High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform
August 23rd, 2012
We een microfluïdische benadering voor de expressie van eiwit arrays. De inrichting bestaat uit duizenden reactiekamers gecontroleerd door micro-mechanische kleppen. De microfluïdische apparaat is gekoppeld aan een microarray-gedrukte gen bibliotheek. Deze genen worden vervolgens getranscribeerd en getranslateerd on-chip, resulterend in een eiwit array klaar voor experimenteel gebruik.
Het algemene doel van deze procedure is om een modulair eiwitarray te creëren dat geen zuiveringsstap vereist, waardoor het compatibel is met elke eiwitbibliotheek. Dit wordt bereikt door eerst synthetische genen te genereren via assemblage PCR. Vervolgens worden de synthetische genen op epoxy-slides gearrayed.
Om het microfluïdische apparaat te fabriceren, gebruik PDMS met siliconencontrole- en stromingsvormen. Vervolgens wordt het microfluïdische apparaat uitgelijnd op de gespot DNA-array. Ten slotte wordt konijnenreticulocytenlysaat door het microfluïdische apparaat gestroomd en worden eiwitten tot expressie gebracht.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de expressie van duizenden eiwitten laten zien door middel van fluorescente antilichaamkleuring. Er zijn verschillende voordelen voor het gebruik van de microfluïdische techniek boven bestaande methoden zoals eiwitmicroarrays. We microarray DNA en gebruiken vervolgens cellis om eiwitten op het apparaat te maken.
Zodoende hebben we geen eiwitzuivering nodig en drogen de eiwitten nooit uit. Ze blijven vers gedurende het hele experiment. De microfluïdische techniek biedt ook hogere gevoeligheid. Om het microfluïdische apparaat te fabriceren, stel de siliconencontrole- en stromingsvormen bloot aan chloort rimethyl sileenv apeur gedurende 10 minuten om de afgifte van het elastomeer te bevorderen.
Na de bakstappen, bereid een mengsel van siliconen gebaseerd elastomeer en verhardingsmiddel in twee verschillende verhoudingen van vijf op een en twintig op een voor de controle- en stromingsvormen respectievelijk. Giet de vijf op een PDMS op de controlelaag. Ontgast de controlelaag en bak deze gedurende 30 minuten bij 80 graden Celsius.
Spin vervolgens de twintig op een PDMS-mengsel op de stromingslaag bij 2.600 RPM gedurende 60 seconden en bak deze vervolgens gedurende 30 minuten bij 80 graden Celsius. Scheid langzaam de controlelaag van de mal, wees voorzichtig om het SU acht patroon niet af te pellen. Snijd vervolgens het apparaat rond de omtrek met een scalpel en gebruik een stompe naald om gaten te prikken om onder een microscoop toegang te krijgen tot de controlekanalen.
Handmatig uitlijnen van de stromings- en controlelaag, beginnend met de linkerbovenhoek en het knopventiel op de controlelaag in het midden van de reactiekamer positioneren. Vervolgens de eerste rij uitlijnen en de controlelaag voorzichtig rij voor rij loslaten. Zorg ervoor dat alle knopkleppen in het midden van de reactiekamers staan en dat de adres- en inlaatkleppen de stromingskanalen op de juiste positie kruisen.
Herhaal het proces lokaal totdat alle rijen zijn uitgelijnd. Wanneer volledig uitgelijnd, laat alle spanning in de PDMS los door deze voorzichtig van de zijden en hoeken op te tillen. Bak vervolgens het apparaat gedurende twee uur bij 80 graden Celsius na het bakken.
Snij om de omtrek heen en pel de tweedelige apparaat van de stromingsmal om gaten te maken om toegang te krijgen tot de stromingskanalen om DNA-constructen voor het apparaat te genereren. Voer PCR uit om synthetische genen te produceren die bestaan uit een T zeven promotor, een ribosoombindingsplaats, een open leesraam met verschillende epitope-tags aan beide uiteinden en een T zeven terminator. Om de synthetische genen voor het arrayen voor te bereiden, maak een mengsel van polyethyleenglycol en D triosedihydraat. Spuit twee microliter per reactie in de putjes van een 384.
Puttenplaat. Voeg de synthetische genen toe aan een 384 puttenplaat. Voeg vervolgens gedistilleerd water toe tot een eindvolume van 20 microliter.
Gebruik vervolgens een microarray-spot om een reeks synthetische genen op epoxy gecoate glazen substraten te spotten.lijn de microfluïdische apparaat handmatig uit onder een stereoscoop uit met de genenarray met de DNA-spot gepositioneerd in het midden van de DNA-kamers. Breng vervolgens de rest van de rijen in lijn.
Werk af met fijnafstemming van het hele apparaat om eventuele spanning op de PDMS te verlichten en ervoor te zorgen dat het goed hecht aan de microarray. Til het lokaal op. Bond tenslotte het apparaat aan de glazen plaat door het een nacht te incuberen op een hotplate bij 80 graden Celsius.
Voedselkleuren worden in deze sectie gebruikt voor visualisatiedoeleinden. De kleppen in de controlelaag worden bediend vanaf de computer met behulp van lab view. Het lab view-script bestuurt een reeks solenoid microkleppen via een elektronische besturingskast.
De manifold van de solenoidklep is verbonden met perslucht, die de luchtstroom en druk naar de controlekleppen op het apparaat regelt. Gebruik een flexibele plastic slang met een binnendiameter van 0,02 inch en een roestvrijstalen pin om het apparaat te verbinden met de manifold van de solenoidkleppen. Vul de buizen met dubbel gedistilleerd water en steek de pin in de toegangsgaten van de controlelaag.
Zorg ervoor dat elke buis is verbonden met het bijbehorende controlekanaal. Om de controlekanalen te activeren, voert u de lab view-toepassing uit, stelt u de luchtdruk in op vijf PS.I en past vervolgens luchtdruk toe door de klep te activeren vanuit het lab view-script. Dit zal water in de PDMS-controlekanalen duwen om potentiële crosstalk tussen controlekanalen van defecte apparaten te identificeren.
Vul eerst de sandwich- en adreskleppen. Nadat alle controlekanalen en kleppen vol water zijn, prime de kleppen om de stromingskanalen eronder te blokkeren. Door eerst de luchtdruk te verhogen tot 15 PSI en vervolgens in het lab view-programma door een reeks aan-uit-schakelaars die zijn verbonden met individuele solenoidkleppen.
Activeer alle kleppen door alle schakelknoppen in te schakelen om ervoor te zorgen dat alle kleppen open staan. Verbind een buis met een van de stromingsinvoeren en stroming lucht met vier tot vijf PSI in het apparaat. Dit zal eventuele plakkerige kleppen van de glazen plaat losmaken.
Het apparaat is nu geprimed en klaar voor visualisatiedoeleinden. Gele voedselkleurstof wordt gebruikt om de reagentia in deze sectie te visualiseren en de kleurloze oplossing vertegenwoordigt de hippies om de zelfassemblage van een eiwitarray op het oppervlak te vergemakkelijken en niet-specifi
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een microfluïdische benadering voor de expressie van eiwitarrays, gebruikmakend van een apparaat met duizenden reactiekamers die worden aangestuurd door micro-mechanische kleppen. De integratie van een microarray-gedrukte genbibliotheek maakt on-chip transcriptie en translatie mogelijk, resulterend in een kant-en-klare eiwitarray.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microfluidica
- Eiwitexpressie
- Genbibliotheken
Achtergrond
- Eiwitarrays zijn essentieel voor verschillende biologische analyses.
- Traditionele methoden vereisen vaak zuiveringsstappen, wat de compatibiliteit beperkt.
- Microfluïdische apparaten kunnen het proces van eiwitexpressie stroomlijnen.
- Assembly PCR wordt gebruikt om synthetische genen voor arraying te genereren.
Doel van de studie
- Om een modulaire eiwitarray te creëren zonder zuiveringsstappen.
- Om de compatibiliteit met elke eiwitbibliotheek te verbeteren.
- Om de efficiëntie van eiwitexpressie met behulp van microfluïdica te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Generatie van synthetische genen door assembly PCR.
- Arraying van synthetische genen op epoxy-slides.
- Fabricage van een microfluïdisch apparaat met behulp van PDMS.
- Doorstromen van konijnen reticulocytenlysaat in het apparaat voor eiwitexpressie.
Belangrijkste resultaten
- Een functioneel microfluïdisch apparaat werd succesvol gecreëerd.
- Eiwitten werden on-chip geëxpresseerd zonder zuivering.
- De methode toonde compatibiliteit met verschillende eiwitbibliotheken.
- On-chip transcriptie en translatie werden effectief bereikt.
Conclusies
- Deze microfluïdische benadering vereenvoudigt de creatie van eiwitarrays.
- Het elimineert de noodzaak voor zuivering, waardoor de bruikbaarheid wordt verbeterd.
- De techniek kan worden toegepast op diverse eiwitbibliotheken voor onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This microfluidic protein expression platform enables high-throughput generation of functional protein arrays without purification, addressing a key bottleneck in target validation and interaction screening. By maintaining proteins in a native, non-denatured state on-chip, the method supports reliable detection of protein-protein, protein-DNA, and protein-RNA interactions. This capability enhances predictive confidence in early discovery by reducing false negatives from protein loss or misfolding during purification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional target validation by expressing full-length proteins with correct folding and post-translational modifications.
- Operational Value: Eliminates purification steps, reducing sample loss and increasing throughput for large-scale library screening.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by providing quantitative expression data for thousands of variants in parallel.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized protein arrays directly from DNA templates, ensuring batch-to-batch consistency for reproducible interaction assays.
- Operational Value: Integrates gene arraying and protein expression on a single microfluidic device, minimizing hands-on time and cross-contamination risk.
- Assay Readiness: Produces quantifiable fluorescent readouts compatible with microarray scanners for high-density interaction mapping.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables rapid profiling of protein interactions across disease-relevant targets identified in upstream omics studies.
- Biomarker Alignment: Supports screening for autoantibodies or therapeutic binding events using patient-derived samples on expressed antigen arrays.
- Preclinical De-risking: Allows early assessment of off-target binding or cross-reactivity profiles before advancing candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from synthetic gene library preparation to interaction screening, enabling a seamless transition from target identification to lead validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by expressing arrayed genes to assess functional protein activity without purification bias.
- Screening: Delivers standardized, fresh protein arrays ready for immediate use in biochemical or biophysical interaction assays.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based readouts that allow comparison of expression levels and binding affinities across thousands of conditions.
- Translational Research: Connects genetic variants to functional protein outputs, enabling correlation with phenotypic or clinical data.
- Enterprise Reuse: The microfluidic platform can be reprogrammed with new DNA arrays, supporting iterative screening campaigns across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by expressing proteins in a native state, reducing artifacts from purification or denaturation.
- Operational Value: Enables parallel processing of thousands of reactions in a compact footprint, improving reagent efficiency and throughput.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by rapidly generating interaction data for large variant libraries.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on comprehensive interaction profiles and expression fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including PDMS molding and layer alignment.
- Depends on access to microarray spotting equipment for DNA array generation and microfluidic control systems (e.g., LabVIEW with solenoid valves).
- Necessitates standardized protocols for gene library preparation, including assembly PCR and epitope tagging for detection.
- Involves optimization of incubation times and reagent concentrations (e.g., rabbit reticulocyte lysate, biotinylated reagents) for specific protein expression goals.
- Limited by the accessibility of microfluidic fabrication facilities and the technical skill required for precise layer alignment and bonding.
