Multiphoton Microscopie van Gewist Mouse Brain uiten YFP

Multiphotonmicroscopie van gefixeerd weefsel is normaal gesproken beperkt tot geringe penetratiedieptes van slechts enkele honderden microns. Onlangs hebben we het eerste gebruik van multiphotonmicroscopie tot een diepte van enkele millimeters in gefixeerde muisorganen gedemonstreerd door middel van optische klaring met een oplossing van benzoalcohol en benzoylbenzoaat. In onze initiële demonstratie beeldde de techniek de intrinsieke weefsel fluorescentie af.

Er is echter een groeiende belangstelling voor het gebruik van optische klaringmethoden bij weefsels die fluorescerende eiwitten zoals GFP tot expressie brengen. Hier presenteren wij een protocol voor multifotonmicroscopie van geklaard hersenweefsel met dezelfde benzoalcoholoplossing die de fluorescentie van het door de dij uitgedrukte geel fluorescerend eiwit behoudt. Eén promoter in de muizenhersenen. Hogeresolutiebeeldvorming van het gehele orgaan van de muis met behulp van multifotonmicroscopie wordt mogelijk gemaakt door het orgaan optisch te klaren vóór beeldvorming zonder klaring. Multifoton.

Beeldvorming van de hersenen is beperkt tot 300 microns onder het weefseloppervlak vanwege verstrooiingseffecten die worden veroorzaakt door de verschillen in brekingsindexen van water en de eiwitten waaruit het hersenweefsel bestaat. Om deze beperking te overwinnen, wordt het orgaan gedehydrateerd en wordt het water vervangen door een vloeistof met een vergelijkbare brekingsindex als die van de eiwitten in het weefsel. Dit proces van optische klaring helpt de lichtverstrooiing aanzienlijk te verminderen, waardoor betere beeldvorming dieper onder het weefseloppervlak mogelijk wordt.

Afbeeldingen van Batta et al. laten zien hoe deze techniek kan worden toegepast om de histologie van verschillende muisorganen te bekijken met behulp van intrinsieke fluorescentie en tweede harmonische generatie. Deze eerste afbeelding is van de teelbal van een muis, genomen 1.4 millimeters onder het weefseloppervlak. De hoge resolutie van multifotonmicroscopie stelt ons in staat om in te zoomen en een duidelijk beeld te krijgen van de individuele spermacellen die zich vormen in de zaadbuisjes.

Zoals hier uiterst rechts te zien is, tonen we een afbeelding van de muizenlong, die eveneens 1,4 millimeter onder het weefseloppervlak is genomen. Deze afbeelding is een demonstratie van twee-kanaals multifoton-imaging waarbij de elastinecomponenten in het rood zijn gelabeld en het collageen in het groen; bij het inzoomen zijn individuele vezels gemakkelijk te onderscheiden. Ten slotte tonen we hoge-resolutiebeelden van de binnenregio's van de muizenhersenen, genomen 850 micron onder het weefseloppervlak. Door in te zoomen op de neocortex en hippocampus van de hersenen kunnen individuele astrocyten en neuronale cellichamen duidelijk worden waargenomen.

Echter, bij optisch geklaarde organen die fluorescerende eiwitten zoals YFP kunnen bevatten, behoudt het optische klaringsprotocol van badra et al. het fluorescentiesignaal van deze fluorescerende eiwitten niet. Het hier gepresenteerde protocol is een nieuwe methode voor optische klaring van het gehele orgaan en beeldvorming van de hersenen van muizen, waarbij het fluorescentiesignaal van YFP en neuronen behouden blijft door de hersenen te dehydrateren met een ethanol-gradiëntserie en te klaren met een één-op-twee oplossing van benzylalcohol-benzylbenzoaat, ook wel bekend als BAB; dit is aangetoond om de schade aan de fluorescerende eiwitten te verminderen en hun fluorescentiesignaal te behouden. Voor multiphoton-beeldvorming worden YFP-muizen eerst gewogen en vervolgens geanestheseerd met een intraperitoneale injectie van ketamine-xylazine.

Een chirurgisch vlak van anesthesie moet worden bevestigd voordat er met de operatie kan worden begonnen. Het dier moet elke vijf minuten worden gecontroleerd om te zien of het reageert op een stevige kneep in de teen of de staart. Als het dier reageert, is een aanvullende dosis ketamine xylazine vereist.

Zodra de muizen zijn geanestheseerd, worden ze gefixeerd door elke ledemaat met laboratoriumtape aan een operatietafel te bevestigen, zodat de muis in rugligging ligt en de borstkas toegankelijk is voor de operatie. Om te beginnen wordt een incisie gemaakt onder het xiphoïdusproces om een snede langs de basis van de ribbenkast te maken, waarbij een schaar en pincetten worden gebruikt om de huid terug te trekken terwijl de snede wordt gezet. Vervolgens worden er aan weerszijden van het borstbeen van de muis twee sneden gemaakt om een weefselflap te creëren, die met een hemostaat van de borstholte wordt weggehouden zodat het hart bloot komt te liggen. Daarna wordt een naald van 23 gauge in de linker ventrikel van het hart ingebracht, en wordt er een kleine incisie gemaakt in de spierwand van het rechter atrium om het bloed te laten ontsnappen. Direct nadat het rechter atrium is ingesneden, wordt een perfusie met fosfaatgebufferde zoutoplossing van 4 °C gestart totdat er geen bloed meer uit het rechter atrium stroomt.

Tijdens de perfusie wordt een peristaltische pomp gebruikt, ingesteld op een pompkracht waarbij de vloeistof 1,5 tot twee inch van de naaldpunt wordt uitgestoten. Zodra al het bloed is afgevoerd, wordt het perfusiemedium vervangen door een 4%paraformaldehyde-oplossing bij vier graden Celsius, totdat het lichaam van de muis merkbaar rigide en stijf wordt. Na de perfusie wordt de muis van de operatietafel gehaald en gedecapiteerd om met een pincet en irisschaar over te gaan tot de excisie van de hersenen.

De schedel wordt in kleine secties verwijderd, beginnend bij de achterzijde van de schedel en bewegend naar voren. Met de schaar worden om de twee tot vier millimeter kleine inkepingen in de schedel gemaakt, terwijl de pincet wordt gebruikt om het bot voorzichtig in kleine stukjes van de hersenen weg te trekken; dit wordt herhaald totdat het gehele bovenoppervlak van de hersenen is blootgelegd. De hersenen worden vervolgens met een chirurgische spatel uit de schedel verwijderd en geplaatst in een glazen flacon met 4%paraform aldehyde om zes uur lang te fixeren.

Hoewel we ons voor deze demonstratie primair richten op de beeldvorming van een muizenbrein dat YFP tot expressie brengt, zullen we ook een muis, een achterpoot en een sectie van een dunne darm optisch klaren om de klarmogelijkheden van deze procedure optimaal aan te tonen. Na de post-fixatie worden het brein en andere weefsels twee keer gewassen in PBS. De weefselmonsters worden vervolgens bij kamertemperatuur gedehydrateerd via een reeks ethanol-incubaties bij concentraties van 50%, 70%, 90% en 100% ethanol.

Elke incubatie duurt twee uur, gevolgd door een tweede incubatie van 12 uur in 100% ethanol om het water efficiënt uit het gefixeerde weefsel te extraheren. Na dehydratatie wordt de laatste 100% ethanol-oplossing weggegoten en worden de weefselmonsters gedurende twee uur ondergedompeld in een een-op-een oplossing van ethanol en BAB, alvorens ze in 100% BAB-klaarmakingsoplossing worden geplaatst.

Zodra ze in BAB zijn, worden de hersenen en andere weefselmonsters binnen vier tot vijf uur merkbaar transparant. Hier tonen we een time-lapsevideo van de eerste zes uur van het optische klaringproces. De oversprong markeert het moment waarop de één-op-één oplossing van ethanol en BAB werd vervangen door een 100% BAB-oplossing.

Na zes uur vertonen alle organen tekenen van transparantie; zo is bijvoorbeeld het bot in het achterpootje van de muis nu duidelijk zichtbaar voor optimale resultaten van het klaren. De hersenen moeten zes dagen bij kamertemperatuur worden gelaten om te klaren, terwijl ze worden afgeschermd van fel licht. Zodra de hersenen geklaard zijn en gereed zijn voor beeldvorming, worden ze met Sano-acryl of secondelijm aan de bodem van de Petrischaal bevestigd.

Nadat de lijm is opgedroogd, wordt het brein ondergedompeld in BAB en wordt de petrischaal onder het objectief geplaatst voor beeldvorming. Voor de beeldvorming gebruiken we een multifotonmicroscoop die is uitgerust met een MI tie titanium-saffierlaser, instelbaar tussen een excitatiegolflengte van 710 en 990 nanometer. De excitatiegolflengte die we gebruiken om YFP-signalen op te wekken is 886 nanometer.

Het reflecterende fluorescentiesignaal wordt vervolgens vastgelegd met een NIK icon five x objectief, waardoor beeldvorming met een groot gezichtsveld mogelijk is. Het reflecterende fluorescentiesignaal wordt gefilterd met een 5 35 50 banddoorlaatfilter en verzameld met een folder met hoge kwantumefficiëntie. Multiplier twee van OMA Matsu beelden worden verwerkt met scan image-software bij een resolutie van 2048 bij 2048 pixels met een scansnelheid van twee milliseconden per lijn om YFP-beelden met een hoge resolutie te genereren.

Zodra de beeldvorming is voltooid, wordt het brein uit de P twee schaal verwijderd en bewaard in BAB, afgeschermd van licht voor toekomstige beeldvorming. De hier getoonde representatieve beelden en video's demonstreren de hoge-resolutie multiphoton-beeldvormingscapaciteit die mogelijk is gemaakt door optische klaring. Beeldvorming van het gehele brein zorgt ervoor dat YFP-gelabelde neuronen in de verschillende lagen van de hippocampus en neocortex duidelijk zichtbaar zijn tot een diepte van twee millimeter onder het weefseloppervlak.

Hier tonen we een video van een image stack van 1,2 millimeter van een volledige mond-scan, genomen op een diepte van 0,8 tot twee millimeter in de hersenen om de verschillende anatomische lagen van de hippocampus te onthullen. Het volgende is een representatief beeld van een coronale sectie op 1,94 millimeter caudaal ten opzichte van de Bregma, genomen uit de image stack van twee millimeter diep, waarin de verschillende lagen van de hippocampus zijn gelabeld. Door in te zoomen op de neocortex zijn de individuele axonen en neuronale cellichamen van de laag vijf piramidale neuronen van de neocortex duidelijk te onderscheiden tot 1,02 millimeter onder het weefseloppervlak.

Hier tonen we een beeldstack van neuronen in laag vijf, gemaakt tussen 700 en 1020 micron onder het weefseloppervlak. De volgende afbeelding is een representatief beeld uit die stack, genomen op 774 micron diepte in de hersenen. Met behulp van dezezelfde beeldstack is een 3D-reconstructie van de neuronregio gemaakt met Image J-software.

De hoge resolutiecapaciteit van multi-bot microscopie stelt ons ook in staat om beelden van volledige individuele neuronen te presenteren. Hier tonen we een reconstructie van een neuron uit laag vijf van de neocortex waarin D genetische processen duidelijk zichtbaar zijn. Hiermee sluiten we onze presentatie af over optische klaring van het hele mouse sprain dat YFP tot expressie brengt.

Het uitvoeren van deze techniek is relatief eenvoudig en, zoals we hebben aangetoond, kan deze worden gebruikt om vele verschillende regio's en structuren van de muizenmilt te bekijken en te beelden. Bedankt voor het kijken en veel succes.