Name: Bevestiging van biologische Probes aan Silica optische biosensoren gebruik van silaan agenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Leer hoe u biologische probes koppelt aan silica optische biosensoren met silaanagenten. Deze methode gebruikt covalente binding via NHS-ester-chemie voor robuuste, langdurige sensoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs dankbaar erkent prof. dr. Andrea Armani aan de Universiteit van Zuid-Californië voor ondersteuning tijdens de tijd dat dit protocol is ontwikkeld. De financiering voor de initiële ontwikkeling van dit werk werd geleverd door de National Science Foundation [085281 en 1028440] en de National Institute of Health door New Innovator Award NIH Director&#39;s Program [1DP2OD007391-01]. Aanvullende informatie is beschikbaar op <a href="http://web.missouri.edu/~hunthk/" target="_blank">http://web.missouri.edu/ ~ hunthk /</a> .

1. Achtergrond De biotine aan het oppervlak van deze apparaten via een slechts drie stappen (figuur 1). Eerst schoongemaakt het oppervlak en vullen met hydroxylgroepen door blootstelling van de apparaten een zuurstofplasma of piranha oplossing. Tweede we opdampen de silaan afgesloten met een primaire amine om de hydroxylgroepen door hydrolyse en condensatie reactie bevestigen. Derde hechten wij biotine aan het oppervlak via N-hydroxysuccinimide (NHS) ester chemie. We sturen de geïnteresseerde lezer naar onze eerdere werk voor meer informatie over de ontwikkeling van deze technieken, evenals een uitleg van onze motivatie voor het kiezen van deze technieken. 8 Het succes van deze reacties kunnen worden geëvalueerd door optische microscopie en fluorescentie na de toevoeging van het primaire amine, en na de toevoeging van de biotine. Daar waar optische microscopy kan worden gebruikt om te bepalen of het oppervlak functionalisering protocollen gevolg schade aan de microsfeer oppervlak of verontreiniging wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de kwaliteit en uniformiteit van oppervlaktebedekking van de biotinemolecuul verifiëren alsmede het vermogen van de biotine op het oppervlak binden (strept) avidine. Om het bereik van aminen evalueren op het oppervlak gebruikten we fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) fluorescerende kleurstof, dat reageert met primaire aminen aan stabiele covalente binding te vormen thioureum de microsfeer. Texas fluorescerende kleurstof is geconjugeerd avidine wordt gebruikt om de biotine groepen aan het oppervlak label door het biotine-avidine interactie. In beide gevallen werden kleurstoffen gekozen dat (via een receptor-ligand interacties of covalente binding) samenwerken met de functionele groepen aan het oppervlak. Hier Het silaan koppelingsreagens, die drie vertrekkende groepen en een functionele groep bepaalt de brug betsen de anorganische en organische oppervlak probe molecule. De primaire aminefunctionaliteit reageert kwantitatief met NHS esters vormen stabiele amidebindingen. In dit geval gebruik gemaakt van een biotine probe molecuul waarvan valeriaanzuur zijketen is gemodificeerd met NHS estergroep. Realistisch een probe molecule waaraan een NHS estergroep kunnen worden toegevoegd aan het oppervlak met de volgende protocollen. Bovendien deze protocollen algemeen en kan worden gebruikt om silica inrichting oppervlak te functionaliseren met biotine. De belangrijkste uitdaging met deze protocollen is niet echt in de chemie zelf, maar eerder in de behandeling van de silica microsferen. Houd er rekening mee dat gedurende de protocollen, de microsferen dienen te worden behandeld door grapsing hun stengels licht met scherpe-tip pincet. Dit houdt de pincet uit de buurt van de microsferen zelf, en zorgt voor een gemakkelijk transport tussen de stappen. Veel stappen in het protocol hieronder zijn specifiek ontworpen om dit feit aan te pakkenof. 2. Microsphere Fabrication <ol><li> Bouw de opslag behuizing voor de microsferen. <ol><li> Met behulp van een Exacto mes, sneed een ¼ in dik stuk karton in een 1 cm x 1 in vierkante, deze tape op een normale grootte glasplaatje, en bevestig een 1 in rubriek van Scotch-tape, met de uiteinden aan om een ​​rol te vormen , het karton. </li><li> Hierdoor ontstaat een platform waarop de microsfeer kan worden verhoogd en geïsoleerd van de omgeving en voorkomt schade aan het oppervlak. </li></ol></li><li> Met behulp van schaar, knipte een 3 inch doorsnede van optische vezel uit een spoel van glasvezel. </li><li> Met behulp van een No-Nik fiber-stripper, strip de beschermende polymère bekleding van de laatste 0,5 cm van het einde van het losse stuk van vezels, waardoor alleen de silica kern. Reinig het oppervlak van de resterende polymeer met een Kimwipe bevochtigd met methanol door voorzichtig af te vegen de vezel met de Kimwipe. </li><li> Met behulp van een kale glasvezel hakmes, trim het gestripte uiteinde zo eslechts ongeveer 1 mm, gestripte vezel blijft het einde van de vezel. </li><li> Leg het gestripte uiteinde van de optische vezel in de baan van een CO 2 laser, zorg ervoor dat verticaal uitlijnen van de vezel zodanig dat de gestripte uiteinde naar beneden is gericht. </li><li> Zet de CO 2 laser, en leidt het oppervlak van het gestripte uiteinde van de optische vezel. De laser smelt het gestripte einde van de vezel in een bol met ongeveer 3,5% vermogen van 2 seconden. </li><li> Behulp van een pincet, pakt voorzichtig de stam (de niet-gestripte deel van de optische vezel) van de microsfeer. Bevestig de steel aan de tape rol op de microsfeer behuizing. De glasplaatje kunnen worden opgeslagen zich in een petrischaal. Hierdoor veilige opslag van de microsfeer. </li></ol> 3. Bevolken het oppervlak met hydroxylgroepen <ol><li> Met piranha oplossing: <ol><li> In een 60 ml polypropyleen flacon met een scharnierende kap, bereiden een piranha-oplossing (70:30 volume rokend H <sub&gt; 2 SO 4: H 2 O 2 (30 gew%)) door toevoeging van 5 ml van waterstofperoxide de flacon, gevolgd door 11,6 ml rokend zwavelzuur. LET OP: draag zuurbestendige handschoenen. </li><li> Breng het glasplaatje, die ten minste een microsfeer, aan de injectieflacon. De microsfeer dient in contact met de vloeistof, maar de vloeistof niet raken karton. Pas het volume van de oplossing indien nodig. </li><li> Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon en plaats deze in een ander plastic flacon met DDI H 2 O. Laat de monsters zitten in de oplossing 5 minuten. </li><li> Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon, en plaats deze een oven op 80 ° C gedurende 10 minuten aan het oppervlak drogen. </li></ol></li><li> Met zuurstof plasmabehandeling: <ol><li> Breng het objectglaasje met ten minste een microsfeer de zuurstofplasma kamer. </li><li> Stel de zuurstofdruk tot 200 mTorr, en de kracht tot 120 W. het monster bloot te stellen aan de zuurstof plasma voor 2 miMINUTEN. </li><li> Verwijder de glazen dia uit het plasma kamer. </li></ol></li></ol> 4. Bevestiging van silaan koppelingsmiddelen aan de Surface <ol><li> Plaats het glasplaatje, die tenminste een microsfeer, in een vacuümexsiccator in een zuurkast. </li><li> Ook in de zuurkast, opent u het silaan fles (in dit geval, aminopropyltrimethoxysilaan (APTMS) werd gebruikt), en plaats de geopende fles in de exsiccator. </li><li> Plaats het deksel op de vacuüm exsiccator, en bevestig het uiteinde aan een aspirator of huis vacuüm lijn. </li><li> Zet het huis vacuüm of de waterleiding, en evacueren het vacuüm exsiccator. Wanneer een vacuüm afdichting wordt gevormd tussen het deksel en de basis, de tijdsduur van de reactie. Dit deponeren silaan op het oppervlak als een dunne film. </li><li> Na 15 minuten, schakelt u het vacuüm, en langzaam opent de poort om lucht te laten in de exsiccator. Voor dit hechtmiddel 15 minuten is voldoende om een ​​vorming uniform monolaag op het oppervlak. Voor andere koppelaars, kan de tijd moeten worden aangepast. </li></ol> 5. Bevestigen van biotine aan de Surface <ol><li> Ongeveer een uur voor het bevestigen van de biotine, stelt een 10 mM oplossing van N-hydroxylsuccinimide biotine (NHS-biotine) in watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) in een 60 ml flesje polypropyleen met een scharnierende kap. <ol><li> Als de NHS-biotine is opgeslagen koude, laat het dan op kamertemperatuur evenwicht voordat Massing het uit. </li><li> Sonificeer de oplossing gedurende 1 uur de NHS-biotine poeder volledig oplossen in het oplosmiddel. </li></ol></li><li> Breng het objectglaasje met de microsfeer in een plastic flesje met de microsferen op de bodem, en stengels aan de bovenkant van de flacon. </li><li> Transfer, met behulp van een plastic pipet, een zodanige hoeveelheid van het NHS-biotine-oplossing langs de zijkant van de flacon, achter de glazen dia (dus de oplossing niet raakt de microsfeer als het wordt toegevoegd aan de flacon). Eendd voldoende oplossing van het microbolletje oppervlak. </li><li> Plaats de vaatjes nu met de microsferen en NHS-biotine in DMSO-oplossing op een schommelende incubator (kantelblad) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, de snelheid en hellingshoek bij 5 opm en 5 graden, respectievelijk. </li><li> Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon, voorzichtig en schuif in een ander flesje gevuld met DDI H 2 O. Plaats de flacon op de kantelblad nog 10 minuten bij dezelfde snelheid en de hellingshoek als tevoren. Twee keer Herhaal deze stap met vers water per keer. Dit helpt bij het verwijderen overtollige DMSO van het oppervlak, en verwijdert alle fysisch-geadsorbeerde biotine die niet echt graft aan de oppervlakte. </li><li> Verwijder het glaasje van de flacon en plaatst deze in een oven bij 80 ° C gedurende 10 minuten tot alle waterdruppels van het oppervlak verwijderd. </li></ol> 6. TL-etikettering van amine-beëindigde silica <ol><li> Om de aminegroepen aanwezig na treatm labelENT met APTMS, de voorbereiding van de FITC oplossing in een donkere kamer door het oplossen van 1 mg FITC in 1 ml watervrij DMSO. </li><li> Verder verdund in 6,1 door toevoeging van 50 pi van de FITC oplossing 1 ml 0,1 M natrium bicarbonaat buffer. </li><li> Plaats de oplossing in een 60 ml polypropyleen flacon met een scharnierende kap en voorzichtig de amine-beëindigde microsferen, weer gehuisvest op het glasplaatje, schuift u in de flacon. </li><li> Plaats de flacon in een ijsbad en laat het monster reageren met de FITC oplossing ten minste 4 uur in het donker. </li><li> Verwijder overtollig fluorofoor door middel van twee, tien minuten spoelingen van de microsferen in natriumcarbonaat buffer. Net als voorheen, vul een 60 ml polypropyleen flacon met een scharnierend deksel met de buffer, en schuif het glaasje in de oplossing, zorg dat de oplossing alleen de microsferen, en niet de kartonnen deksels. Bedek de flacon met aluminiumfolie en plaats de flacon op een tilt-tray vastgesteld op 5 graden en 5 toeren per minuut, zoals voorheen. </li><li> Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon, voorzichtig en schuif in een ander flesje gevuld met DDI H 2 O en bedekt met aluminiumfolie. Plaats de flacon op de kantelblad nog 10 minuten bij dezelfde snelheid en de hellingshoek als tevoren. Twee keer Herhaal deze stap met vers water per keer. Dit helpt bij het verwijderen overtollige kleurstof van het oppervlak. </li><li> Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon, en droog in een oven op 80 C gedurende 10 minuten voor de beeldvorming. </li></ol> 7. TL-etikettering van biotine-beëindigde silica <ol><li> Bereid een 10 pg / ml oplossing van Texas-rood avidine in fosfaat gebufferde zoutoplossing. </li><li> Voeg de oplossing 60 ml flesje polypropyleen met een scharnierend deksel, en schuif het objectglaasje met een biotine-getermineerde microsfeer in de oplossing, zodat de microsfeer net onder de oplossing. </li><li> 30 minuten reageren bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Verwijder overtollig fluorofoor door middel van twee, tien minuten spoels van de microsferen in PBS buffer. <ol><li> Net als voorheen, vul een 60 ml polypropyleen flacon met een scharnierend deksel met de buffer, en schuif het glaasje in de oplossing, zorg dat de oplossing alleen de microsferen, en niet de kartonnen deksels. </li><li> Bedek de flacon met aluminiumfolie en plaats de flacon op een tilt-tray vastgesteld op 5 graden en 5 toeren per minuut, zoals voorheen. </li></ol></li><li> Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon, voorzichtig en schuif in een ander flesje gevuld met DDI H 2 O en bedekt met aluminiumfolie. Plaats de flacon op de kantelblad nog 10 minuten bij dezelfde snelheid en de hellingshoek als tevoren. Twee keer Herhaal deze stap met vers water per keer. Dit helpt bij het verwijderen overtollige kleurstof van het oppervlak. </li><li> Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon en droog in de oven, ingesteld op 80 ° C gedurende 10 minuten voor de beeldvorming. </li></ol> 8. Representatieve resultaten Correct gefunctionaliseerde microsfeers kunnen worden geïdentificeerd door middel van optische en fluorescentie microscopie. Als het oppervlak functionalisering is juist, zal dit resulteren in een gelijkmatig dekkend van biotine moleculen op het oppervlak en het oppervlak te defect en verontreinigingen vrij blijft nadat functionalisering om hun hoge gevoeligheid te behouden tijdens detectie experimenten. Optische microscopie kan worden gebruikt om deze probe, terwijl fluorescentiemicroscopie de kwaliteit en uniformiteit van dekvlak sonde. In figuur 2 wordt tonen voorbeelden van gefunctionaliseerde kunnen microsferen. Deze beelden tonen dat er geen beschadiging van het oppervlak of besmetting door functionalisering (Fig. 2a) en dat de microsferen een uniforme, uniforme bedekking van beide aminogroepen (Fig. 2b) of biotine groepen (Fig. 2c) waarvan het oppervlak . Indien de microsferen niet correct gefunctionaliseerd de optische microsfeer beelden wizal vertonen besmetting van het oppervlak, samenklontering of niet-uniforme dekking, en duidelijke gebreken in het oppervlak, zoals het oppervlak scheuren (figuur 3). Hier zien we een bekend voorbeeld van besmetting van het oppervlak, als gevolg van samenklontering van de reagentia aan de oppervlakte. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig1.jpg" /> Figuur 1. Drie stappen reactieschema voor bevestiging probe moleculen op het oppervlak van silica microsferen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3866/3866fig1large.jpg" target="_blank">klik hier grotere figuur zien</a> . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig2.jpg" /> Figuur 2. Silica microsferen. a) Optische microfoto van silica microsfeer gevuld met hydroxylgroepen via blootstelling aan zuurstofplasma b) TL microfoto van silica microsfeer gevuld met primaire aminen en voorzien FITC kleurstof c) TL microfoto van silica microsphere bevolkt met biotine en gelabeld met Texas Red-avidine conjugaat. Overgenomen met toestemming van Soteropulos, CE, Hunt, HK &amp; Armani, AM Bepaling van bindingskinetiek gebruik van Whispering Gallery-modus microcavities. Appl. Phys. Lett. 99, 103.703 tot 103.703 (2011). Copyright 2011, American Institute of Physics. 17 <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig3.jpg" /> Figuur 3. Optische microscoop foto van onjuist gefunctionaliseerde bol. Hier ziet u stof op het rechts boven het oppervlak, maar ook als verontreiniging uitbreiding van het oppervlak. Bovendien is de rechterzijde van de optische microsfeer toont een graszode op het oppervlak.

<ol><li>Datar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cantilever+Sensors%3A+Nanomechanical+Tools+for+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Cantilever Sensors: Nanomechanical Tools for Diagnostics.</a> MRS Bull. 34, 449-454 (2009).</li>
<li>Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biological+and+chemical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Label-free biological and chemical sensors.</a> Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).</li>
<li>Sundberg, F., Karlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+characterization+of+immune+responses+using+label-free+biacore+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and characterization of immune responses using label-free biacore immunoassays.</a> Immunology. 120, 46-47 (2007).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , 2nd edn, Academic Press. (2008).</li>
<li>Bernards, M. T., Cheng, G., Zhang, Z., Chen, S. F., Jiang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonfouling+polymer+brushes+via+surface-initiated%2C+two-component+atom+transfer+radical+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Nonfouling polymer brushes via surface-initiated, two-component atom transfer radical polymerization.</a> Macromolecules. 41, 4216-4219 (2008).</li>
<li>Fan, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+optical+biosensors+for+unlabeled+targets%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Sensitive optical biosensors for unlabeled targets: A review.</a> Anal. Chim. Acta. 620, 8-26 (2008).</li>
<li>Qavi, A. J., Washburn, A. L., Byeon, J. Y., Bailey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+technologies+for+quantitative+multiparameter+biological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free technologies for quantitative multiparameter biological analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394, 121-135 (2009).</li>
<li>Hunt, H. K., Soteropulos, C., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+Strategies+for+Microtoroidal+Optical+Resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation Strategies for Microtoroidal Optical Resonators.</a> Sensors. 10, 9317-9336 (2010).</li>
<li>Kalia, J., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Advances in Bioconjugation.</a> Curr. Org. Chem. 14, 138-147 (2010).</li>
<li>Matsko, A. B., Savchenkov, A. A., Strekalov, D., Ilchenko, V. S., Maleki, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Applications+of+Whispering-Gallery+Mode+Resonators+in+Photonics+and+Nonlinear+Optics%5BTitle%5D)+AND+%22IPN+Progress+Report%22%5BJournal%5D)">Review of Applications of Whispering-Gallery Mode Resonators in Photonics and Nonlinear Optics.</a> IPN Progress Report. , 42-162 (2005).</li>
<li>Armani, A. M., Kulkarni, R. P., Fraser, S. E., Flagan, R. C., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free%2C+single-molecule+detection+with+optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free, single-molecule detection with optical microcavities.</a> Science. 317, 783-787 (2007).</li>
<li>Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+single+nanoparticle+detection+and+sizing+by+mode+splitting+in+an+ultrahigh-Q+microresonator%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photon%22%5BJournal%5D)">On-chip single nanoparticle detection and sizing by mode splitting in an ultrahigh-Q microresonator.</a> Nat. Photon. 4, 122-122 (2010).</li>
<li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whispering-gallery-mode+biosensing%3A+label-free+detection+down+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering+gallery+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single virus detection from the reactive shift of a whispering gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20701-20704 (2008).</li>
<li>Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+microcavity+optical+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Recycling microcavity optical biosensors.</a> Opt. Lett. 36, 1092-1094 (2011).</li>
<li>Soteropulos, C. E., Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+binding+kinetics+using+whispering+gallery+mode+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Determination of binding kinetics using whispering gallery mode microcavities.</a> Appl. Phys. Lett. 99, 103703-103703 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Zoals beschreven in de protocollen we een behuizing platform waarop de silica microsferen transporteren naar hun stelen in de functionalisering proces. Deze behuizing platform is gemaakt als een oplossing aan het oppervlak vervuiling en beschadiging dat het gevolg is van het microbolletje in aanraking met de wanden van de verschillende houders gebruikt in de functionalisering proces. We realiseerden ons dat het grootste probleem is ontstaan ​​uit voortdurend bevestigen en verwijderen individuele microsferen naar verschi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Visser </td><td> 67-56-1 </td><td> ACS kwaliteit </td></tr><tr><td> Zwavelzuur </td><td> Visser </td><td> 8014-95-7 </td><td> Fuming </td></tr><tr><td> Waterstofperoxide </td><td> Visser </td><td> 7722-84-1 </td><td> 30 gew% </td></tr><tr><td> Aminopropyltrimethoxysilaan </td><td> Visser </td><td> 13822-56-5 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-biotine EZ linker </td><td> Doorboren </td><td> 20217 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td> Visser </td><td> 67-68-5 </td><td> Watervrij </td></tr><tr><td> Fluoresceïne-isothiocyanaat </td><td> Doorboren </td><td> 46425 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing </td><td> Visser </td><td> 7647-14-5 </td><td> Poeder concentraat </td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaatbuffer </td><td> Visser </td><td> NC0099321 </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red - Avidine conjugaat </td><td> Doorboren </td><td> A820 </td><td></td></tr><tr><td> Optical Fiber </td><td> Newport </td><td> F-SC </td><td></td></tr><tr><td> Fiber Stripper </td><td> Fiber Instrument Sales </td><td> NN-175 </td><td> No-Nik 175 um stripper </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Visser </td><td> 06666A </td><td></td></tr><tr><td> Bare Fiber Cleaver </td><td> Ilsintech </td><td> Cl-03A </td><td></td></tr><tr><td> Glas Microscope Slides </td><td> Visser </td><td> 12 550B </td><td></td></tr><tr><td> Polypropyleen flacons </td><td> Visser </td><td> 03 tot 341-75A </td><td> 60 ml, scharnierend cap </td></tr><tr><td> Incuberen Rocker </td><td&gt; VWR </td><td> 12620-910 </td><td></td></tr><tr><td> Vacuümexsiccator </td><td> Visser </td><td> 08-594-15B </td><td></td></tr></tbody></table>

bevestiging van biologische probes aan silica optische biosensoren gebruik van silaan agenten

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Om de interface met biologische omgevingen, biosensor platforms, zoals het populaire Biacore systeem (op basis van de Surface Plasmon Resonance (SPR) techniek), gebruik maken van verschillende oppervlakte modificatie technieken, dat kan, bijvoorbeeld, te voorkomen dat oppervlaktewater vervuilen, moet afstemmen op deze hydrofobiciteit / hydrofiliciteit van het oppervlak, aan te passen aan een verscheidenheid van elektronische leeromgevingen, en meest, specificiteit leiden naar een doel van belang. 1-5 Deze technieken de functionaliteit van de anders zeer gevoelige biosensoren uit te breiden tot real-world applicaties in complexe omgevingen, zoals als bloed, urine en afvalwater analyse. 2,6-7 Hoewel de commerciële biosensing platforms, zoals Biacore, hebben goed begrepen, standaard technieken voor het uitvoeren van dergelijke oppervlakmodificaties, zijn deze technieken niet vertaald in een gestandaardiseerde vorm aan andere label- gratis biosensing platforms, zoals Whispering Gallery Mode (WGM) optische resonatoren. 8-9 &lt;<html> / P&gt; WGM optische resonatoren een veelbelovende technologie voor het uitvoeren label zonder detectie van diverse soorten aan ultra-lage concentraties 6,10-12 De hoge gevoeligheid van deze platforms is het gevolg van zijn unieke geometrische optica. WGM optische resonatoren beperken circulerende . licht specifieke geïntegreerde resonantiefrequentie 13 Zoals de SPR platforms, wordt de optische veld niet volledig beperkt tot de sensorinrichting, maar evanesces, deze &quot;vluchtige tail&quot; kan dan samenwerken met species in de omgeving. Deze interactie veroorzaakt de effectieve brekingsindex van het optische veld veranderen, waardoor een lichte maar detecteerbare verschuiven in de resonantiefrequentie van het apparaat. Omdat het optische gebied circuleert, kan interageren vaak met de omgeving, waardoor een inherente versterking van het signaal, en zeer hoge gevoeligheid voor kleine veranderingen in de omgeving. 2,14-15 tent &quot;&gt; Voor een gerichte detectie in complexe omgevingen voeren deze platforms zijn gekoppeld met een probe molecuul (meestal een helft van een bindend paar, bijvoorbeeld antilichamen / antigenen) door oppervlaktemodificatie. 2 Hoewel WGM optische resonator kan worden vervaardigd in verschillende geometrieën van verschillende materialen systemen, silica microsfeer is het meest gebruikelijk. Deze microsferen algemeen vervaardigd op het uiteinde van een optische vezel, die een &quot;stam&quot; waarbij de microsferen kan worden verwerkt in functionalisering en detectie experimenten geeft. Silica oppervlakchemie kan worden toegepast probe moleculen hechten aan de oppervlakken, maar traditionele technieken gegenereerd vlakke substraten vaak niet voldoende voor de drie-dimensionale structuren als wijzigingen in het oppervlak van de microsferen (stof, vuil, oppervlakte defecten en ongelijkmatige coatings) kan ernstige, negatieve gevolgen voor hun detectie mogelijkheden. Hier demonstreren we een gemakkelijke benaderingvoor het oppervlak functionalisering van silica microsfeer WGM optische resonatoren met silaan koppelingsmiddelen de anorganische oppervlak en de biologische omgeving overbruggen door het aanbrengen van biotine aan het silica-oppervlak. 8,16 Hoewel wij silica microsfeer WGM resonatoren het sensorsysteem in dit verslag de protocollen algemeen en kan worden gebruikt om het oppervlak van een silica inrichting te functionaliseren met biotine.

Biosensoren-interface met complexe, biologische omgevingen en het uitvoeren van gerichte opsporing door het combineren van zeer gevoelige sensoren met zeer specifieke probes verbonden aan de sensor via oppervlakte modificatie. Hier tonen we het oppervlak functionalisering van silica optische sensoren met biotine met silaan koppelingsmiddelen aan de sensor en de biologische omgeving overbruggen.

Bevestiging van biologische Probes aan Silica optische biosensoren gebruik van silaan agenten

Om een koppeling met biologische omgevingen te realiseren, maken biosensorplatformen, zoals het veelgebruikte Biacore-systeem (gebaseerd op Surface Plasmon Resonance (SPR)...

Het algemene doel van deze procedure is om het oppervlak van de optische resonator van de silico-microsfeer te coaten met biotine via een covalent hechtingsproces, zonder de gevoeligheid van het apparaat aan te tasten. Dit wordt bereikt via een proces van drie stappen, beginnend met hydroxylering met behulp van zuurstofplasma of piha-ets hydroxylering, gevolgd door emanatie via dampdepositie van een slan-koppelingsmiddel. Vervolgens wordt de biotine-koppeling uitgevoerd met behulp van NHS-esterchemie om de valeriaanzijketen van biotine te verbinden met de primaire aminen op het oppervlak van de resonator.Uiteindelijk creëert deze methode een optische biosensor die zowel zeer gevoelig als specifiek is voor een molecuul van belang, en die verder kan worden aangepast via fluorescente markering van een gemiddeld afgebroken silica, evenals via de Ava tin biotin complexatiemethode om een biosensorplatform te creëren voor een breed scala aan potentiële doelwitmoleculen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor oppervlaktefunctionalisering, zoals fysieke adsorptie, is dat ons sondemolecuul covalent is gebonden, wat onze sensoren robuuster en betrouwbaarder maakt. Dit betekent dat ze gedurende langere perioden kunnen worden bewaard met behoud van hun bruikbaarheid en dat ze na functionalisering zeer gevoelig blijven.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de complexiteit bij het hanteren van de micro-omvangige apparaten tijdens het functionalisatieproces. Een gebrekkige hanteertechniek is de snelste manier om de optische prestaties van de sensor te verslechteren en contaminatie op het sensoroppervlak te veroorzaken. Knip met een schaar een stuk karton van een kwart inch dik in een vierkant van één inch bij één inch.Plak dit op een standaard glazen objectglas en bevestig een stukje opgerolde plakband van ongeveer 2,5 cm op het karton. Hiermee wordt een platform gecreëerd waarop de microsfeer verhoogd en geïsoleerd van de omgeving kan worden geplaatst, wat beschadiging van het oppervlak door de schaar voorkomt. Knip een stuk optische vezel van ongeveer 7,5 cm van de spoel.Gebruik vervolgens een krasvrije vezelstripper om de beschermende polymeercoating van de laatste 1,27 cm van het uiteinde van het afgeknipte vezelstuk te verwijderen, zodat alleen de silicakerne overblijft. Maak het oppervlak van eventuele resterende polymeren schoon met een Kimwipe bevochtigd met methanol door de vezel voorzichtig af te vegen. Trim het gestripte uiteinde met een bare fiber cleaver, zodat er slechts ongeveer één millimeter gestripte vezel aan het uiteinde overblijft. Plaats het gestripte uiteinde van de optische vezel in het pad van een kooldioxide-laser en let daarbij op de verticale positie. Lijn de vezel zodanig uit dat het gestripte uiteinde naar beneden is gericht.Zet de kooldioxidelaser aan en richt deze op het oppervlak van het gestripte uiteinde van de optische vezel. De laser zal het gestripte uiteinde van de vezel in twee seconden smelten tot een bolletje met een vermogen van ongeveer 3,5%. Pak de steel van de microsfeer voorzichtig vast met een pincet.Bevestig de steel aan de tape-rol op de behuizing van de microsfeer. Het glaskaartje kan in een Petrischaal worden bewaard, wat een veilige opslag van de microsfeer in een polypropylene vial van 60 milliliter met een scharnierdeksel mogelijk maakt. Bereid een piranha-oplossing voor door drie milliliter waterstofperoxide aan de vial toe te voegen, gevolgd door zeven milliliter rookende zwavelzuur.Breng het glazen objectglas met ten minste één microsfeer over naar het vial. De microsfeer moet in contact zijn met de vloeistof, maar de vloeistof mag het karton niet raken. Pas indien nodig het volume van de oplossing aan.Nadat de sferen 15 minuten in de piranha-oplossing zijn ondergedompeld, wordt het objectglas voorzichtig uit het vial verwijderd en geplaatst in een ander plastic vial met gedeïoniseerd gedestilleerd water. Plaats het vial gedurende vijf minuten op het kantelplateau onder een hoek van vijf graden met een kantelsnelheid van vijf RPM. Verwijder het objectglas voorzichtig uit het vial en plaats het 10 minuten in een oven op 80 °C.Om het oppervlak te drogen, plaatst u het glazen objectglas met ten minste één microsfeer in een vacuüm-exsiccator. Open de fles met koppelingsmiddel, zoals A-P-T-M-S, en plaats de open fles in de exsiccator. Plaats het deksel op de vacuüm-exsiccator en sluit de uitlaatpoort aan op een aspirator of de vacuümleiding van het laboratorium.Zet de vacuümpomp of de waterlijn aan en evacueer de vacuümdesiccator. Zodra er een vacuümafdichting is gevormd tussen het deksel en de basis, start u de timing van de reactie. Dit zal het silaan-koppelingsmiddel als een dunne film op het oppervlak afzetten.Schakel na 15 minuten het vacuüm uit en open het poortventiel langzaam om lucht in de desiccator te laten. Voor dit koppelingsmiddel is 15 minuten voldoende om een uniforme monolaag op het oppervlak te vormen; voor andere koppelingsmiddelen kan de tijd mogelijk worden aangepast. Bereid ongeveer een uur voor het bevestigen van de biotine een 10 millimolaire oplossing van N-hydroxysuccinimide-biotine in anhydroos dimethylsulfoxide voor in een polypropyleenflesje van 60 milliliter met een scharnikdop.Het meest uitdagende deel van dit protocol is de hantering van de microsferen en het voorkomen van contaminatie van het oppervlak van de sferen om succes te garanderen. Naast het maken van de objectglasopstelling om de sferen vast te houden, wordt de biotine-oplossing vooraf gesoneerd om deeltjes die op het oppervlak achterblijven te verbreken. Soneer de oplossing gedurende één uur om het NHS-biotinepoeder volledig in het oplosmiddel op te lossen.Plaats het glazen objectglas met de microsfeer in een ander plastic buisje, waarbij de microsfeer zich aan de bodem en de steel aan de bovenkant van het buisje bevindt. Gebruik een plastic pipet om een passende hoeveelheid van de NHS-biotine-oplossing langs de wand van het buisje achter het objectglas over te brengen, zodat de oplossing de microsfeer niet raakt tijdens het toevoegen aan het buisje. Voeg voldoende oplossing toe om het oppervlak van de microsfeer te bedekken.Plaats het vial dat nu de MICROSPHERE en de NHS-biotine en DMSO-oplossing bevat op een schudincubator voor 30 minuten bij kamertemperatuur, met een snelheid van vijf RPM en een kantelhoek van vijf graden. Verwijder voorzichtig het glasplaatje uit het vial en schuif het voorzichtig in een ander vial gevuld met gedeïoniseerd gedestilleerd water. Plaats het vial gedurende nog eens 10 minuten op de kanteltray bij dezelfde snelheid en kantelhoek.Herhaal deze stap, zoals voorheen, tweemaal met telkens vers water. Dit helpt om overtollig DMSO van het oppervlak te verwijderen en verwijdert eventuele fysisch geabsorbeerde biotine die niet daadwerkelijk aan het oppervlak is gegraft. Haal het glazen dekglas uit het buisje en plaats het gedurende 10 minuten in een oven op 80 °C, of totdat alle waterdruppels van het oppervlak zijn verdwenen.Ga verder met het uitvoeren van de fluorescente labeling van een amine-getermineerd silica, zoals besproken in het protocol voor fluorescentie. Label het biotine-getermineerde silica. Bereid eerst een oplossing van 10 µg/mL Texas Red Aden in gefosfateerde gebufferde zoutoplossing.Voeg de oplossing toe aan een polypropyleen vial van 60 milliliter met een scharnikdop en schuif het glasplaatje met een biotine-getermineerde microsfeer voorzichtig in de oplossing, zodat de microsfeer net door de oplossing wordt bedekt. Wikkel vervolgens de vial in folie voor een reactietijd van 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Overtollig fluoro four wordt verwijderd door de microsfeer tweemaal gedurende 10 minuten te spoelen in PBS-buffer.Vul, zoals voorheen, een polypropyleen vial van 60 milliliter met de buffer en plaats de glazen slide voorzichtig in de oplossing. Let hierbij op dat de oplossing enkel de microsfeer bedekt en niet de kartonnen behuizing.Bedek het vial met aluminiumfolie en plaats het vial op een kantelplateau dat is ingesteld op een hoek van vijf graden en vijf RPM gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig het glazen objectglas uit het vial en schuif het voorzichtig in een ander vial gevuld met gedeïoniseerd gedestilleerd water en bedekt met aluminiumfolie. Plaats het vial nogmaals 10 minuten op het kantelplateau bij dezelfde snelheid en kantelhoek.Herhaal deze stap twee keer, elke keer met vers water. Dit helpt om overtollige kleurstof van het oppervlak te verwijderen. Verwijder als laatste stap over het algemeen het glazen dekglas uit het flesje en droog dit 10 minuten in een oven die is ingesteld op 80 °C voordat u overgaat tot beeldvorming.Indien de oppervlaktefunctionalisering correct is uitgevoerd, moet dit resulteren in een uniform dichte bedekking van biotinemoleculen op het oppervlak, zoals aangetoond via fluorescentiemicroscopie. Daarnaast moet het oppervlak na functionalisering vrij blijven van defecten en contaminanten om de hoge gevoeligheid te behouden. Tijdens detectie-experimenten, zoals gevisualiseerd met optische microscopie, zijn hier voorbeelden te zien van correct gefunctionaliseerde microsferen.Deze afbeeldingen laten zien dat er geen oppervlakschade of contaminatie is ontstaan door de functionalisering, en dat de microsferen een uniforme, consistente bedekking vertonen van respectievelijk aminegroepen of biotinegroepen. Als de microsferen niet correct zijn gefunctionaliseerd, zullen de optische microsfeer-afbeeldingen oppervlakkige contaminatie, klonteren of een niet-uniforme bedekking vertonen, evenals duidelijke defecten in het oppervlak; de hier getoonde oppervlakescheuren zijn een veelvoorkomend voorbeeld van oppervlakkige contaminatie als gevolg van het samenklonteren van reagentia op het oppervlak. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het oppervlak van elke silica optische resonator met biotine kunt functionaliseren.Aangezien dit een algemene methode is voor silica-apparaten, zou u deze breed moeten kunnen toepassen op veel verschillende soorten silica-sensorplatforms. Door de verdere ontwikkeling van deze techniek zullen onderzoekers in het veld van de biofotonica gemakkelijker nieuwe methoden en nieuwe combinaties van probesensoren kunnen verkennen voor het creëren van zeer gevoelige en specifieke biosensorplatforms.

attaching-biological-probes-to-silica-optical-biosensors-using-silane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit artikel beschrijven we hoe we krijgen FRET sporen van individuele DNA-moleculen geïmmobiliseerd op een oppervlak met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop.

Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

We beschrijven een methode voor de waarneming real-time replicatie van individuele DNA-moleculen gemedieerd door eiwitten van de bacteriofaag replicatie systeem.

Directe observatie van Enzymen repliceren DNA met behulp van een Single-molecule DNA Stretching Assay

A-label-free optische biosensor voor de snelle detectie van bacteriën wordt geïntroduceerd. De biosensor is gebaseerd op een nanogestructureerde poreuze Si, die is ontworpen om direct vastleggen van de doelbacteriën cellen op het oppervlak. Wij gebruiken monoklonale antilichamen geïmmobiliseerd op de poreuze transducer als capture probes. Onze studies tonen de toepasselijkheid van deze biosensoren voor de detectie van lage bacteriële concentraties binnen enkele minuten zonder voorafgaande...

Optische detectie van E. coli Bacteriën door Mesoporous Silicon biosensoren

Er wordt een protocol gepresenteerd om een grote verscheidenheid aan enkele moleculen covalent aan een AFM-tip te koppelen. Procedures en voorbeelden om de adhesiekracht en vrije energie van deze moleculen op vaste ondergronden en bio-interfaces te bepalen, worden gegeven.

Onderzoekt Single Molecule Hechting van Atomic Force Spectroscopie

We beschrijven de belangrijkste stappen voor biosensing door gebruik te maken van polysilicon nanowire field-effect transistors, inclusief de voorbereiding van het apparaat en de immobilisatie en bevestiging van een DNA moleculaire sonde op het nanowire oppervlak, evenals de voorwaarden voor DNA sensing.

Bereiding van silicium Nanowire veldeffecttransistor voor chemische en biosensoren toepassingen

Hier presenteren we een protocol om de kracht van de interacties tussen een goed gedefinieerde anorganische oppervlak en ofwel peptiden of aminozuren door single-molecule force spectroscopy metingen te meten met behulp van een atomic force microscope (AFM). De resultaten van de meting informatie is belangrijk voor een beter begrip van het peptide-anorganisch materiaal interfase.

Inzicht in de interacties van aminozuren en peptiden met anorganische materialen met behulp van enkel-molecuul Force Spectroscopie

Hier presenteren we een protocol om te synthetiseren van bioinspired silica materialen en immobiliseren enzymen daarin. Siliciumdioxide wordt gesynthetiseerd door natrium-silicaat en een amine 'levensmiddelenadditief', die met een gecontroleerde snelheid neutraliseren te combineren. Materiaaleigenschappen en functie kunnen worden gewijzigd door in situ enzym immobilisatie of post synthetische zure elutie van ingekapselde additieven.

Voorbereiding van functionele Silica met behulp van een methode Bioinspired

Dit protocol beschrijft de covalente immobilisatie van eiwitten met een heterobifunctional silane koppelmiddel op siliciumoxide oppervlakken ontworpen voor de atomaire kracht microscopie gebaseerd enkel molecuul kracht spectroscopie die wordt geïllustreerd door de interactie van RrgA (pilus-1 tip antistoffen van S. pneumoniae) met fibronectine.

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

Gepresenteerd hier is een protocol voor het uitvoeren van single-molecuul Förster resonantie energie overdracht te bestuderen HJ resolutie. Voor het bepalen van de dissociatieconstanten wordt tweekleurige alternerende excitatie gebruikt. Single-Color timelapse smFRET wordt vervolgens toegepast in real-time decolleté assays om de dwelltijd verdeling vóór HJ resolutie te verkrijgen.

Single-molecuul Förster Resonance Energy Transfer methoden voor real-time onderzoek van de Holliday Junction-resolutie door GEN1

Covalente gehechtheid van sondemoleculen aan atoomkrachtmicroscopie (AFM) cantilever tips is een essentiële techniek voor het onderzoek van hun fysieke eigenschappen. Dit stelt ons in staat om de rekkracht, desorptiekracht en lengte van polymeren te bepalen via AFM-gebaseerde single molecule force spectroscopie met een hoge reproduceerbaarheid.

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Dit werk heeft tot doel de ontwikkeling te vergemakkelijken van gestandaardiseerde technieken voor het impregneren of enten van geamineerde verbindingen op silicasubstraten, die vaak breed worden beschreven in de literatuur. Specifieke hoeveelheden oplosmiddel, substraat, aminen en de waarden van andere belangrijke experimentele parameters zullen in detail worden besproken.

Een synthetische methodologie voor het bereiden van geïmpregneerde en geënte silicacomposieten op basis van amine voor koolstofafvang

Leer hoe u biologische probes koppelt aan silica optische biosensoren met silaanagenten. Deze methode gebruikt covalente binding via NHS-ester-chemie voor robuuste, langdurige sensoren.

Bevestiging van biologische Probes aan Silica optische biosensoren gebruik van silaan agenten

Meer video's verkennen