Name: High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Leer hoe je een modulair eiwitarray maakt zonder zuiveringsstappen met behulp van een microfluïdische PDMS-opstelling. Deze methode maakt on-chip transcriptie en translatie mogelijk voor diverse eiwitbibliotheken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door Marie Curie internationale re-integratie subsidie.

1. Device Fabrication <ol><li> Gekochte DTPA-D SU-8-controle schimmel en SPR220-7 stroom mal van het Stanford Microfluidics Foundry ( <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry" target="_blank">www.stanford.edu / groep / gieterij</a> ). </li><li> Bloot silicone mallen chloortrimethylsilaan (TMCS) gedurende 10 min damp van het elastomeer afgifte bevorderen na het bakken stap 9. </li><li> Een mengsel van siliconen elastomeer en uithardingsmiddel (goed mengen) in twee verschillende verhoudingen 5:1 en 20:1 voor de controle en stroom vormen, respectievelijk. De verschillende verhoudingen noodzakelijk voor een goede hechting van meerdere lagen. </li><li> Giet de 5:1 PDMS op de controle laag (ongeveer 5 mm hoogte). Ontgas de besturingslaag en bakken gedurende 30 minuten bij 80 ° C. Spin coat (Laurell, USA) de PDMS 20:1 mengsel van het debiet laag bij 2.600 rpm gedurende 60 sec en daarna bakken bij 80 ° C gedurende 30 minuten. De spin coater snelheid is geoptimaliseerd voor klepbediening bij een drukvan 15 psi. Sneller draaiende resulteert in een dunnere laag met lagere activering druk en vice versa. De apparaten we een limiet van 25 psi in de controle en 10 psi in de stroom, waarboven onthechting van het substraat voorkomen. </li><li> Scheid de regellaag uit de matrijs. Doe het langzaam en voorzichtig niet te schillen de SU8 patroon. Snijd vervolgens het apparaat rond de omtrek en gaatjes aan de controle kanalen te openen. </li><li> Lijn de stroom en controle lagen handmatig onder een stereoscoop. Begin met het uitlijnen van de linkerbovenhoek, de knop klep (regellaag) moet in het midden van de reactiekamer (flow laag). Lijn vervolgens de eerste rij en voorzichtig laat de controle laag rij voor rij. Zorg ervoor dat de knop kleppen zijn in het midden van de reactiekamers en dat het adres en voer kleppen steken de stromingskanalen op de juiste positie. De werkwijze kan lokaal worden herhaald tot alle rijen zijn uitgelijnd. Aan het einde vrijgeven spanning in de PDMS by tillen voorzichtig van de zijkanten en hoeken. Til te veel of verkeerde uitlijning kan optreden. </li><li> Bakken gedurende 2 uur bij 80 ° C. </li><li> Uitgesneden rond de omtrek van de inrichting en de beide schil-laaginrichting (chip) van de stroom matrijs. Ponsen gaten in de stromingskanalen (figuur 1) toegankelijk. </li></ol> 2. DNA arraying en Device Alignment <ol><li> Produceer synthetische genen door assemblage PCR. De synthetische genen samenstellen van T7 promoter, ribosomale bindingsplaats (RBS), ORF twee epitoop tags (een aan elke zijde) en T7 terminator 4. De genen kunnen variëren in lengte van 100 bp tot ten minste 5000 bp. </li><li> Bereid de synthetische genen voor rangschikken: een mengsel van polyethyleen glycolconcentraat (1,25%) en D-trehalose dihydraat (125 mg / ml) en verdeel 2 pi per reactie in 384 wells plaat. Deze oplossing vermindert irreversibele binding van DNA aan het glas als voor visualisatie tijdens de uitlijning 10. </li&gt; <li> Breng de synthetische genen van de 384 putjes plaat. Gewoonlijk DNA concentraties kunnen variëren van 10 ng / ul tot 100 ng / ul eindconcentratie. Voeg dH 2 O tot een eindvolume van 20 pi (afhankelijk microarrayer en pin type). </li><li> Spot een reeks van synthetische genen op epoxy gecoat glas substraten met behulp van een microarrayer. Wij gebruiken MicroGrid 610 (Bio Robotics) met SMT-S75 siliconen pennen (parallelle synthese, USA). Contact afdrukken van het DNA met deze specifieke pennen resultaten in spots met een diameter van ongeveer 100 urn op de glasplaat. Elke pen lading voldoende voor ongeveer 100 spots. Controleer of de kolommen en rijen plaatsen overeen met de gebruikte specifieke apparaat. De inrichting we gebruiken bevat 16 kolommen en 40 rijen met een afstand van 680 um bij 320 urn respectievelijk. </li><li> Handmatig uitlijnen van de microfluïdische apparaat om het gen-array onder een stereoscoop. De DNA spot moet in het midden van het DNA kamers. Start de uitlijning door het lokaliseren van de eerste rij spots below de eerste rij DNA kamers. Vervolgens aan te passen de rest van de rijen afwerking met fijnafstelling van de gehele inrichting. Zodra de array is uitgelijnd zorg moeten worden genomen om stress te verlichten in het PDMS, door het opheffen van het lokaal. Als er spanning meer in de PDMS het kan niet goed hechten aan de microarray. </li><li> Tenslotte bond het apparaat het glaasje door overnacht incubatie op een hete plaat bij 80 ° C. </li></ol> 3. Priming en activeren van het apparaat <ol><li> De kleppen in de regellaag worden bediend vanaf de computer met LabVIEW. De LabVIEW script controleert een reeks elektromagnetische micro kleppen via een elektronische regelkast (gekocht bij Stanford Microfluidics Foundry). De magneetklep verdeelstuk is aangesloten op perslucht, die de luchtstroom en de druk in de regelkleppen van het apparaat bedienen. </li><li> Sluit het apparaat aan op de magneetkleppen verdeelstuk met behulp van een flexibele kunststof buis met een inwendige diameter van 0,02 &quot;(Tygon) En roestvrij stalen pin (New England Kleine Buizen Corporation). </li><li> Vul de buizen met DDW en steek de pen in de toegang gaten van de controle laag. Zorg ervoor dat iedere buis is verbonden aan de bijbehorende besturingskanaal. </li><li> Voer de LabVIEW applicatie op de computer om de controle kanalen te activeren. Door het activeren van de klep van de LabVIEW script, passen we de luchtdruk, die op zijn beurt zal het water te duwen in de PDMS controle kanalen. Stel de luchtdruk op 5 psi. Het wordt aanbevolen om de &#39;sandwich&#39; en het adres kleppen vul eerst, met het oog op cross-gesprekken tussen controle kanalen van defecte apparaten te identificeren. In het geval van cross-gesprekken, zal het bedienen van de &#39;sandwich&#39; stuurleiding leiden tot het in werking stellen van een van beide de nek of button control lijnen. Dit is vergelijkbaar met een kortsluiting in een elektrisch circuit. Een apparaat met cross-talk defect en kan niet worden gebruikt. </li><li> Immers de besturingskanalen en afsluiters vol DDW worden de kleppen primer en ready om de stroom kanalen onder hen blokkeren. Verhoog de druk tot 15 psi. Activering klep wordt bediend via een LabVIEW programma via een reeks aan / uit schakelaars verbonden met afzonderlijke magneetkleppen. Elke schakelaar regelt een specifieke controle lijn door het bijbehorende magneetventiel. Het inschakelen van de schakelaar knop (in het script) geldt luchtdruk in de desbetreffende buis. De luchtdruk duwt de DDW in de bedieningsleiding en resulteert in een uitzetting van de microfluïdische kleppen, blokkeert het kanaal eronder. Het uitschakelen van een regelklep, zal vrijgeven de luchtdruk en vervolgens laat de blokkering van de respectieve stromingskanaal. </li><li> Opdat alle kleppen open zijn, sluit een buis met een van de ingangen stroom en stroom lucht in de inrichting van 4-5 psi. Hierdoor komt elke kleverige kleppen van het glasplaatje. </li><li> Tenslotte wordt de inrichting voorbereid en klaar. Sluit de ingang en &quot;nek&quot; kleppen, om de oppervlaktechemie te starten. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Surface Chemistry <ol><li> Om de zelf-assemblage van een eiwit array op het oppervlak vergemakkelijken en voorkoming van niet-specifieke adsorptie in de microfluïdische apparaat wordt het oppervlak chemisch gewijzigd: </li><li> Een component stromen door de inrichting, sluit een nieuwe buis met de gewenste oplossing voor een van de stromingskanalen in het apparaat. Sluit de vrije zijde van de buis om de handleiding spruitstuk en open de luchtdrukbediening (5 psi). </li><li> Plaats 40 pi van gebiotinyleerd-BSA (1 pg / pl) in een nieuwe buis en stroming ongeveer de helft gedurende 20 min door de inrichting zal de BSA binden aan het oppervlak epoxy. </li><li> Gebruik Hepes (50 mM) voor het wassen gereageerde substraat tussen elk van de verschillende oppervlaktechemie stappen. </li><li> Flow 25 ul streptavidine (0,5 ug / ul) gedurende 20 min bovenop de gebiotinyleerde-BSA. </li><li> Wassen met Hepes gedurende 5 minuten. </li><li> Sluit de &#39;button&#39; ventiel en stroomt de rest van de gebiotinyleerde-BSA (zoals beschrebed hierboven), passiveren het oppervlak rond de knop. </li><li> Wassen met Hepes gedurende 5 minuten. </li><li> Laat de &quot;toets&quot; klep en stroom 30 pl penta-His-biotine (0,16 ug / ul) gedurende 20 minuten. Het antilichaam zal binden aan het blootgestelde strepavidine, specifiek de oppervlakte onder de &#39;knop&#39; Een anti His-tag array. </li></ol> 5. Protein Expression <ol><li> Druk de eiwitten op het apparaat met behulp van konijn reticulocyten snelle gekoppeld transcriptie en translatie reactie. Eiwitexpressie van de spotted synthetische genen maakt het apparaat een reeks van eiwitten klaar voor gebruik. Bijvoorbeeld, een dergelijk gebruik voor eiwitbinding scherm. </li><li> Open de &#39;nek&#39; kleppen en stroomleidingen konijn reticulocyten snelle gekoppeld transcriptie en translatie reactie door het apparaat in het DNA kamer. Vervolgens sluit u de &#39;sandwich&#39; kleppen en scheiden elk gen uit de omgeving. Incubeer de inrichting op een hete plaat gedurende 2,5 uur bij 30 ° C. Uitgedrukt proteins zal diffunderen van het DNA kamer naar de reactiekamer spontaan (hals klep open) en binden aan het anti-His antilichaam onder de &quot;toets&quot; valve immobiliseren van het eiwit door het C-terminus tag. </li><li> Label de eiwitten met C-myc Cy3 antilichaam. Het antilichaam zal binden aan het overeenkomstige epitoop gelegen op het eiwit N-terminus. </li><li> Bepaal eiwit expressie niveaus met een microarray scanner (LS Reloaded, Tecan) met een 532 nm laser en 575 nm emissie filter. </li></ol> 6. Representatieve resultaten 1. Device Fabrication Een grafisch ontwerp voor het apparaat is gemaakt door AutoCAD op basis van onze experimentele behoeften. Het ontwerp gedrukt op een transparante film door een hoge resolutie setter. Deze transparantie dient als een fotomasker in contact fotolithografie. Een oppervlak micromachining techniek werd gebruikt om 3-D sjablonen op een silicium wafer bepaald door de patronen geschreven op thij maskers gebruikt. De microfluïdische inrichting werd vervaardigd op silicone vorm gieten siliconenelastomeer polydimethylsiloxaan (PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, USA) (figuur 1). Elk apparaat bestaat uit twee uitgelijnde PDMS lagen, het debiet en de controle laag. De matrijs werd eerst blootgesteld aan chloortrimethylsilaan (TMCS, Aldrich) damp gedurende 10 min om elastomeer afgifte bevorderen na het bakken stappen. Een mengsel van silicone elastomeer op basis en verharder werd bereid in twee 5:1 en 20:1 voor de controle en stroom vormen, respectievelijk. De regellaag werd ontgast en gedurende 30 minuten gebakken bij 80 ° C. De stroming laag werd aanvankelijk gespincoat (Laurell, USA) bij 2.600 rpm gedurende 60 sec en gebakken bij 80 ° C gedurende 30 minuten. De regellaag werd gescheiden van de matrijs en control channel toegangsgaten werden geponst. Vervolgens werden de stroom en controle lagen handmatig uitgelijnd onder een stereoscoop en gebakken gedurende 2 uur bij 80 ° C. De tweelaagse apparaat werd afgepeld from de stroom mal en stroomkanalen toegang gaten werden geslagen. 2. Device Description De inrichting capaciteit kan variëren van 500 tot 10.000 eenheidscellen (figuur 2). Het apparaat bestaat uit twee lagen; stroom laag (grijs) en controle laag (kleur). De regellaag bevatten verschillende ventielen met verschillende functie. Elke eenheidscel, in de stroming laag bestaat uit een DNA en een reactiekamer en wordt bestuurd door drie types van micromechanische kleppen; &#39;nee&#39;, &#39;knop&#39; en &#39;sandwich&#39; (figuur 2A). &#39;Synthetische gen &quot;A spotted afgezet binnen de kamer wordt geblokkeerd DNA uit de reactiekamer door de&#39; hals &#39;ventiel (groen). Vangen en mechanisch wassen oppervlakte gebonden eiwitten in de reactiekamer wordt uitgevoerd door de &quot;toets&quot; valve (blauw). De &quot;sandwich&quot; klep kan elke reactie optreedt in haar eenheidscel (rood). Het adres kleppen kunnen splitsen van het apparaat tot 8 onafhankelijke secties, voor different toestand assay. Bovendien de regellaag bevatten ingang kleppen die de stroming van fluïdum geselecteerd in de stroom laag mogelijk. De PDMS-controle-kanalen zijn vol met DDW. Wanneer een klep wordt de drukverhoging bediend (15 psi) resulteert in de uitbreiding van de PDMS. Op plaatsen waar het membraan dun genoeg (bijvoorbeeld overschrijding van controle en stroomleidingen) is dit voldoende om volledig te blokkeren de stroomlijn. Gemiddelde eenheidscel hoogte 10 pm en gemiddelde celvolume is minder dan 1 nl. 3. Eiwitten Expressie en detectie Eiwitten werden tot expressie op het apparaat met konijnen reticulocyten lijst gekoppelde transcriptie en translatie reactie (Promega). De expressie van de eiwitten gemaakt een reeks van eiwitten klaar voor gebruik in een binding (afbeelding 3). Een uitdrukking mix (12,5 pi) werd geladen in het apparaat en vervolgens overspoeld in het DNA kamers door het openen van de &#39;nek&#39; kleppen. Vervolgens worden de &#39;sandwich&#39; kleppen warengesloten waarbij elke eenheidscel gescheiden van de naburige cellen en het apparaat werd geïncubeerd op een hete plaat gedurende 2,5 uur bij 30 ° C. Expressie gebrachte eiwitten verspreid door het gen kamer in de reactiekamer, waar hun C-terminus His tag kan binden de anti-His antilichaam (Qiagen) gelokaliseerd onder de &quot;toets&quot; valve immobiliseren van het eiwit op het oppervlak. Eiwitten werden gemerkt met een C-myc Cy3 (Sigma), die gebonden zijn overeenkomstige epitoop gelegen op het eiwit N-terminus en bestempeld. Eiwitexpressie werden bepaald met een microarray scanner (LS Reloaded, Tecan) met een 532 nm laser en 575 nm filter. Het resulterende eiwit array bestaat uit verschillende niveaus van eiwitexpressie. Meestal ongeveer 20% van een genbibliotheek niet detecteerbare niveaus tot expressie. Geen correlatie met eiwit grootte werd waargenomen 3. Achtergrondniveaus werden bepaald met kamers die niet gespot met DNA. Dus signalen van de overeenkomstige proteïne kamers zijn door ofwel noise of niet-specifieke adsorptie van de etikettering antilichamen. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Chip Fabrication. (A) Matrijzen werden behandeld met TMCS dampen gedurende 10 minuten. (B) PDMS is gegoten op controle en doorstroming siliconenmatrijzen. (C) Zowel en stroomregulering matrijzen worden gebakken in 80 ° C gedurende 30 minuten. (D) De regellaag gepeld van de mal, op maat gesneden en controle inlaten geponst. (E) De regellaag is uitgelijnd met de stroom laag onder een stereoscoop en vervolgens gebakken in 80 ° C gedurende 2 uur. Parallel aan de PDMS apparaat fabricage, wordt een reeks van synthetische genen microarrayed op epoxy gecoat glas substraten (CEL Associates). (F) De inrichting wordt dan afgestemd op de DNA microarray vangen van de &#39;synthetische genen in het DNA kamers. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Een foto van de PING-apparaat. (A) Het apparaat Consist van twee uitgelijnde PDMS lagen (controle en stroming). De stroming laag bevat parallel DNA en reactiekamers (grijs) gecontroleerd door micromechanische kleppen (&quot;button&quot;, &quot;sandwich&quot; en &quot;neck&quot;) in de controle laag. (B) De lagen zijn uitgelijnd op een gedrukte microarray, welke programma elk DNA kamer met een punt. Dit voorkomt mogelijke verontreiniging. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Fluorescent Protein afbeeldingen van een array gemaakt met een microfluïdische chip. De gedrukte spot genen tot expressie van eiwitten in de inrichting (in het DNA kamer) en werden getrokken naar de oppervlakte (onder de &quot;knop&quot; klep in de reactiekamer) via hun C-terminus Zijn tag. Eiwitexpressie werd gedetecteerd met behulp van hun C-myc tag N-terminus en een specifieke fluorescente antilichaam. Ander signaal intensiteiten wijzen ander eiwit expressie niveaus. Un-gevlekte kamers dienden als controlegroep voor achtergrond leVels.

<ol><li>Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+column%3A+Microfluidic+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Integration column: Microfluidic high-throughput screening.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 1, 19-29 (2009).</li>
<li>Hong, J. W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+nanoliter+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrated nanoliter systems.</a> Nature. 21, 1179-1183 (2003).</li>
<li>Unger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nature. 6, 71-74 (2009).</li>
<li>Einav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+hepatitis+C+target+and+its+pharmacological+inhibitors+by+microfluidic+affinity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of a hepatitis C target and its pharmacological inhibitors by microfluidic affinity analysis.</a> Nature. 26, 1019-1027 (2008).</li>
<li>Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+identification+and+biophysical+characterization+of+transcription-factor+binding+sites+with+microfluidic+affinity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">De novo identification and biophysical characterization of transcription-factor binding sites with microfluidic affinity analysis.</a> Nature Biotechnology. 28, 962-967 (2010).</li>
<li>Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science (New York, N.Y.). 293, 2101-2105 (2001).</li>
<li>Ramachandran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Self-assembling protein microarrays.</a> Science (New York, N.Y.). 305, 86-90 (2004).</li>
<li>Zhong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab on a chip. 8, 68-74 (2008).</li>
<li>Kusnezow, W., Hoheisel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supports+for+microarray+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+recognition+JMR%22%5BJournal%5D)">Solid supports for microarray immunoassays.</a> Journal of molecular recognition JMR. 16, 165-176 (2003).</li>
<li>Lundin, M., Monne, M., Widell, A., Von Heijne, G., Persson, M. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+the+membrane-associated+hepatitis+C+virus+protein+NS4B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B.</a> Journal of virology. 77, 5428(2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit artikel presenteren we een methode voor het genereren eiwitseries in high-throughput met behulp van een microfluïdische platform. De array generatie is gebaseerd op microarray afdrukken van DNA templates en in vitro eiwitexpressie van DNA in de microfluïdische apparaat. Onze nieuwe microfluïdische platform heeft een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van de thans gebruikte methoden, waardoor het een veelbelovende en algemeen instrument voor proteomics. Een voordeel is ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens / Equipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> PDMS-Sylgard 184 </td><td> Dow Corning USA </td><td> ESSEX-DC </td></tr><tr><td> Chloortrimethylsilaan (TMCS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C72854 </td></tr><tr><td> Epoxy gecoat glas substraten </td><td> CEL Associates USA </td><td> VePo-25C </td></tr><tr><td> Polyethyleen glycolconcentraat (PEG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 81260 </td></tr><tr><td> D-trehalose dihydraat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9531 </td></tr><tr><td> Gebiotinyleerd-BSA </td><td> Doorboren </td><td> PIR-29130 </td></tr><tr><td> Neutravidine </td><td> Doorboren </td><td> 31050 </td></tr><tr><td> penta-His-biotine </td><td> Qiagen </td&gt; <td> 34440 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> <a href="http://www.bioind.com/htmls/article.aspx?c0=741&amp;bsp=13384" target="_blank">Biological Industries</a> </td><td> 03-025-1B </td></tr><tr><td> TNT-T7 </td><td> Promega </td><td> L5540 </td></tr><tr><td> C-myc antilichaam Cy3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr><tr><td> Schakelkast </td><td> Stanford Microfluidics Foundry </td><td></td></tr><tr><td> Schimmel </td><td> Stanford Microfluidics Foundry </td><td></td></tr><tr><td> Pin </td><td> New England Kleine Buizen Corporation </td><td></td></tr><tr><td> Tygon microbore buis </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Microarrayer </td><td> Bio Robotics </td><td> MicroGrid 610 </td></tr><tr><td> Silicone pinnen </td><td> Parallel Synproefschrift </td><td> SMT-S75 </td></tr></tbody></table>

high-throughput eiwit expressie generator met behulp van een microfluïdische platform

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Snel toenemende velden, zoals systeembiologie, vereisen de ontwikkeling en implementatie van nieuwe technologieën, waardoor high-throughput en high-fidelity metingen van grote systemen. Microfluidics belooft aan veel van deze vereisten, zoals het uitvoeren van high-throughput screening experimenten on-chip, omvattende biochemische, biofysische en cel-gebaseerde testen 1. Sinds de vroege dagen van microfluidics apparaten is dit gebied sterk ontwikkeld, wat leidt tot de ontwikkeling van microfluïdische grootschalige integratie 2,3. Deze technologie maakt de integratie van duizenden van micromechanische kleppen op een apparaat met een post-sized footprint (figuur 1). We hebben een high-throughput microfluïdische platform voor het genereren van in vitro expressie van eiwit arrays (Figuur 2) naam PING (eiwitinteractienetwerk Generator). Deze arrays kan dienen als een sjabloon voor veel experimentenzoals eiwit-eiwit 4, eiwit-RNA 5 of eiwit-DNA interacties 6. Het apparaat bestaat uit duizenden reactiekamers, die individueel worden geprogrammeerd met behulp van een microarrayer. Uitlijning van de gedrukte microarrays microfluidics apparaten programma elke kamer met een plek tegelijkertijd potentiële verontreiniging of kruisreactiviteit Bovendien genereren microarrays met behulp van standaard technieken microarray spotten is ook zeer modulair, waardoor het rangschikken van eiwitten 7, 8 DNA, kleine moleculen en zelfs colloïdale suspensies. De potentiële impact van microfluidics op de biologische wetenschappen is aanzienlijk. Een aantal microfluidics gebaseerde assays zijn reeds nieuwe inzichten in de structuur en functie van biologische systemen en het gebied van microfluidics blijft biologie beïnvloeden.

We een microfluïdische benadering voor de expressie van eiwit arrays. De inrichting bestaat uit duizenden reactiekamers gecontroleerd door micro-mechanische kleppen. De microfluïdische apparaat is gekoppeld aan een microarray-gedrukte gen bibliotheek. Deze genen worden vervolgens getranscribeerd en getranslateerd on-chip, resulterend in een eiwit array klaar voor experimenteel gebruik.

High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform

Snelgroeiende vakgebieden, zoals de systeembiologie, vereisen de ontwikkeling en implementatie van nieuwe technologieën die high-throughput en ... mogelijk maken.

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een modulaire eiwitarray die geen zuiveringsstap vereist, waardoor deze compatibel is met elke eiwitbibliotheek. Dit wordt bereikt door eerst synthetische genen te genereren via assemblage-PCR. Vervolgens worden de synthetische genen op epoxy-dia's geplaatst in een array.Gebruik PDMS met siliconen controle- en stroommallen om het microfluïdische apparaat te vervaardigen. Vervolgens wordt het microfluïdische apparaat uitgelijnd met de gespotte DNA-array. Ten slotte wordt konijnreticulocytlysaat door het microfluïdische apparaat geleid en worden de eiwitten tot expressie gebracht.Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die de expressie van duizenden eiwitten aantonen via fluorescerende antilichaamlabeling. Er zijn verschillende voordelen aan het gebruik van de microfluidische techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals eiwit-microarrays. Wij maken een microarray van DNA en gebruiken vervolgens cellis om eiwitten op het apparaat te produceren.Hierdoor is eiwitzuivering niet vereist en drogen de eiwitten nooit uit. Ze blijven gedurende het gehele experiment vers. De microfluïdische techniek biedt bovendien een hogere

high-throughput-protein-expression-generator-using-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een high-throughput, geautomatiseerd platform van de productie cellijn ontwikkeling voor de productie van therapeutische eiwitten is beschreven. Uitvoering van de BD FACS Aria Cell Sorter, heeft CloneSelect Imager en Tecan Freedom EVO liquid handling systeem gedemonstreerd aanzienlijk toegenomen verwerkingscapaciteit in cellijn ontwikkeling met verbeterde cellijn kwaliteit en een hoge reproduceerbaarheid.

Een High-throughput geautomatiseerd platform voor de ontwikkeling van Manufacturing Cell Protein Therapeutics Lines voor

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

We hebben een geautomatiseerde celkweek en verhoor platform ontwikkeld voor micro-schaal cel stimulatie experimenten. Het platform biedt eenvoudige, veelzijdige en precieze controle in het cultiveren en stimuleren van kleine populaties van cellen en het terugwinnen van lysaten voor moleculaire analyses. Het platform is geschikt voor studies die kostbare cellen en / of reagentia.

Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten

De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Eencellige sequencing blijkt genotypische heterogeniteit in biologische systemen, maar de huidige technologieën ontbreken de doorvoer die nodig zijn voor de diepe profilering van communautaire samenstelling en functie. Hier beschrijven we een microfluidic workflow voor het rangschikken &gt; 50.000 eencellige genomen uit verschillende cel populaties.

Een met-throughput Microfluidic Platform voor eencellige genoom Sequencing

Dit protocol detailleert de stappen, kosten, en apparatuur die nodig is voor het genereren van E. coli-op basis van cel extracten en uit te voeren in vitro eiwit synthese reacties binnen 4 dagen of minder. Om de invloed van de flexibele aard van dit platform voor brede toepassingen, bespreken we reactie voorwaarden die kunnen worden aangepast en geoptimaliseerd.

Escherichia coli-cel-Free eiwitsynthese gebaseerd: protocollen voor een robuuste, flexibele en toegankelijk platformtechnologie

Het fabricageproces van een op PDMS gebaseerd, meerlaagse, microfluïdisch apparaat waarmee in vitro transcriptie-en vertalings Reacties (IVTT) gedurende langere perioden kunnen worden uitgevoerd, wordt beschreven. Bovendien wordt een uitgebreid overzicht gegeven van de hardware en software die nodig is voor het automatiseren en onderhouden van deze reacties voor langdurige duur.

Een Multilayer microfluidic platform voor de geleiding van langdurige cel-vrije genexpressie

We presenteren een microfluïdisch systeem voor studies met hoge doorvoer op complexe levensmachines, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. De microfluïdische chip maakt de analyse van de zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk.

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

Dit protocol beschrijft het Cell-Free Protein Synthesis (CFPS)-systeem dat wordt gebruikt bij het bouwen van synthetische cellen. Het schetst de belangrijkste fasen met representatieve resultaten in verschillende microcompartimenten. Het protocol heeft tot doel best practices vast te stellen voor diverse laboratoria in de synthetische celgemeenschap, waardoor de vooruitgang in de ontwikkeling van synthetische cellen wordt bevorderd.

Celvrij eiwitsynthesesysteem voor het bouwen van synthetische cellen

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Leer hoe je een modulair eiwitarray maakt zonder zuiveringsstappen met behulp van een microfluïdische PDMS-opstelling. Deze methode maakt on-chip transcriptie en translatie mogelijk voor diverse eiwitbibliotheken.

High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform

Meer video's verkennen