Odorant-geïnduceerde responsen Opgenomen van olfactorische receptor neuronen met behulp van de zuignap Pipet Techniek

Het algemene doel van deze procedure is om door geurstoffen geïnduceerde reacties van olfactorische receptorneuronen bij muizen vast te leggen. Dit wordt bereikt door eerst het olfactorisch epitheel te disseceren en de olfactorische receptorneuronen van de muis te isoleren. De tweede stap is om de geïsoleerde olfactorische receptorneuronen in een opnamekamer te plaatsen die op een omgekeerde microscoop is gemonteerd.

Micro manipulators houden de opname-elektrode en een oplossingswisselaar vast. Zuig vervolgens een geïdentificeerd olfactorisch receptorneuron in de punt van een zuigpijpelektrode. De laatste stap is om de pijp met de aangezuigde cel in de punt ervoor te plaatsen voor een oplossingswisselaar om de neuron aan geurstoffen bloot te stellen.

Uiteindelijk wordt de zuigpijp-opnamemethode gebruikt om de functie van olfactorische receptorneuronen te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals de gehele cel spanningsklemmen techniek is dat het lange opnameduur toestaat met behulp van snelle en nauwkeurige oplossingsveranderingen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de vorm van de opnamepijp belangrijk is en het stabiel plaatsen van de socketcellen in de punt van de pijp moeilijk te leren is.

Begin deze procedure door een micropijp te trekken met een UNFI beklede bo silicaat glas capillair in een micropijptrekker met een lange verloop. Breng vervolgens de pijp over naar een op maat gemaakte micropijphouder gemonteerd op een rechtopstaande microscoop. De microscoop heeft een schuifregelaar in het oogstuk en een beweegbaar diamantmes gemonteerd op de standaard.

Bekijk vervolgens de punt van de pijp onder de 20 x objectief. Gebruik de schuifregelaar als gids. Schrijf voorzichtig de pijp onder een hoek van 90 graden met behulp van het op maat gemaakte diamantmes op de buitendiameter van de pijp van 10 micrometer.

Verplaats het diamantmes verder richting de punt. Oefen geleidelijk druk uit. De punt van de pijp moet op de plaats waar het is geschreven, schoon breken.

Polijst vervolgens onder een 40 x objectief de punt van de pijp tot een binnendiameter van vijf micrometer met behulp van een elektrisch verwarmd filament. Zodra dit is voltooid, is de micropijp klaar om te worden gebruikt voor het opnemen van stromen van de muis orns. In de volgende stap, offer een muis op en verwijder zijn kop.

Schilfer vervolgens de huid boven de schedel af en snijd de kop vervolgens langs de middenlijn doormidden. Breng vervolgens de twee helften naar een disserende stereomicroscoop. Trek het neustussenschot af en verwijder de olfactorische turbinaten.

Plaats het weefsel in een petrischaal met glucose bevattende zoogdier ringer oplossing. Schil vervolgens het olfactorisch epitheel van het onderliggende kraakbeen van twee turbinaten. Breng het weefsel over in een eenor buisje met 250 microliter ringer.

Bewaar het overblijvende weefsel vervolgens bij vier graden Celsius voor later. Vorm de EOR buis met de olfactorische epitheel twee keer kort gedurende één seconde op gemiddelde snelheid. Deze stap leidt tot de mechanische dissociatie van de NS van het epitheel.

Plaats vervolgens de ringer oplossing met de gedissocieerde orns in de opnamekamer gemonteerd op de microscoop, verwijder de grote stukken weefsel in de suspensie met behulp van een paar fijne pincetten. Laat de ORN 20 minuten rusten voordat u begint met de continue perfusie met ringer oplossing en doorgaat met de opnames in deze procedure, vul de pijp met ringer oplossing. Plaats de pijp in de pijphouder en bevestig de houder aan de hoofdfase van de patch clamp versterker.

Verbind vervolgens de olielijn met de zijpoort van de pijphouder. Laat vervolgens de pijp in de opnamekamer zakken. Regel de hoogte van het olie reservoir om een licht positieve druk op de punt van de pijp te creëren.

Dit kan worden gedaan door het bewegen van celresten weg van of naar de pijp te observeren. Probeer de punt van de pijp niet te besmetten met celresten. Scan vervolgens de opnamekamer op een geïsoleerd ORN, die kan worden herkend aan zijn typische bipolaire morfologie met een vergroting van 20 tot 40 x.

Verplaats vervolgens de opname-elektrode dicht bij het lichaam van de ORN-cel. Zuig voorzichtig op de luchtleiding die op het olie reservoir is aangesloten, zodat het cellichaam in de punt van de pijp komt. Blijf voorzichtig en langzaam zuigen totdat het hele cellichaam in de punt van de zuigpijp wordt getrokken, waarbij de dendriet en cilia worden blootgesteld aan de badoplossing.

Verplaats de zuigpijp van het gedeelte met de neergedaalde orns naar het opnamegedeelte van de kamer. Plaats de zuigpijp voorzichtig voor de drie-vatsbuis voor oplossingsuitwisseling. De zuigpijp moet dicht genoeg bij de opening van de drie-vatsbuis worden geplaatst, zodat de ORN wordt blootgesteld aan gelaagde stroming en aldus mengturbulentie wordt vermeden. Om oplossingsuitwisseling te bereiken, verplaatst u de grens tussen de parallelle stromen van stromende oplossing van de drie-vatsbuis van de oplossingswisselaar over de punt van de zuigpijp om de kwaliteit en betrouwbaarheid van oplossingsuitwisseling te controleren.

De junctie stroom geëvoceerd door het bewegen van de cel tussen oplossingen met verschillende ionische samenstelling kan worden gemeten. De tijdsverloop van de oplossingsuitwisseling is typisch ongeveer 20 milliseconden. Wanneer het olfactorische receptor neuron in een geurstoffen oplossing wordt gestapt, kan hier een door geurstoffen geëvoceerde reactie worden opgewekt.

Een ORN werd gedurende één seconde blootgesteld aan honderd micromolar eugenol zoals aangegeven door de balk boven de opname. In het bovenste paneel werd de receptor stroom gefilterd bij een bandbreedte van nul tot 50 hertz om de receptor stroom weer te geven. Alleen het onderste paneel toont dezelfde opname gefilterd bij de brede bandbreedte van nul tot 5000 hertz om ook de actiepotentialen weer te geven. Hier zijn de dosisreacties van een eugenol responsieve ORN. Eugenol werd gebruikt bij concentraties variërend van 0,3 micromolar tot honderd