle drie de voorbeelden wordt DNA-amplificatie bereikt zonder enige zuiveringsstappen van het monster voorafgaand aan de PCR, door middel van de direct PCR-methode. Het belangrijkste voordeel van direct PCR ten opzichte van de traditionele methoden is dat er geen DNA-extractie- of zuiveringsstappen vereist zijn. Dit vertaalt zich in een besparing van zowel tijd als kosten.Begin de analyse van de afgeleide cleaved, amplified polymorphic sequence of de decaps-genotyperingsassay door eerst PCR-reacties van 20 of 50 µL samen te stellen met de plant direct PCR-kit, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Neem vervolgens een pons van 0,50 mm uit een blad van een Arabidopsis-plant met de Harris Uni unicorn en een snijmat, waarbij de pons stevig wordt vastgehouden. Druk de snijkant in het weefsel en draai de pons heen en weer.Druk op de zuiger om de ponsschijf in een PCR-reactiemengsel te schieten. Zorg ervoor dat het monster in de PCR-oplossing valt en niet aan de twee wanden blijft plakken. Om kruiscontaminatie in het directe protocol te voorkomen, is het essentieel om de juiste methode voor het reinigen van het bemonsteringsinstrument te gebruiken.Reinig de snijkant van de stansmachine tussen elk monster door deze in een 2% natriumhypochlorietoplossing te dopen. Druk de zuiger een paar keer omhoog en omlaag en veeg de snijkant af met een schoon papieren handdoekje. De snijmat moet tussen de monsters ook worden afgespoeld.Gebruik vervolgens een Pico 24-well thermocycler en een PCR-plaat om de PCR-reacties uit te voeren volgens de cycluseigenschappen die worden beschreven in de tekst bij deze video. Centrifugeer na de PCR het plantmateriaal. Draag 5 µL van de supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis naden toevoeging van 4 µL water. Voeg 1 µL van de restrictie-endonucleases SSP toe, meng voorzichtig en centrifugeer kort om de inhoud onderin de buis te verzamelen.Incubeer het reactiemengsel gedurende één uur bij 37 °C. Inactiveer vervolgens het restrictie-enzym door 20 minuten te incuberen bij 65 °C. Voeg na de restrictie-enzymvertering 2,5 µL van een vijf x laadbuffer toe aan de reactie.Voer agarosegelelektroforese uit om de resulterende fragmenten te analyseren door 10 µL van het resulterende mengsel in de gel te laden. Begin hiermee door een pons van twee millimeter uit een eikenblad te nemen. Plaats het monster in 20 µL verdunningsbuffer die bij de plant direct PCR-kit is geleverd.Maak de snijkant van de prik- en snijmat zoals eerder beschreven schoon en verbrijzel het bladmonster met een 100 µL pipetpunt door deze kort tegen de wand van de buis te drukken. Centrifugeer de monsters kort in een microcentrifugebuis totdat de reacties zich onderin de buizen bevinden. Het supernatant kan direct in de PCR worden gebruikt of kan één op 10 of één op 100 worden verdund in steriel water.Gebruik, afhankelijk van het type monster, 0,5 µL tot 1 µL van het supernatant of de verdunning als template voor een PCR-reactie van 20 µL. Stel de reacties op zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Gebruik, zodra de reacties zijn voorbereid, de PICO 24-well thermocycler en PCR-plaat om de PCR-reacties uit te voeren volgens de cycluscondities die in de tekst worden beschreven.Voeg na de PCR vijf µL van een 5x laadbuffer toe aan de reactie en voer agarosegelelektroforese uit met 15 µL van het resulterende mengsel. Begin het verdunningsprotocol voor het genotyperen van transgene muizen door een pons van 2 mm muisoorweefsel te plaatsen in 20 µL verdunningsbuffer die 0,5 µL van de bij het dierweefsel geleverde DNA-release-additief bevat. Incubeer de monsters van de Direct PCR-kit gedurende twee minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door een incubatie van twee minuten bij 98 °C.Gebruik na het centrifugeren van de monsters één microliter supernatant als template voor een PCR-reactie van 20 microliter. Supernatant dat niet direct wordt gebruikt, kan worden overgebracht naar een nieuwe buis en worden bewaard bij minus 20 graden Celsius. Als laatste stap worden de 24-well thermocycler en PCR-plaat gebruikt om de PCR-reacties uit te voeren volgens de cycluseringscondities die in de beschreven procedure staan vermeld. Voeg na de PCR vijf microliter 5x laadbuffer toe aan de reactie en voer agarosegelelektroforese uit met 15 microliters van het resulterende mengsel in de dCAPS-techniek. De restrictieplaats binnen het betreffende SNP wordt geïntroduceerd of vernietigd met behulp van een PCR-primer met één of meer mismatches ten opzichte van het target-DNA.In dit voorbeeld werden de 160 basepaar lange PCR-producten die de snip-site van belang g of a in het genoom van arabidopsis bevatten, geamplificeerd uit bladponsjes van planten met de fire plant direct PCR-kit. De forward-primer bevatte één mismatch aan het 3'-uiteinde, waardoor een SspI-specifieke restrictiesite in het doel-DNA ontstond, die wel het A-allel maar niet het andere allel van de snip bevatte. De ongezuiverde PCR-producten werden verteerd met het restrictie-enzym SspI en de resulterende fragmenten werden geanalyseerd op een agarosegel; banen g en a komen overeen met de snip-allelen van elk monster.Op deze afbeelding bevinden zich de intacte PCR-producten aan de linkerzijde en de gedigesteerde fragmenten aan de rechterzijde. Voor problematisch plantmateriaal, zoals het eikenblad, zijn verdunningsprotocollen noodzakelijk vanwege de hoge concentratie aan fenolische verbindingen, waarbij gebruik wordt gemaakt van het hier beschreven verdunningsprotocol. Het chloroplast-DNA-fragment van 297 baseparen werd geamplificeerd met een driestaps-protocol.Eikenblospecimens met verschillende verdunningen worden getoond, naast positieve en negatieve controles. De fire animal tissue direct PCR-kit werd gebruikt voor de amplificatie van twee fragmenten met een groot verschil in grootte met slechts één primer-set, wat resulteerde in overvloedige opbrengsten van beide correcte productgroottes van 1500 basenparen voor transgene muizen en 200 basenparen voor wild-type muizen. De zwakkere bovenste band bij heterozygote muizen is te wijten aan de competitie van beide templates voor dezelfde primer-binding.De genotyperingsresultaten zijn echter eenduidig. De stabiliteit van de monsters die met het verdunningsprotocol waren voorbereid, werd eveneens getest. De resultaten laten zien dat verdunde monsters die waren onderworpen aan herhaalde vries-dooi-cycli en monsters die gedurende ten minste één jaar bij minus 20 °C waren bewaard, vergelijkbaar waren met monsters die direct voor PCR werden gebruikt. Om de prestaties van deze procedure verder te testen, werden vier amplicons uit muizenoorweefsels geamplificeerd met behulp van het verdunningsprotocol van de Fire Animal Tissue Direct PCR Kit.Ter vergelijking werd DNA eerst gezuiverd met een commerciële DNA-extractiekit en werden dezelfde fragmenten geamplificeerd met een hot start tac DNA-polymerase volgens de aanbevelingen van de fabrikant; alleen met de fire animal tissue direct PCR-kit werden alle vier de ampliconen succesvol geamplificeerd. Directe PCR is bijzonder nuttig bij genotyperingsstudies waarbij amplificatie van grote aantallen monsters vereist is. Het overslaan van de DNA-zuiveringsstap kan de benodigde tijd voor het experiment aanzienlijk verkorten. De techniek biedt aanvullende voordelen door het risico op contaminatie te verminderen en kostbaar monstermateriaal te besparen.

genotyping-of-plant-and-animal-samples-without-prior-dna-purification

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij presenteren een niet-invasieve sampling aanpak voor een efficiënte haarmonsters te verzamelen van ongrijpbare kleine zoogdieren, zoals te zien voor de Amerikaanse pika. Tonen we het nut van deze methode door extractie DNA van bemonsterd haar en versterken van verschillende soorten van moleculaire merkers vaak gebruikt in studies van wilde dieren ecologie en natuurbehoud.

Een niet-invasieve Hair samplingtechniek om High Quality DNA verkrijgen van Elusive kleine zoogdieren

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

Dit artikel beschrijft DNA-extractie uit zebravisstaartclip. Het protocol demonstreert een snelle en efficiënte methode om zebravis genotypen te analyseren.

DNA-extractie uit staartclip: een methode die wordt gebruikt bij het genotyperen van zebravissen

De cystic fibrosis luchtwegen als voorbeeld, het manuscript presenteert een uitgebreide workflow omvattende een combinatie van metagenomic en metatranscriptomic benaderingen van de microbiële en virale gemeenschappen in dieren door monsters te karakteriseren.

Zuiveren van de Onzuivere: Sequencing metagenomes en Metatranscriptomes van Complex-Animal geassocieerd Samples

Bacteriële effector eiwitten zijn belangrijk voor het vaststellen succesvolle infecties. Dit protocol beschrijft de experimentele identificatie van proteïne bindingspartners van een bacteriële effector eiwit in zijn natuurlijke plantaardige gastheer. Het identificeren van deze effector interacties via gist-twee-hybride-schermen is uitgegroeid tot een belangrijk instrument in het ontrafelen van de moleculaire pathogeniteit strategieën.

Het ontrafelen van de functie van een bacteriële Effector uit een niet-landbouw Plant Pathogeen Met behulp van een gist two-hybrid screen

Hier wordt een methode beschreven voor de extractie, zuivering en kwaliteitscontrole van genomisch DNA van de obligate biotrofe schimmelpathogeen, echte meeldauw, voor gebruik in genoomsequencing met lange reads.

Zuivering van hoog molecuulgewicht Genomic DNA van echte meeldauw voor Long-Read Sequencing

De vergelijking en optimalisatie van twee organellaire DNA-verrijkingsmethoden worden voorgesteld: traditionele differentiële centrifugatie en fractionering van het totale gDNA op basis van methyleringsstatus. We beoordelen de resulterende DNA-hoeveelheid en kwaliteit, tonen de prestaties aan bij korte-leesvolgorde-sequencing, en bespreken het potentieel voor gebruik bij langlezen single-molecule sequencing.

Optimalisatie en Vergelijkende Analyse van Plant Organellaire DNA Verrijkingsmethoden Geschikt voor Volgend Sequencing

Met behulp van een pBIBAC-GW binaire vector maakt genereren van transgene planten met intact single-kopie invoegingen, een eenvoudig proces. Hier is een reeks van protocollen die leiden de lezer door het proces van het genereren van transgene planten van Arabidopsis en testen van de planten voor INTACTHEID en aantal kopieën van de inserts gepresenteerd.

Genereren van transgene planten met Single-kopie invoegen met behulp van de binaire Vector BIBAC-GW

Het doel van dit protocol is met een combinatie van rekenkundige en onderzoek van de Bank te vinden van nieuwe sequenties die niet gemakkelijk kunnen worden gescheiden van een mede zuiverende sequentie, die slechts gedeeltelijk bekend kan zijn.

Nieuwe reeks ontdekking door subtractieve Genomics

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van DNA-barcoderingstechnologie om plantaardige medicinale materialen te authenticeren, en de medicinale plant Angelica sinensis (Oliv.) Diels werd als voorbeeld aangewezen.

Toepassing van DNA-barcodering om geneeskrachtige planten te identificeren

Leer Direct PCR voor genotypering van planten en dieren zonder DNA-zuivering. Deze methode bespaart tijd en kosten bij moleculair biologisch onderzoek met Arabidopsis en muizen.

Genotypering van plantaardige en dierlijke monsters zonder voorafgaande DNA-zuivering

Meer video's verkennen