MicroRNA Detectie in prostaattumoren op Kwantitatieve Real-time PCR (qPCR)

Het algemene doel van het volgende experiment is om de expressieniveaus van micro-RNA-moleculen in prostaatkanker en normaal prostaatweefsel te kwantificeren met behulp van kwantitatieve real-time PCR. Dit wordt bereikt door eerst totaal RNA uit prostaatweefsels te extraheren. Dit omvat mRNA, micro-RNA en andere kleine RNA's.

Vervolgens wordt het RNA teruggetranscribeerd om cDNA te genereren. Daarna wordt een real-time PCR op basis van Cypher Green uitgevoerd, waarbij het cDNA als template wordt gebruikt om de expressie van microRNA in real-time te amplificeren en te kwantificeren. De verkregen resultaten tonen de relatieve expressie van microRNA's in diverse prostaatmonsters op basis van kwantitatieve real-time PCR.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden is dat deze een hoge gevoeligheid, nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid biedt, en dat deze snel en kosteneffectief is. Deze methode kan worden gebruikt om kernvragen in het veld van de kankersbiologie te beantwoorden, aangezien de expressie van microRNA vaak correleert met genen die sterk betrokken zijn bij het kankerproces. We kunnen QPCR daarom gebruiken om de expressie van microRNA's te beoordelen en te zien hoe dit correleert met klinische variabelen.

Deze biomarkers kunnen mogelijk worden gebruikt als zowel diagnostische als prognostische instrumenten. Ze kunnen ons helpen bij het diagnosticeren van prostaatkanker en bij het bepalen welke vormen van prostaatkanker agressief zijn. Daarnaast is er potentie voor deze biomarkers om als therapeutische middelen te dienen.

Deze methode kan niet alleen inzicht bieden in de genese van prostaattumoren, maar kan mogelijk ook worden toegepast op andere kankersoorten en ziekten. Verzamel prostaatmonsters op het moment van de ectomie en oriënteer het specimen aan de hand van anatomische referentiepunten. Markeer de prostaat en de zaadblaasjes met inkt als volgt: de rechterzijde groen en de linkerzijde blauw.

Neem een willekeurige transversale doorsnede van het weefsel loodrecht op het recto-oppervlak, vries het monster in en bewaar het bij -80 °C. Maak een fotokopie, oriënteer de plakjes van de specimens en verdeel deze in vier gelijke delen. Raadpleeg een patholoog om op de betreffende afbeelding de tumorgebieden te onderscheiden van de normale gebieden.

Gebruik de gemarkeerde gebieden als leidraad om tumorweefsel te identificeren voor het extraheren van RNA om RNA te isoleren. Begin met het plaatsen van bevroren prostaatmonsters op droge ijs en raadpleeg de omlijnde fotokopie. Snijd een klein deel van de prostaattumor uit.

Homogeniseer het prostaattumorgeweefsel in één milliliter triol-reagens. Incubeer de gehomogeniseerde monsters gedurende vijf minuten. Voeg bij kamertemperatuur 0,2 milliliter chloroform toe aan de monsters en schud krachtig gedurende 15 seconden.

Incubeer de monsters gedurende drie minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer vervolgens 15 minuten bij 12 000 ×g bij vier graden Celsius. Overbreng de kleurloze bovenste waterfase naar nieuwe buisjes en voeg 0,5 milliliter isopropylalcohol toe. Incubeer de monsters 10 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer vervolgens 10 minuten bij 12 000 ×g bij vier graden Celsius.

Aspirer het supernatant voorzichtig zonder de pellet met het RNA te verstoren. Voeg één milliliter 75% ethanol toe aan de RNA-pellet, vortex het monster en sedimenteer door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 7.500 ×g bij vier graden Celsius. Aspirer opnieuw het supernatant en droog de RNA-pellet gedurende vijf tot 10 minuten, waarbij u ervoor zorgt dat deze niet volledig uitdroogt.

Los het pellet op in nucleasevrij water en gebruik een spectrofotometer om de concentratie van het RNA te meten. Gebruik een bioanalyzer om de kwaliteit en integriteit van de RNA-monsters te controleren. Transcripteer het RNA om tot cDNA met behulp van een reverse transcriptie-kit volgens de instructies van de fabrikant.

Om een standaardcurve te genereren, bereidt u een reeks verdunningen van de oorspronkelijke CD NA voor uit een monster waarvan bekend is dat er een substantiële expressie van het gen van belang is. Voer real-time PCR uit door een mastermix voor te bereiden op basis van een reactievolume van 20 µL van twee x quant. Detect cyber green PCR master mix 10 x microscript universele primer, 10 x microscript primer assay en RN a's vrij water.

Voeg twee sets primers toe, één voor het doelgen en een andere voor het referentiegen, in dit geval RNU6B. Pipetteer 2 µL van elke cDNA-verdunning in afzonderlijke LightCycler-capillaire buisjes en voeg 18 µL van de mastermix toe. Gebruik een capillair-adapter om te centrifugeren. Plaats de capillairen in een real-time cycler op basis van capillairen en voer het PCR-programma als volgt uit: 95 °C gedurende 15 minuten, gevolgd door 50 cycli van 94 °C gedurende 15 seconden.

55 °C gedurende 30 seconden en 70 °C gedurende 30 seconden. Selecteer een monster als calibrator en stel de genormaliseerde doelhoeveelheid hiervan in op één. Vergelijk de relatieve expressie van het micro RNA in alle overige monsters met de calibrator om amplificatiecurves te genereren.

Gebruik voor de PCR-reacties de software van de molecular biochemicals light cycler versie 3.5 in het tabblad quantification. Kwantificeer de reacties en exporteer de gegevens naar een tekstbestand. Importeer de gegevens in de REL quant-analysesoftware om de kwantificatieresultaten te genereren.

Importeer afzonderlijke bestanden voor de doelgen, het referentiegen en de gegevens van de standaardcurve. Specificeer de positie van de calibrator voor zowel het doelgen als het referentiegen, evenals de posities van de monsters. De gegevens worden uitgedrukt als de ratio doelgen/referentiegen van verschillende monsters gedeeld door de ratio doelgen/referentiegen van de calibrator.

Gebruik de eerder gegenereerde standaardcurve voor een specifiek micro RNA en housekeeping-gen als referentiestandaard voor het extrapoleren van kwantitatieve gegevens voor micro RNA-targets met onbekende concentraties. Analyseer drie monsters als groep en bereken de gemiddelde concentraties en standaarddeviaties van het triplikaat.

Als een van de triplicaten inconsistent is met de rest van de set, zal het programma deze uitsluiten. Hier wordt een voorbeeld getoond van A-Q-P-C-R-analyse van prostaatmonsters. De grafieken die de expressieniveaus van het referentiegen U six laten zien, vertonen een exponentiële amplificatie vanaf ongeveer cyclus 20, terwijl de expressie van het doelgen, MIR 98, een vertraagde amplificatie vertoonde rond cyclus 25.

De gegevens van dit experiment werden geëxporteerd als tekstbestand en geanalyseerd met analyse-software waarbij de posities van de capillairen die de calibrator en monsters bevatten, zijn gespecificeerd. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in één dag worden voltooid mits correct uitgevoerd. De betrouwbaarheid van deze techniek is afhankelijk van de kwaliteit van het RNA.

Daarom is het belangrijk om extra voorzichtig te zijn bij het hanteren van RNA, omdat het zeer gemakkelijk kan degraderen.