Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen

Het doel van dit experiment is om de effectiviteit van antibiotica tegen pseudomonas Aerogen-biofilms te beoordelen onder omstandigheden die representatief zijn voor chronische infecties in de long bij cystische fibrose, gebruikmakend van een gedefinieerd kunstmatig sputummedium. Bacteriële biofilms worden gekweekt in microtiterplaten met 24 putjes.

De biofilms worden vervolgens blootgesteld aan antibiotica. Daarna worden de met antibiotica behandelde culturen afgebroken met cellulase en geïncubeerd met een metabole kleurstof, srin, die door levensvatbare cellen van blauw naar roze wordt gereduceerd. Door de absorptie van de wells te meten, kan de minimale inhiberende concentratie van de biofilm, B-S-M-I-C, worden bepaald om de antibioticagevoeligheid onder bijna fysiologische omstandigheden te kwantificeren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de bepaling van minimale inhiberende concentraties op basis van planktonische culturen, is dat de bacteriën groeien in een gespecialiseerd medium dat alle componenten van sputum bevat, waardoor de vorming van biofilms wordt gestimuleerd. Deze biofilms zijn veel resistenter tegen antibiotica. Om het medium te maken, bereid eerst twee flessen voor met 250 milliliters steriel water in de eerste fles.

Voeg geleidelijk de roerder toe en voeg vervolgens vier gram DNA van vissperma toe aan 250 milliliters steriel water. Roer de oplossing bij kamertemperatuur en laat het DNA oplossen in de tweede fles. Voeg geleidelijk vijf gram mucine type twee uit varkensmaag toe en roer.

Zodra de DNA- en mucinesoluties klaar zijn, worden de aminozuren opgelost in 100 milliliter steriel water, met uitzondering van L tyrosine en L cysteine, die respectievelijk moeten worden opgelost in 25 milliliter water of 25 milliliter 0,5 molair kaliumhydroxide. Los vervolgens 5,9 milligram DTPA, vijf gram natriumchloride en 2,2 gram kaliumchloride op in 100 milliliter water. Combineer alle verschillende oplossingen in een fles van één liter, voeg daarna vijf milliliter eigeel-emulsie toe en vul het mengsel aan met water tot 850 milliliter.

Gebruik 1 M Tris om de pH op 6,9 in te stellen en vul het uiteindelijke volume aan tot 1 liter met water. Om het medium te steriliseren, wordt dit gefiltreerd met een vacuümpomp met twee membranen van het merk Vacuumbrand ME en een Millipore Stericup-filtereenheid met een hals van 45 mm en een poriegrootte van 0,2 µm. Het filtratieproces kan over twee dagen worden uitgevoerd. Het ASM-medium kan tot een maand worden bewaard bij 4 °C.

Begin met het verdunnen van overnight-culturen van Pseudomonas arosa in LB-medium om een OD van 0,05 te verkrijgen. Verdun de bacteriën vervolgens verder in een verhouding van 1:100 in een SM-mediumplaat; breng 1,8 milliliter van de verdunde bacteriecultuur per well aan in 21 wells van een 24-wells tissuekweekplaat. Verdeel hetzelfde volume SM-medium over de drie overgebleven wells, die dienen als blanco negatieve controles. Sluit de 24-wells plaat af en plaats deze onder micro-aerofiele omstandigheden om biofilmvorming mogelijk te maken; dit kan worden bereikt met behulp van CampiGen-gasgeneratiepacks in grote anaerobe potten.

Incubeer de cultuur op een schudder ingesteld op 75 RPM gedurende drie dagen bij 37 °C; na drie dagen zullen biofilms verschijnen als een gelatineuze massa die bacteriële cellen bevat en die niet door pipetteren kan worden verbroken. Zodra de biofilms zijn gevormd, voegt u per well 200 µL antibioticum toe in seriële verdunningsconcentraties. Zorg ervoor dat u ten minste vier replica's opstelt voor elke te testen drugconcentratie en laat vier wells met biofilms onbehandeld, zodat deze als negatieve controles kunnen dienen.

Incubeer de platen vervolgens nogmaals 24 uur na de incubatie met antibiotica. Gebruik 100 µL cellulase per well, verdund tot 100 mg/mL in citraatbuffer om de biofilms af te breken; incubeer de platen op een shaker ingesteld op 150 RPM onder aerobe omstandigheden bij 37 °C gedurende één uur. Na deze incubatie kan handmatig pipetteren worden gebruikt om de biofilms verder te desaggregeren als er cellenklonten in het medium zichtbaar zijn.

Voeg vervolgens 100 µL rezin per well toe om de levensvatbaarheid van de uit de biofilms vrijgekomen cellen te kwantificeren en incubeer de cellen gedurende één tot twee uur. Bij 37 °C zijn alleen levensvatbare cellen in staat om de blauwe zarin-kleurstof te metaboliseren naar de roze fluorescerende vorm. Breng de monsters na de incubatie over naar een 96-wells plaat en meet de fluorescentie van de wells met een excitatiegolflengte van 540 nm en een emissiegolflengte van 590 nm.

Om de bacteriële levensvatbaarheid en druggevoeligheid te kwantificeren, trekt u eerst de achtergrondfluorescentie van de blanco controle af van de overige wells. Bereken vervolgens het inhibitiepercentage door de gemiddelde fluorescentie voor elke concentratie te delen door de gemiddelde fluorescentie van de onbehandelde controles en dit met 100 te vermenigvuldigen. De B-S-M-Y-C wordt gedefinieerd als de antibioticaconcentratie die een inhibitie van 90% van de metabole activiteit veroorzaakt; zoals te zien is in deze elektronenmicrografieën, verschillen cellen die in biofilms zijn gegroeid aanzienlijk van bacteriën die in planktonische culturen zijn gegroeid.

In het bijzonder omringen grote hoeveelheden extracellulaire matrix, in het geel weergegeven, de cellen in de biofilm in het groen, maar niet in planktonische kolonies. Daarnaast zijn bacteriën in biofilms in dit experiment doorgaans resistenter tegen antibiotica. De minimale inhiberende concentratie van tobramycine voor de planktonische cultuur van Pseudomonas aerogenos in het blauw werd bepaald op ongeveer 4 µg/mL.

Daarentegen overleefde, zoals in het rood wordt weergegeven, 100% van de bacteriën in biofilms concentraties tot 512 micrograms per milliliter antibioticum. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe bacteriën gekweekt kunnen worden in een gedefinieerd kunstmatig sputummedium. U zou ook in staat moeten zijn om een antibioticagevoeligheidstest uit te voeren om de minimale inhiberende concentratie te bepalen die nodig is om de bacteriële groei te remmen in een omgeving die meer representatief is voor de long bij cystische fibrose.