Name: Bevestiging van biologische Probes aan Silica optische biosensoren gebruik van silaan agenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Leer hoe u biologische probes koppelt aan silica optische biosensoren met silaanagenten. Deze methode gebruikt covalente binding via NHS-ester-chemie voor robuuste, langdurige sensoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs dankbaar erkent prof. dr. Andrea Armani aan de Universiteit van Zuid-Californië voor ondersteuning tijdens de tijd dat dit protocol is ontwikkeld. De financiering voor de initiële ontwikkeling van dit werk werd geleverd door de National Science Foundation [085281 en 1028440] en de National Institute of Health door New Innovator Award NIH Director&#39;s Program [1DP2OD007391-01]. Aanvullende informatie is beschikbaar op <a href="http://web.missouri.edu/~hunthk/" target="_blank">http://web.missouri.edu/ ~ hunthk /</a> .

1. Achtergrond De biotine aan het oppervlak van deze apparaten via een slechts drie stappen (figuur 1). Eerst schoongemaakt het oppervlak en vullen met hydroxylgroepen door blootstelling van de apparaten een zuurstofplasma of piranha oplossing. Tweede we opdampen de silaan afgesloten met een primaire amine om de hydroxylgroepen door hydrolyse en condensatie reactie bevestigen. Derde hechten wij biotine aan het oppervlak via N-hydroxysuccinimide (NHS) ester chemie. We sturen de geïnteresseerde lezer naar onze eerdere werk voor meer informatie over de ontwikkeling van deze technieken, evenals een uitleg van onze motivatie voor het kiezen van deze technieken. 8 Het succes van deze reacties kunnen worden geëvalueerd door optische microscopie en fluorescentie na de toevoeging van het primaire amine, en na de toevoeging van de biotine. Daar waar optische microscopy kan worden gebruikt om te bepalen of het oppervlak functionalisering protocollen gevolg schade aan de microsfeer oppervlak of verontreiniging wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de kwaliteit en uniformiteit van oppervlaktebedekking van de biotinemolecuul verifiëren alsmede het vermogen van de biotine op het oppervlak binden (strept) avidine. Om het bereik van aminen evalueren op het oppervlak gebruikten we fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) fluorescerende kleurstof, dat reageert met primaire aminen aan stabiele covalente binding te vormen thioureum de microsfeer. Texas fluorescerende kleurstof is geconjugeerd avidine wordt gebruikt om de biotine groepen aan het oppervlak label door het biotine-avidine interactie. In beide gevallen werden kleurstoffen gekozen dat (via een receptor-ligand interacties of covalente binding) samenwerken met de functionele groepen aan het oppervlak. Hier Het silaan koppelingsreagens, die drie vertrekkende groepen en een functionele groep bepaalt de brug betsen de anorganische en organische oppervlak probe molecule. De primaire aminefunctionaliteit reageert kwantitatief met NHS esters vormen stabiele amidebindingen. In dit geval gebruik gemaakt van een biotine probe molecuul waarvan valeriaanzuur zijketen is gemodificeerd met NHS estergroep. Realistisch een probe molecule waaraan een NHS estergroep kunnen worden toegevoegd aan het oppervlak met de volgende protocollen. Bovendien deze protocollen algemeen en kan worden gebruikt om silica inrichting oppervlak te functionaliseren met biotine. De belangrijkste uitdaging met deze protocollen is niet echt in de chemie zelf, maar eerder in de behandeling van de silica microsferen. Houd er rekening mee dat gedurende de protocollen, de microsferen dienen te worden behandeld door grapsing hun stengels licht met scherpe-tip pincet. Dit houdt de pincet uit de buurt van de microsferen zelf, en zorgt voor een gemakkelijk transport tussen de stappen. Veel stappen in het protocol hieronder zijn specifiek ontworpen om dit feit aan te pakkenof. 2. Microsphere Fabrication <ol><li> Bouw de opslag behuizing voor de microsferen. <ol><li> Met behulp van een Exacto mes, sneed een ¼ in dik stuk karton in een 1 cm x 1 in vierkante, deze tape op een normale grootte glasplaatje, en bevestig een 1 in rubriek van Scotch-tape, met de uiteinden aan om een ​​rol te vormen , het karton. </li><li> Hierdoor ontstaat een platform waarop de microsfeer kan worden verhoogd en geïsoleerd van de omgeving en voorkomt schade aan het oppervlak. </li></ol></li><li> Met behulp van schaar, knipte een 3 inch doorsnede van optische vezel uit een spoel van glasvezel. </li><li> Met behulp van een No-Nik fiber-stripper, strip de beschermende polymère bekleding van de laatste 0,5 cm van het einde van het losse stuk van vezels, waardoor alleen de silica kern. Reinig het oppervlak van de resterende polymeer met een Kimwipe bevochtigd met methanol door voorzichtig af te vegen de vezel met de Kimwipe. </li><li> Met behulp van een kale glasvezel hakmes, trim het gestripte uiteinde zo eslechts ongeveer 1 mm, gestripte vezel blijft het einde van de vezel. </li><li> Leg het gestripte uiteinde van de optische vezel in de baan van een CO 2 laser, zorg ervoor dat verticaal uitlijnen van de vezel zodanig dat de gestripte uiteinde naar beneden is gericht. </li><li> Zet de CO 2 laser, en leidt het oppervlak van het gestripte uiteinde van de optische vezel. De laser smelt het gestripte einde van de vezel in een bol met ongeveer 3,5% vermogen van 2 seconden. </li><li> Behulp van een pincet, pakt voorzichtig de stam (de niet-gestripte deel van de optische vezel) van de microsfeer. Bevestig de steel aan de tape rol op de microsfeer behuizing. De glasplaatje kunnen worden opgeslagen zich in een petrischaal. Hierdoor veilige opslag van de microsfeer. </li></ol> 3. Bevolken het oppervlak met hydroxylgroepen <ol><li> Met piranha oplossing: <ol><li> In een 60 ml polypropyleen flacon met een scharnierende kap, bereiden een piranha-oplossing (70:30 volume rokend H <sub&gt; 2 SO 4: H 2 O 2 (30 gew%)) door toevoeging van 5 ml van waterstofperoxide de flacon, gevolgd door 11,6 ml rokend zwavelzuur. LET OP: draag zuurbestendige handschoenen. </li><li> Breng het glasplaatje, die ten minste een microsfeer, aan de injectieflacon. De microsfeer dient in contact met de vloeistof, maar de vloeistof niet raken karton. Pas het volume van de oplossing indien nodig. </li><li> Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon en plaats deze in een ander plastic flacon met DDI H 2 O. Laat de monsters zitten in de oplossing 5 minuten. </li><li> Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon, en plaats deze een oven op 80 ° C gedurende 10 minuten aan het oppervlak drogen. </li></ol></li><li> Met zuurstof plasmabehandeling: <ol><li> Breng het objectglaasje met ten minste een microsfeer de zuurstofplasma kamer. </li><li> Stel de zuurstofdruk tot 200 mTorr, en de kracht tot 120 W. het monster bloot te stellen aan de zuurstof plasma voor 2 miMINUTEN. </li><li> Verwijder de glazen dia uit het plasma kamer. </li></ol></li></ol> 4. Bevestiging van silaan koppelingsmiddelen aan de Surface <ol><li> Plaats het glasplaatje, die tenminste een microsfeer, in een vacuümexsiccator in een zuurkast. </li><li> Ook in de zuurkast, opent u het silaan fles (in dit geval, aminopropyltrimethoxysilaan (APTMS) werd gebruikt), en plaats de geopende fles in de exsiccator. </li><li> Plaats het deksel op de vacuüm exsiccator, en bevestig het uiteinde aan een aspirator of huis vacuüm lijn. </li><li> Zet het huis vacuüm of de waterleiding, en evacueren het vacuüm exsiccator. Wanneer een vacuüm afdichting wordt gevormd tussen het deksel en de basis, de tijdsduur van de reactie. Dit deponeren silaan op het oppervlak als een dunne film. </li><li> Na 15 minuten, schakelt u het vacuüm, en langzaam opent de poort om lucht te laten in de exsiccator. Voor dit hechtmiddel 15 minuten is voldoende om een ​​vorming uniform monolaag op het oppervlak. Voor andere koppelaars, kan de tijd moeten worden aangepast. </li></ol> 5. Bevestigen van biotine aan de Surface <ol><li> Ongeveer een uur voor het bevestigen van de biotine, stelt een 10 mM oplossing van N-hydroxylsuccinimide biotine (NHS-biotine) in watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) in een 60 ml flesje polypropyleen met een scharnierende kap. <ol><li> Als de NHS-biotine is opgeslagen koude, laat het dan op kamertemperatuur evenwicht voordat Massing het uit. </li><li> Sonificeer de oplossing gedurende 1 uur de NHS-biotine poeder volledig oplossen in het oplosmiddel. </li></ol></li><li> Breng het objectglaasje met de microsfeer in een plastic flesje met de microsferen op de bodem, en stengels aan de bovenkant van de flacon. </li><li> Transfer, met behulp van een plastic pipet, een zodanige hoeveelheid van het NHS-biotine-oplossing langs de zijkant van de flacon, achter de glazen dia (dus de oplossing niet raakt de microsfeer als het wordt toegevoegd aan de flacon). Eendd voldoende oplossing van het microbolletje oppervlak. </li><li> Plaats de vaatjes nu met de microsferen en NHS-biotine in DMSO-oplossing op een schommelende incubator (kantelblad) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, de snelheid en hellingshoek bij 5 opm en 5 graden, respectievelijk. </li><li> Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon, voorzichtig en schuif in een ander flesje gevuld met DDI H 2 O. Plaats de flacon op de kantelblad nog 10 minuten bij dezelfde snelheid en de hellingshoek als tevoren. Twee keer Herhaal deze stap met vers water per keer. Dit helpt bij het verwijderen overtollige DMSO van het oppervlak, en verwijdert alle fysisch-geadsorbeerde biotine die niet echt graft aan de oppervlakte. </li><li> Verwijder het glaasje van de flacon en plaatst deze in een oven bij 80 ° C gedurende 10 minuten tot alle waterdruppels van het oppervlak verwijderd. </li></ol> 6. TL-etikettering van amine-beëindigde silica <ol><li> Om de aminegroepen aanwezig na treatm labelENT met APTMS, de voorbereiding van de FITC oplossing in een donkere kamer door het oplossen van 1 mg FITC in 1 ml watervrij DMSO. </li><li> Verder verdund in 6,1 door toevoeging van 50 pi van de FITC oplossing 1 ml 0,1 M natrium bicarbonaat buffer. </li><li> Plaats de oplossing in een 60 ml polypropyleen flacon met een scharnierende kap en voorzichtig de amine-beëindigde microsferen, weer gehuisvest op het glasplaatje, schuift u in de flacon. </li><li> Plaats de flacon in een ijsbad en laat het monster reageren met de FITC oplossing ten minste 4 uur in het donker. </li><li> Verwijder overtollig fluorofoor door middel van twee, tien minuten spoelingen van de microsferen in natriumcarbonaat buffer. Net als voorheen, vul een 60 ml polypropyleen flacon met een scharnierend deksel met de buffer, en schuif het glaasje in de oplossing, zorg dat de oplossing alleen de microsferen, en niet de kartonnen deksels. Bedek de flacon met aluminiumfolie en plaats de flacon op een tilt-tray vastgesteld op 5 graden en 5 toeren per minuut, zoals voorheen. </li><li> Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon, voorzichtig en schuif in een ander flesje gevuld met DDI H 2 O en bedekt met aluminiumfolie. Plaats de flacon op de kantelblad nog 10 minuten bij dezelfde snelheid en de hellingshoek als tevoren. Twee keer Herhaal deze stap met vers water per keer. Dit helpt bij het verwijderen overtollige kleurstof van het oppervlak. </li><li> Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon, en droog in een oven op 80 C gedurende 10 minuten voor de beeldvorming. </li></ol> 7. TL-etikettering van biotine-beëindigde silica <ol><li> Bereid een 10 pg / ml oplossing van Texas-rood avidine in fosfaat gebufferde zoutoplossing. </li><li> Voeg de oplossing 60 ml flesje polypropyleen met een scharnierend deksel, en schuif het objectglaasje met een biotine-getermineerde microsfeer in de oplossing, zodat de microsfeer net onder de oplossing. </li><li> 30 minuten reageren bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Verwijder overtollig fluorofoor door middel van twee, tien minuten spoels van de microsferen in PBS buffer. <ol><li> Net als voorheen, vul een 60 ml polypropyleen flacon met een scharnierend deksel met de buffer, en schuif het glaasje in de oplossing, zorg dat de oplossing alleen de microsferen, en niet de kartonnen deksels. </li><li> Bedek de flacon met aluminiumfolie en plaats de flacon op een tilt-tray vastgesteld op 5 graden en 5 toeren per minuut, zoals voorheen. </li></ol></li><li> Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon, voorzichtig en schuif in een ander flesje gevuld met DDI H 2 O en bedekt met aluminiumfolie. Plaats de flacon op de kantelblad nog 10 minuten bij dezelfde snelheid en de hellingshoek als tevoren. Twee keer Herhaal deze stap met vers water per keer. Dit helpt bij het verwijderen overtollige kleurstof van het oppervlak. </li><li> Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon en droog in de oven, ingesteld op 80 ° C gedurende 10 minuten voor de beeldvorming. </li></ol> 8. Representatieve resultaten Correct gefunctionaliseerde microsfeers kunnen worden geïdentificeerd door middel van optische en fluorescentie microscopie. Als het oppervlak functionalisering is juist, zal dit resulteren in een gelijkmatig dekkend van biotine moleculen op het oppervlak en het oppervlak te defect en verontreinigingen vrij blijft nadat functionalisering om hun hoge gevoeligheid te behouden tijdens detectie experimenten. Optische microscopie kan worden gebruikt om deze probe, terwijl fluorescentiemicroscopie de kwaliteit en uniformiteit van dekvlak sonde. In figuur 2 wordt tonen voorbeelden van gefunctionaliseerde kunnen microsferen. Deze beelden tonen dat er geen beschadiging van het oppervlak of besmetting door functionalisering (Fig. 2a) en dat de microsferen een uniforme, uniforme bedekking van beide aminogroepen (Fig. 2b) of biotine groepen (Fig. 2c) waarvan het oppervlak . Indien de microsferen niet correct gefunctionaliseerd de optische microsfeer beelden wizal vertonen besmetting van het oppervlak, samenklontering of niet-uniforme dekking, en duidelijke gebreken in het oppervlak, zoals het oppervlak scheuren (figuur 3). Hier zien we een bekend voorbeeld van besmetting van het oppervlak, als gevolg van samenklontering van de reagentia aan de oppervlakte. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig1.jpg" /> Figuur 1. Drie stappen reactieschema voor bevestiging probe moleculen op het oppervlak van silica microsferen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3866/3866fig1large.jpg" target="_blank">klik hier grotere figuur zien</a> . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig2.jpg" /> Figuur 2. Silica microsferen. a) Optische microfoto van silica microsfeer gevuld met hydroxylgroepen via blootstelling aan zuurstofplasma b) TL microfoto van silica microsfeer gevuld met primaire aminen en voorzien FITC kleurstof c) TL microfoto van silica microsphere bevolkt met biotine en gelabeld met Texas Red-avidine conjugaat. Overgenomen met toestemming van Soteropulos, CE, Hunt, HK &amp; Armani, AM Bepaling van bindingskinetiek gebruik van Whispering Gallery-modus microcavities. Appl. Phys. Lett. 99, 103.703 tot 103.703 (2011). Copyright 2011, American Institute of Physics. 17 <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig3.jpg" /> Figuur 3. Optische microscoop foto van onjuist gefunctionaliseerde bol. Hier ziet u stof op het rechts boven het oppervlak, maar ook als verontreiniging uitbreiding van het oppervlak. Bovendien is de rechterzijde van de optische microsfeer toont een graszode op het oppervlak.

<ol><li>Datar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cantilever+Sensors%3A+Nanomechanical+Tools+for+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Cantilever Sensors: Nanomechanical Tools for Diagnostics.</a> MRS Bull. 34, 449-454 (2009).</li>
<li>Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biological+and+chemical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Label-free biological and chemical sensors.</a> Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).</li>
<li>Sundberg, F., Karlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+characterization+of+immune+responses+using+label-free+biacore+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and characterization of immune responses using label-free biacore immunoassays.</a> Immunology. 120, 46-47 (2007).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , 2nd edn, Academic Press. (2008).</li>
<li>Bernards, M. T., Cheng, G., Zhang, Z., Chen, S. F., Jiang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonfouling+polymer+brushes+via+surface-initiated%2C+two-component+atom+transfer+radical+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Nonfouling polymer brushes via surface-initiated, two-component atom transfer radical polymerization.</a> Macromolecules. 41, 4216-4219 (2008).</li>
<li>Fan, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+optical+biosensors+for+unlabeled+targets%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Sensitive optical biosensors for unlabeled targets: A review.</a> Anal. Chim. Acta. 620, 8-26 (2008).</li>
<li>Qavi, A. J., Washburn, A. L., Byeon, J. Y., Bailey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+technologies+for+quantitative+multiparameter+biological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free technologies for quantitative multiparameter biological analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394, 121-135 (2009).</li>
<li>Hunt, H. K., Soteropulos, C., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+Strategies+for+Microtoroidal+Optical+Resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation Strategies for Microtoroidal Optical Resonators.</a> Sensors. 10, 9317-9336 (2010).</li>
<li>Kalia, J., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Advances in Bioconjugation.</a> Curr. Org. Chem. 14, 138-147 (2010).</li>
<li>Matsko, A. B., Savchenkov, A. A., Strekalov, D., Ilchenko, V. S., Maleki, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Applications+of+Whispering-Gallery+Mode+Resonators+in+Photonics+and+Nonlinear+Optics%5BTitle%5D)+AND+%22IPN+Progress+Report%22%5BJournal%5D)">Review of Applications of Whispering-Gallery Mode Resonators in Photonics and Nonlinear Optics.</a> IPN Progress Report. , 42-162 (2005).</li>
<li>Armani, A. M., Kulkarni, R. P., Fraser, S. E., Flagan, R. C., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free%2C+single-molecule+detection+with+optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free, single-molecule detection with optical microcavities.</a> Science. 317, 783-787 (2007).</li>
<li>Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+single+nanoparticle+detection+and+sizing+by+mode+splitting+in+an+ultrahigh-Q+microresonator%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photon%22%5BJournal%5D)">On-chip single nanoparticle detection and sizing by mode splitting in an ultrahigh-Q microresonator.</a> Nat. Photon. 4, 122-122 (2010).</li>
<li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whispering-gallery-mode+biosensing%3A+label-free+detection+down+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering+gallery+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single virus detection from the reactive shift of a whispering gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20701-20704 (2008).</li>
<li>Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+microcavity+optical+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Recycling microcavity optical biosensors.</a> Opt. Lett. 36, 1092-1094 (2011).</li>
<li>Soteropulos, C. E., Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+binding+kinetics+using+whispering+gallery+mode+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Determination of binding kinetics using whispering gallery mode microcavities.</a> Appl. Phys. Lett. 99, 103703-103703 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Zoals beschreven in de protocollen we een behuizing platform waarop de silica microsferen transporteren naar hun stelen in de functionalisering proces. Deze behuizing platform is gemaakt als een oplossing aan het oppervlak vervuiling en beschadiging dat het gevolg is van het microbolletje in aanraking met de wanden van de verschillende houders gebruikt in de functionalisering proces. We realiseerden ons dat het grootste probleem is ontstaan ​​uit voortdurend bevestigen en verwijderen individuele microsferen naar verschi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Visser </td><td> 67-56-1 </td><td> ACS kwaliteit </td></tr><tr><td> Zwavelzuur </td><td> Visser </td><td> 8014-95-7 </td><td> Fuming </td></tr><tr><td> Waterstofperoxide </td><td> Visser </td><td> 7722-84-1 </td><td> 30 gew% </td></tr><tr><td> Aminopropyltrimethoxysilaan </td><td> Visser </td><td> 13822-56-5 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-biotine EZ linker </td><td> Doorboren </td><td> 20217 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td> Visser </td><td> 67-68-5 </td><td> Watervrij </td></tr><tr><td> Fluoresceïne-isothiocyanaat </td><td> Doorboren </td><td> 46425 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing </td><td> Visser </td><td> 7647-14-5 </td><td> Poeder concentraat </td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaatbuffer </td><td> Visser </td><td> NC0099321 </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red - Avidine conjugaat </td><td> Doorboren </td><td> A820 </td><td></td></tr><tr><td> Optical Fiber </td><td> Newport </td><td> F-SC </td><td></td></tr><tr><td> Fiber Stripper </td><td> Fiber Instrument Sales </td><td> NN-175 </td><td> No-Nik 175 um stripper </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Visser </td><td> 06666A </td><td></td></tr><tr><td> Bare Fiber Cleaver </td><td> Ilsintech </td><td> Cl-03A </td><td></td></tr><tr><td> Glas Microscope Slides </td><td> Visser </td><td> 12 550B </td><td></td></tr><tr><td> Polypropyleen flacons </td><td> Visser </td><td> 03 tot 341-75A </td><td> 60 ml, scharnierend cap </td></tr><tr><td> Incuberen Rocker </td><td&gt; VWR </td><td> 12620-910 </td><td></td></tr><tr><td> Vacuümexsiccator </td><td> Visser </td><td> 08-594-15B </td><td></td></tr></tbody></table>

bevestiging van biologische probes aan silica optische biosensoren gebruik van silaan agenten

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Om de interface met biologische omgevingen, biosensor platforms, zoals het populaire Biacore systeem (op basis van de Surface Plasmon Resonance (SPR) techniek), gebruik maken van verschillende oppervlakte modificatie technieken, dat kan, bijvoorbeeld, te voorkomen dat oppervlaktewater vervuilen, moet afstemmen op deze hydrofobiciteit / hydrofiliciteit van het oppervlak, aan te passen aan een verscheidenheid van elektronische leeromgevingen, en meest, specificiteit leiden naar een doel van belang. 1-5 Deze technieken de functionaliteit van de anders zeer gevoelige biosensoren uit te breiden tot real-world applicaties in complexe omgevingen, zoals als bloed, urine en afvalwater analyse. 2,6-7 Hoewel de commerciële biosensing platforms, zoals Biacore, hebben goed begrepen, standaard technieken voor het uitvoeren van dergelijke oppervlakmodificaties, zijn deze technieken niet vertaald in een gestandaardiseerde vorm aan andere label- gratis biosensing platforms, zoals Whispering Gallery Mode (WGM) optische resonatoren. 8-9 &lt;<html> / P&gt; WGM optische resonatoren een veelbelovende technologie voor het uitvoeren label zonder detectie van diverse soorten aan ultra-lage concentraties 6,10-12 De hoge gevoeligheid van deze platforms is het gevolg van zijn unieke geometrische optica. WGM optische resonatoren beperken circulerende . licht specifieke geïntegreerde resonantiefrequentie 13 Zoals de SPR platforms, wordt de optische veld niet volledig beperkt tot de sensorinrichting, maar evanesces, deze &quot;vluchtige tail&quot; kan dan samenwerken met species in de omgeving. Deze interactie veroorzaakt de effectieve brekingsindex van het optische veld veranderen, waardoor een lichte maar detecteerbare verschuiven in de resonantiefrequentie van het apparaat. Omdat het optische gebied circuleert, kan interageren vaak met de omgeving, waardoor een inherente versterking van het signaal, en zeer hoge gevoeligheid voor kleine veranderingen in de omgeving. 2,14-15 tent &quot;&gt; Voor een gerichte detectie in complexe omgevingen voeren deze platforms zijn gekoppeld met een probe molecuul (meestal een helft van een bindend paar, bijvoorbeeld antilichamen / antigenen) door oppervlaktemodificatie. 2 Hoewel WGM optische resonator kan worden vervaardigd in verschillende geometrieën van verschillende materialen systemen, silica microsfeer is het meest gebruikelijk. Deze microsferen algemeen vervaardigd op het uiteinde van een optische vezel, die een &quot;stam&quot; waarbij de microsferen kan worden verwerkt in functionalisering en detectie experimenten geeft. Silica oppervlakchemie kan worden toegepast probe moleculen hechten aan de oppervlakken, maar traditionele technieken gegenereerd vlakke substraten vaak niet voldoende voor de drie-dimensionale structuren als wijzigingen in het oppervlak van de microsferen (stof, vuil, oppervlakte defecten en ongelijkmatige coatings) kan ernstige, negatieve gevolgen voor hun detectie mogelijkheden. Hier demonstreren we een gemakkelijke benaderingvoor het oppervlak functionalisering van silica microsfeer WGM optische resonatoren met silaan koppelingsmiddelen de anorganische oppervlak en de biologische omgeving overbruggen door het aanbrengen van biotine aan het silica-oppervlak. 8,16 Hoewel wij silica microsfeer WGM resonatoren het sensorsysteem in dit verslag de protocollen algemeen en kan worden gebruikt om het oppervlak van een silica inrichting te functionaliseren met biotine.

Biosensoren-interface met complexe, biologische omgevingen en het uitvoeren van gerichte opsporing door het combineren van zeer gevoelige sensoren met zeer specifieke probes verbonden aan de sensor via oppervlakte modificatie. Hier tonen we het oppervlak functionalisering van silica optische sensoren met biotine met silaan koppelingsmiddelen aan de sensor en de biologische omgeving overbruggen.

Bevestiging van biologische Probes aan Silica optische biosensoren gebruik van silaan agenten

Om een koppeling met biologische omgevingen te realiseren, maken biosensorplatformen, zoals het veelgebruikte Biacore-systeem (gebaseerd op Surface Plasmon Resonance (SPR)...

Het algemene doel van deze procedure is om het oppervlak van de optische resonator van de silico-microsfeer te coaten met biotine via een covalent hechtingsproces, zonder de gevoeligheid van het apparaat aan te tasten. Dit wordt bereikt via een proces van drie stappen, beginnend met hydroxylering met behulp van zuurstofplasma of piha-ets hydroxylering, gevolgd door emanatie via dampdepositie van een slan-koppelingsmiddel. Vervolgens wordt de biotine-koppeling uitgevoerd met behulp van NHS-esterchemie om de valeriaanzijketen van biotine te verbinden met de primaire aminen op het oppervlak van de resonator.Uiteindelijk creëert deze methode een optische biosensor die zowel zeer gevoelig als specifiek is voor een molecuul van belang, en die verder kan worden aangepast via fluorescente markering van een gemiddeld afgebroken silica, evenals via de Ava tin biotin complexatiemethode om een biosensorplatform te creëren voor een breed scala aan potentiële doelwitmoleculen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor oppervlaktefunctionalisering, zoals fysieke adsorptie, is dat ons sondemolecuul covalent is gebonden, wat onze sensoren robuuster en bet

attaching-biological-probes-to-silica-optical-biosensors-using-silane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit artikel beschrijven we hoe we krijgen FRET sporen van individuele DNA-moleculen geïmmobiliseerd op een oppervlak met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop.

Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

We beschrijven een methode voor de waarneming real-time replicatie van individuele DNA-moleculen gemedieerd door eiwitten van de bacteriofaag replicatie systeem.

Directe observatie van Enzymen repliceren DNA met behulp van een Single-molecule DNA Stretching Assay

A-label-free optische biosensor voor de snelle detectie van bacteriën wordt geïntroduceerd. De biosensor is gebaseerd op een nanogestructureerde poreuze Si, die is ontworpen om direct vastleggen van de doelbacteriën cellen op het oppervlak. Wij gebruiken monoklonale antilichamen geïmmobiliseerd op de poreuze transducer als capture probes. Onze studies tonen de toepasselijkheid van deze biosensoren voor de detectie van lage bacteriële concentraties binnen enkele minuten zonder voorafgaande...

Optische detectie van E. coli Bacteriën door Mesoporous Silicon biosensoren

Er wordt een protocol gepresenteerd om een grote verscheidenheid aan enkele moleculen covalent aan een AFM-tip te koppelen. Procedures en voorbeelden om de adhesiekracht en vrije energie van deze moleculen op vaste ondergronden en bio-interfaces te bepalen, worden gegeven.

Onderzoekt Single Molecule Hechting van Atomic Force Spectroscopie

Bacterieel hechting aan gasthercelten is een sleutelstap tijdens gastheerkolonisatie en infectie. Dit protocol beschrijft de generatie van polymeer-gekoppelde recombinante adhesines als biomimetische materialen die analyse van de bijdrage van individuele adhesines aan deze processen mogelijk maken, onafhankelijk van andere bacteriële factoren.

Biomimetische materialen Bacteria-gastheer interacties karakteriseren

We beschrijven de belangrijkste stappen voor biosensing door gebruik te maken van polysilicon nanowire field-effect transistors, inclusief de voorbereiding van het apparaat en de immobilisatie en bevestiging van een DNA moleculaire sonde op het nanowire oppervlak, evenals de voorwaarden voor DNA sensing.

Bereiding van silicium Nanowire veldeffecttransistor voor chemische en biosensoren toepassingen

Hier presenteren we een protocol om de kracht van de interacties tussen een goed gedefinieerde anorganische oppervlak en ofwel peptiden of aminozuren door single-molecule force spectroscopy metingen te meten met behulp van een atomic force microscope (AFM). De resultaten van de meting informatie is belangrijk voor een beter begrip van het peptide-anorganisch materiaal interfase.

Inzicht in de interacties van aminozuren en peptiden met anorganische materialen met behulp van enkel-molecuul Force Spectroscopie

Hier presenteren we een protocol om te synthetiseren van bioinspired silica materialen en immobiliseren enzymen daarin. Siliciumdioxide wordt gesynthetiseerd door natrium-silicaat en een amine 'levensmiddelenadditief', die met een gecontroleerde snelheid neutraliseren te combineren. Materiaaleigenschappen en functie kunnen worden gewijzigd door in situ enzym immobilisatie of post synthetische zure elutie van ingekapselde additieven.

Voorbereiding van functionele Silica met behulp van een methode Bioinspired

Dit protocol beschrijft de covalente immobilisatie van eiwitten met een heterobifunctional silane koppelmiddel op siliciumoxide oppervlakken ontworpen voor de atomaire kracht microscopie gebaseerd enkel molecuul kracht spectroscopie die wordt geïllustreerd door de interactie van RrgA (pilus-1 tip antistoffen van S. pneumoniae) met fibronectine.

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

Gepresenteerd hier is een protocol voor het uitvoeren van single-molecuul Förster resonantie energie overdracht te bestuderen HJ resolutie. Voor het bepalen van de dissociatieconstanten wordt tweekleurige alternerende excitatie gebruikt. Single-Color timelapse smFRET wordt vervolgens toegepast in real-time decolleté assays om de dwelltijd verdeling vóór HJ resolutie te verkrijgen.

Single-molecuul Förster Resonance Energy Transfer methoden voor real-time onderzoek van de Holliday Junction-resolutie door GEN1

Dit werk heeft tot doel de ontwikkeling te vergemakkelijken van gestandaardiseerde technieken voor het impregneren of enten van geamineerde verbindingen op silicasubstraten, die vaak breed worden beschreven in de literatuur. Specifieke hoeveelheden oplosmiddel, substraat, aminen en de waarden van andere belangrijke experimentele parameters zullen in detail worden besproken.

Een synthetische methodologie voor het bereiden van geïmpregneerde en geënte silicacomposieten op basis van amine voor koolstofafvang

Leer hoe u biologische probes koppelt aan silica optische biosensoren met silaanagenten. Deze methode gebruikt covalente binding via NHS-ester-chemie voor robuuste, langdurige sensoren.

Bevestiging van biologische Probes aan Silica optische biosensoren gebruik van silaan agenten

Meer video's verkennen