Name: Voorbereiding van de myeloïde suppressor cellen (MDSC) van naïeve en pancreas tumor-dragende muizen met behulp van flowcytometrie en geautomatiseerde Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Leer een snelle methode voor immunofenotypering van myeloïde suppressorcellen (MDSC) en verrijking van Gr-1+ leukocyten uit muizenspleten met behulp van flowcytometrie en AutoMACS-celsortering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen de USF flowcytometrie Core Facility. We willen graag Dr Denise Cooper bedanken voor het delen van resources. Wij zouden ook graag Maya Cohen, Laura Pendleton en Diana Latour bedanken voor hun hulp bij het opzetten en filmen van deze video. NN ondersteund door NSF FG-LSAMP Brug naar het College voor Promoties Fellowship HRD # 0929435. Dit werk werd gefinancierd door de American Cancer Society Institutional Research Grant # 93-032-13/Moffitt Cancer Center uitgereikt aan TG.

Voorafgaand aan het starten, de voorbereiding van de volgende oplossingen: 3% kleuring Media (SM): -3% Foetaal runderserum (FBS) in 1X fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) MACS Buffer (MB): - 0,5% runderserum albumine van (BSA) in 1XPBS 1. Oogsten milt van muizen <ol><li> Subcutaan injecteren 6-8 weken oud C57BL / 6 muizen (Harlan) met 1,5 x 10 5 muizen Panc02 cellen gesuspendeerd in 100 ul 1x PBS (tumor-dragende, TB). Controle muizen (Naïve) ontvangt 100 ul 1XPBS. </li><li> Ongeveer 4 weken na de injectie, euthanaseren muizen door kooldioxide stikken. </li><li> Oogsten milt van muizen door stompe dissectie behulp van een tang en schaar weeg met behulp van een balans. Plaats milt in aparte, gelabeld 50 ml conische buizen met 1 x PBS. </li></ol> 2. Genereer een Single-cell Suspension leukocyten van Milten Alle procedures dienen te worden uitgevoerd in een steriele omgeving onder een Biologische Veiligheid Hood en cellen en antilichamen bewaard op ijs. <ol><li> Monteren van de cel dissociatie zeef door toevoeging van de gaas in de opening van de kop naar beneden. Plaats vervolgens de borgring in de schroefdraad gebied met de gleuf naar boven en gebruik de ring om de borgring vast, dus houdt het scherm op zijn plaats. Plaats de gemonteerde zeef in een petrischaal met 10 ml 1 x PBS. </li><li> Pool milt en gebruik glas stamper om milten malen tegen gaas van de cel dissociatie zeef en de petrischaal. Herhaal dit voor elke behandeling groep van muizen. </li><li> Filter celsuspensie in een 50 ml conische buis met een 70 urn zeef cel en 5 ml serologische pipet. Centrifugeer bij 12.000 rpm (250-300 xg) gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 5 ml 1 x RBC lysis buffer per milt. Pipet op en neer krachtig. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Stop de reactie door toevoeging van 20 ml 1 x PBS. Pipet op en neer krachtig. Centrifugeer bij 12.000 rpm (250-300 xg) gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 20 ml steriel 1 x PBS. Pipet op en neer krachtig. </li><li> Tellen cellen met trypanblauw en hemacytometer en hersuspenderen van gewenste concentratie van 3% SM zodat 50 pi is gelijk aan 5x10 1x10 5 6 cellen (1x10 7 cellen / ml - 2x10 7 cellen / ml). </li></ol> 3. Cel-oppervlakte-kleuring / immunofenotypering van MDSC met behulp van flowcytometrie <ol><li> Label de wells van een 96-well V bodemplaat voor de controle en experimentele monsters en enkele vlekken voor compensatie voordelen (geen Beits, NS, Mac-1-FITC, Gr-1-APC en DAPI). </li><li> Voeg 5x10 1x10 5 6 cellen overeenkomend met 50 ul / putje van splenocyten hun respectieve putjes in de 96-well V-bodemplaat. Centrifugeerplaat bij 12.000 rpm (250-300 xg) gedurende 5 minuten. </li><li> Bereid &quot;meester Mix&quot; (MM) van Mouse BD Fc Block (Rat anti-muis CD16/32 monoklonaal antilichaam) verdund in 3% SM, een 1,5 ml microcentrifugebuisje op ijs. Als uitgangspunt gebruikt 1 pg Fc blok in 3% SM een eindvolume van 50 ul per putje. </li><li> Verwijder supernatant uit elk putje van de 96-well V-bodemplaat snel omkeren van de plaat over en weer over een afvalhouder of sink zonder onderbreking van de celpellets. </li><li> Vortex, kort Fc Blok MM centrifugeren gedurende 5 seconden en 50 ul van alle pellets in de 96-wells V-bodemplaat toe te voegen. Meng goed door voorzichtig en neer te pipetteren, waardoor monsters in hun putten. Incubeer plaat gedurende 15 minuten in het donker op het ijs. Centrifugeer plaat bij 12.000 toeren per minuut (250-300 xg) gedurende 5 minuten. </li><li> Bereid &quot;meester Mix&quot; (MM) van fluorochroom-geconjugeerde antilichamen verdund in 3% SM in 1,5 ml microcentrifugebuisje op ijs, terwijl monsters geïncubeerd met Fc blok. Antilichamen dient te worden getitreerdoptimale verdunningen bepalen kleuringen. Als uitgangspunt combineren 1:25 verdunning van Mac-1-FITC en 1:20 verdunning van Gr-1-APC in 3% SM een eindvolume van 50 ul per monster goed. </li><li> Voorzichtig supernatant uit elk putje van de 96-well V-bodem zoals eerder beschreven. </li><li> Vortex, kort centrifugeren MM van TL-geconjugeerde vlekken antilichamen gedurende 5 seconden en voeg 50 ul om de controle en experimentele pellets. Meng goed door voorzichtig en neer te pipetteren. Voor enkele vlek compensaties toevoegen 1:25 verdunning van Mac-1-FITC 1:20 verdunning van Gr-1-APC en 75 ng / ml DAPI, in 3% SM een eindvolume van 50 pl per putje hun respectieve putjes. Voeg 50 ul 3% SM goed onbesmet (geen vlekken). Mengen en incuberen cellen in 96-well V-bodemplaat 30 minuten in het donker op ijs. </li><li> Label FACS buizen (5 ml, 12 mm x 75 mm polystyreen rondbodem buizen) overeenkomen met elke well in 96-well de V-bodemplaat. Voeg 200 ul 3% SM elk FACSbuis. </li><li> Centrifugeer plaat bij 12.000 toeren per minuut (250-300 xg) gedurende 5 minuten en verwijder supernatanten. Was pellets door toevoeging van 100 pi 3% SM elke pellet en meng goed door voorzichtig en neer te pipetteren. Centrifugeer plaat bij 12.000 toeren per minuut (250-300 xg) gedurende 5 minuten. Herhaal stap was eens te meer. </li><li> Voorzichtig supernatant uit elk putje van de 96-well V-bodem zoals eerder beschreven. Resuspendeer elke pellet in 100 ui 3% SM en meng goed. </li><li> Breng 100 pi geresuspendeerde pellet uit elk putje van de 96-well V-bodemplaat met zijn de labels FACS buis. </li><li> Voorafgaand aan cytometrie analyse Flow, voeg 75 ng / ml DAPI te controleren en experimentele monsters en DAPI enkele vlek compensatieregeling. </li><li> Voer flowcytometrische data-acquisitie van MDSC percentages. Voer vergoeding gebruik van de negatieve (geen vlek controle) en de enkele positieve controles. Stel een dot plot dat de voorwaartse (FSC) versus zijwaartse verstrooiing (SSC) in log-schaal geeft, zodat leukocyten populaties vanbelang kan worden geïdentificeerd. Teken een grote poort op alle leukocyten, met uitzondering van puin en klompen met de laagste naar voren en zijwaartse verstrooiing. Van deze ouder poort, een nieuwe dot plot dat SSC versus DAPI de poort en wordt weergegeven op DAPI-(live) cellen. Selecteer deze nieuwe gated bevolking en een dot plot dat Mac-1 versus Gr-1 en gate wordt weergegeven op uw dubbele positieve (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC. </li></ol> 4. Magnetische Verrijking van Gr-1 + Leukocyten <ol><li> Aliquot 1x10 7 resterende ongekleurde leukocyten in het gepaste label FACS en centrifugeer bij 12.000 toeren per minuut (250-300 xg) gedurende 5 minuten. </li><li> Bereid MM van Gr-1-PE antilichaam in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Tot 10 7 cellen, gebruik van een 1:10 verdunning van Gr-1-PE antilichaam in 50 pi MB, per monster. Voor een grotere cel aantallen, opschalen volumes dienovereenkomstig. Kort centrifugeren gedurende 5 seconden, toe te voegen aan leukocyten in FACS buizen en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C in het donker. </li&gt; <li> Voeg 2 ml MB tot FACS buizen, centrifuge bij 12.000 toeren per minuut (250-300 xg) gedurende 5 minuten en gooi supernatant. </li><li> Bereid MM van Anti-PE microbolletjes in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voor maximaal 10 7 cellen, gebruik maken van een 1:4 verdunning van anti-PE microbolletjes in 200 ul MB, per monster. Voor een grotere cel aantallen, opschalen volumes dienovereenkomstig. Kort centrifugeren gedurende 5 seconden, toe te voegen aan leukocyten in FACS buizen en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C in het donker. </li><li> Voeg 2 ml MB tot FACS buizen, centrifuge bij 12.000 toeren per minuut (250-300 xg) gedurende 5 minuten en gooi supernatant. Resuspendeer de cellen in 3 ml van SB. Filtreer door een 70 urn zeef in een nieuw, het label 50 ml conische buis. </li><li> Bereid en prime Auto MACS Pro Separator. Vul alle flessen met geschikte oplossingen en leeg de resttoner, indien nodig. Zet instrument op en onderzoekt de status van vloeistoftanks en kolom (s) na het initialiseren. Alle symbolen moet groen zijn. Op het menu, selecteer &quot;Scheiding&quot; van de bovenstemenubalk gevolgd door &quot;Now Was &#39;van de onderste menubalk. Selecteer &quot;spoelen&quot; van het pop-up optie gevolgd door &quot;Run&quot; om het priming proces te starten. Zodra het priming proces is voltooid, zal het instrument weer te geven dat het &quot;klaar voor Scheiding&quot; onder het menu Status. </li><li> Kies geschikte gekoelde buis rek voor buisafmetingen en plaats 50 ml conische buis met magnetisch gelabelde cellen in rij A, 50 ml conische buis voor negatieve fractie collectie in rij B en 15 ml conische buis voor positieve fractie collectie in rij C </li><li> Kies &quot;POSSEL_S&quot; celscheiding programma voor positieve selectie van gelabelde doelcellen in gevoelige mode van monsters. Magnetisch gelabelde doelcellen worden bewaard op de automaten kolom; ongelabelde cellen vrijkomen in de negatieve fractie verzamelbuis in rij B. Op automatische terugtrekking van de magneet, zal de gelabelde doelcellen worden vrijgegeven in de positieve verzamelbuis in rij C van de buis rek. </li></ol>+ verrijkte Leukocyten <ol><li> Recount Gr-1 + en Gr-1 - fracties met behulp van trypanblauw en een hemacytometer. Hersuspenderen cellen gewenste concentratie van 3% kleuring medium dat 50 pi is gelijk aan 5x10 1x10 5 6 cellen (1x10 7 cellen / ml - 2x10 7 cellen / ml) en 50 pi dragen en dienovereenkomstig gekenmerkt FACS buizen. </li><li> Bereid een MM Mac-1 alleen op een 1:25 verdunning in 3% SM een eindvolume van 50 pi per monster. Vlek cellen en voor te bereiden enkele vlek vergoedingen van Gr-PE, Mac-1 FITC en DAPI voor flowcytometrie-analyse. Voeg 200 ul 3% SM en DAPI levensvatbaarheid kleurstof zoals eerder beschreven. </li><li> Voer flowcytometrische data-acquisitie te Gr-1 + en Gr-1 te bepalen - percentages en ook pre-en post-autoMACS verrijking vergelijken MDSC percentages. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Hier laten we r<html> epresentative resultaten voor autoMACS verrijking van Gr-1 + leukocyten uit gepoold, naïeve milt voor latere FACS sorteren van MDSC (Figuur 1). 1x10 6 naïeve leukocyten werden gekleurd met Mac-1-FITC en Gr-1-APC antistoffen tegen MDSC percentages met behulp van een BD LSRII instrument te identificeren, voorafgaand aan autoMACS sorteren. 1x10 7 naïeve leukocyten werden vervolgens gekleurd met anti-Gr-1-PE antilichamen en PE-microbolletjes voor de verrijking van Gr-1 + leukocyten met behulp van een autoMACS Pro Separator. Post-autoMACS verrijking, Gr-1 percentages in Gr-1 + en Gr-1 - verzameld fracties werden geëvalueerd met behulp van flowcytometrie. 1x10 6 Gr-1 + leukocyten werden verwijderd en gekleurd met Mac-1-FITC antilichaam te analyseren en te vergelijken MDSC percentages van verrijkt, samengevoegd naïef leukocyten aan niet-verrijkte, samengevoegd tumor-dragende leukocyten door middel van flowcytometrie. fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. AutoMACS verrijking van Naïve Gr-1 + leukocyten voor MDSC FACS sorteren. Milt werden geoogst van de pancreas tumor-dragende en naïeve muizen en verwerkt tot een cel suspensies. Flow cytometrie analyse van naïeve leukocyten oppervlak gekleurd met Mac-1 en Gr-1 TL-geconjugeerde antilichamen, alvorens autoMACS verrijking (A). Flow cytometrie analyse van Gr-1 + (B) en Gr-1 - (C) fracties na autoMACS verrijking van Gr-1 + cellen samengevoegd naïeve leuckocytes gekleurd met Gr-1-PE-antilichamen en anti-PE microbolletjes. Flow cytometrie analyse van MDSC en Gr-1 + percentages na autoMACS verrijking van Gr-1 + cellen van gepoolde naïef leukocyten (D) in vergelijking met niet-verrijkte gepoolde leukocyten van tumor-dragende muizen (E) (naïeve muizen, n = 5 ; tumor-dragende muizen, n = 3). MDSC en Gr-1 percentages zijn gated in de representatieve contour kavels en histogrammen.

<ol><li>Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+during+acute+Trypanosoma+cruzi+infection%3A+involvement+of+Ly6G+%28Gr1%28%2B%29%29CD11b%28%2B%29+immature+myeloid+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells.</a> Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).</li>
<li>Zhu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2BLy-6C%28hi%29+suppressive+monocytes+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).</li>
<li>Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2B%2FGr-1%2B+myeloid+suppressor+cells+cause+T+cell+dysfunction+after+traumatic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress.</a> J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).</li>
<li>Ghansah, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+myeloid+suppressor+cells+in+SHIP-deficient+mice+represses+allogeneic+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses.</a> J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).</li>
<li>Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+SHIP+deficiency+expands+myeloid+regulatory+cells+and+abrogates+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease.</a> J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).</li>
<li>Yin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+prevent+type+1+diabetes+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models.</a> J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).</li>
<li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).</li>
<li>Gallina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+induce+a+subset+of+inflammatory+monocytes+with+immunosuppressive+activity+on+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells.</a> J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).</li>
<li>Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+frequency+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+mice+with+spontaneous+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma.</a> Immunology. 128, 141-149 (2009).</li>
<li>Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+derived+suppressor+cells+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Myeloid derived suppressor cells in human diseases.</a> Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).</li>
<li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).</li>
<li>Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets%2C+expansion+and+activation+of+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells.</a> Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).</li>
<li>Pilon-Thomas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Pancreatic+Adenocarcinoma+Dampens+SHIP-1+Expression+and+Alters+MDSC+Homeostasis+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Panopoulos, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+governs+distinct+pathways+in+emergency+granulopoiesis+and+mature+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils.</a> Blood. 108, 3682-3690 (2006).</li>
<li>Preynat-Seauve, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extralymphatic+tumors+prepare+draining+lymph+nodes+to+invasion+via+a+T-cell+cross-tolerance+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process.</a> Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).</li>
<li>Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separations+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cell separations by flow cytometry.</a> Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).</li>
<li>Maecker, H., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+reagents+for+multicolor+BD+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Postepy+Biochem%22%5BJournal%5D)">Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry.</a> Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).</li>
<li>Bagwell, C. B., Adams, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Spectral+Overlap+Compensation+for+Any+Number+of+Flow+Cytometry+Parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).</li>
<li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li>
<li>Safarik, I., Safarikova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+magnetic+techniques+for+the+isolation+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B.+Biomed.+Sci.+Appl%22%5BJournal%5D)">Use of magnetic techniques for the isolation of cells.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).</li>
<li>Collazo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHIP+limits+immunoregulatory+capacity+in+the+T-cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment.</a> Blood. 113, 2934-2944 (2009).</li>
<li>Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA+yield+from+small+cell+populations+sorted+by+flow+cytometry+applying+different+isolation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures.</a> Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).</li>
<li>Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+responses+of+human+regulatory+T+cells+%28Treg%29+and+effector+T+cells+to+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin.</a> PLoS One. 4, e5994(2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Dit is een gedetailleerde methode voor de verwerking en immunophentyping MDSC populaties die van toepassing is op verschillende lymfoïde weefsels van verschillende diermodellen. In het bijzonder kan autoMACS verrijking worden gebruikt voor de isolatie van verschillende populaties leukocyten met Gr-1 uitputting van splenocyten 4 zuivering van myeloïde subsets van splenocyten en lymfeknopen 5 isolatie van beenmerg neutrofielen 14 en zuivering van CD8 + T cellen van milt en de ly...

<table border="1"><tbody><tr><td> REAGENS </td><td> BEDRIJF </td><td> Catalog # </td><td> OPMERKINGEN </td></tr><tr><td> 1X fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SH30028.02 </td><td> Ca 2 + / Mg 2 + / Fenol Rood-vrij </td></tr><tr><td> Albumine van Bovine Serum (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Laat BSA te ontbinden ongestoord in PBS; steriele omgeving </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum (FBS) </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SV3001403HI </td><td> Warmte geïnactiveerd; steriele omgeving </td></tr><tr><td> Rat anti-muis CD16/32 monoklonaal antilichaam (Fc Block) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Steriele omgeving </td></tr><tr><td> Anti-muis CD11b (Mac-1) FITC </td><td> eBiosciences </td><td> 11-0112 </td><td> SterielOmgeving </td></tr><tr><td> Anti-muis Ly6G (Gr-1) APC </td><td> eBiosciences </td><td> 17-5931 </td><td> Steriele omgeving </td></tr><tr><td> Anti-muis Ly6G (Gr-1) PE </td><td> eBiosciences </td><td> 12-5931 </td><td> Steriele omgeving </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D1306 </td><td> Seriële verdunning steriele omgeving </td></tr><tr><td> Cell Dissociatie Zeef </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CD1-1KT </td><td> Autoclaaf voor gebruik </td></tr><tr><td> 70 urn zeef </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> Steriele omgeving </td></tr><tr><td> 1X RBC Lysis Buffer </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td> Kamertemperatuur vóór gebruik; steriele omgeving </td></tr><tr><td> Petrischalen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-12 </td><td> Steriele omgeving </td></tr><tr><td> 50ml coniCal buizen </td><td> Thermo Scientific </td><td> 339652 </td><td> Steriele omgeving </td></tr><tr><td> 5ml 12X75mm polystyreen ronde bodem buizen </td><td> BD Biosciences </td><td> 352054 </td><td> Bekend als FACS buizen; steriele omgeving </td></tr><tr><td> 96-V-bodemplaten </td><td> Corning </td><td> 3897 </td><td> Steriele omgeving </td></tr><tr><td> Trypaan blauw </td><td> Cellgro </td><td> 25-900-CI </td><td> Steriele omgeving </td></tr><tr><td> PE microkorrels </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-048-801 </td><td> Steriele omgeving </td></tr><tr><td> AutoMACS Pro Separator </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS Columns </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-021-101 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS Running Buffer </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-221 </td><td&gt; </td></tr></tbody></table>

voorbereiding van de myeloïde suppressor cellen (mdsc) van naïeve en pancreas tumor-dragende muizen met behulp van flowcytometrie en geautomatiseerde magnetic activated cell sorting (automacs)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC zijn een heterogene populatie van onvolwassen macrofagen, dendritische cellen en granulocyten die zich ophopen in de lymfoïde organen in pathologische aandoeningen, waaronder parasitaire infectie, ontsteking, traumatische stress, graft-versus-host-en vaatziekten, diabetes en kanker 1-7. Bij muizen, MDSC express Mac-1 (CD11b) en Gr-1 (Ly6G en Ly6C) oppervlakte-antigenen 7. Het is belangrijk op te merken dat MDSC goed worden bestudeerd in verschillende tumor-dragende hosts waar ze aanzienlijk worden uitgebreid en anti-tumor immuunrespons ten opzichte van naïeve collega&#39;s 7-10 te onderdrukken. Afhankelijk van de pathologische aandoening er verschillende subpopulaties MDSC met verschillende mechanismen en doelen van onderdrukking 11,12. Doeltreffende methoden levensvatbare MDSC populaties isoleren belangrijk in het ophelderen van de moleculaire mechanismen van onderdrukking in vitro en in vivo. Onlangs heeft de Ghansah groep heeft gemeld de uitbreiding van MDSC in een muizen alvleesklierkanker model. Onze tumor-dragende MDSC tonen een verlies van homeostase en een verhoogde onderdrukkende functie in vergelijking met naïeve MDSC 13. MDSC percentages zijn beduidend minder in de lymfoïde compartimenten van naïeve versus tumor-dragende muizen. Dit is een belangrijke voorbehoud dat vaak belemmert nauwkeurige analyse van deze vergelijkende MDSC. Daarom is het verrijken van Gr-1 + leukocyten van naïeve muizen voorafgaand aan Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) verhoogt de zuiverheid, de levensvatbaarheid en vermindert de soort tijd. Echter, verrijking van Gr-1 + leukocyten van tumor-dragende muizen is optioneel, omdat deze zijn er in overvloed voor een snelle FACS sorteren. Daarom is in dit protocol beschrijven we een zeer efficiënte methode voor het immunofenotypering MDSC en verrijkende Gr-1 + leukocyten van de milt van naïeve muizen voor het sorteren van MDSC tijdig. Immunocompetente C57BL / 6 muizen worden geënt met muizen Panc02 ceLLS subcutaan dat de naïeve muizen te ontvangen 1XPBS. Ongeveer 30 dagen na inoculatie; milt worden geoogst en verwerkt tot een cel suspensies behulp van een mobiele dissociatie zeef. Splenocyten worden dan rode bloedcellen (RBC) gelyseerd en een hoeveelheid van deze witte bloedcellen worden gekleurd met behulp van fluorochroom-geconjugeerde antilichamen tegen Mac-1 en Gr-1 tot immunofenotype MDSC percentages met behulp van flowcytometrie. In een parallel experiment worden hele leukocyten van naïeve muizen gekleurd met fluorescent geconjugeerde Gr-1 antilichamen, geïncubeerd met PE-microbolletjes en positief geselecteerde gebruikmaking van een automatische magnetische geactiveerde celsortering (autoMACS) Pro Separator. Vervolgens wordt een hoeveelheid van Gr-1 + leukocyten gekleurd met Mac-1-antilichamen aan de toename van MDSC percentages met behulp van flowcytometrie te identificeren. Nu deze Gr1 + verrijkte leukocyten klaar voor het sorteren van FACS MDSC worden gebruikt in vergelijkend analyses (naïeve tegen tumor-dragende) in in vivo en in vitro </em&gt; assays.

Dit is een snelle en uitgebreide methode van immunofenotypering myeloïde suppressor cellen (MDSC) en het verrijken van Gr-1<sup&gt; +</sup&gt; Leukocyten van muis milt. Deze methode maakt gebruik van flow cytometrie en AutoMACS celsortering te verrijken voor levensvatbare Gr-1<sup&gt; +</sup&gt; Leukocyten voor FACS sorteren van MDSC voor<em&gt; In vivo</em&gt; En<em&gt; In vitro</em&gt; Assays.

Voorbereiding van de myeloïde suppressor cellen (MDSC) van naïeve en pancreas tumor-dragende muizen met behulp van flowcytometrie en geautomatiseerde Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC's zijn een heterogene populatie van onrijpe macrofagen, dendritische cellen en granulocyten die zich ophopen in lymfoïde organen bij pathologische...

Het algemene doel van het volgende experiment is om snel een populatie GR1-positieve verrijkte leukocyten te genereren die levensvatbare myeloïde afgeleide suppressorcellen of MDSC's uit muismilten bevatten, voor gebruik in in vivo en in vitro assays. Eerst worden milten van meerdere muizen samengevoegd en verwerkt om een enkelcel-suspensie te genereren. Om het percentage MDSC's vóór de verrijking te kwantificeren, wordt een klein aliquot van de samengevoegde cellen overgebracht naar een 96-wells V-bodemplaat.MAC-1 en GR-1 oppervlakteantigenen worden gelabeld en de gelabelde cellen worden overgebracht naar FACS-buizen voor flowcytometrische analyse. De overgebleven gepoolde leukocyten worden gekleurd met een fluorochroom-geconjugeerd antilichaam tegen GR-1 en geïncubeerd met magnetische microbeads, die binden aan het fluorochroom op het anti-GR-1 antilichaam. De GR-1 positieve en GR-1 negatieve populaties worden vervolgens gescheiden met een AutoMax pro separator om het succes van de GR-1 verrijking van de populatie te beoordelen.Er wordt een klein aliquot afgenomen en geanalyseerd op de expressie van GR one en MAC one om de percentages MDSC te evalueren. Een vergelijking van de re

preparation-myeloid-derived-suppressor-cells-mdsc-from-naive

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In dit rapport beschrijven we een protocol voor het isoleren van zeer zuivere populaties van leucocyten dat tumoren te infiltreren. Dit protocol is een bewerking van de Miltenyi Biotech-protocol om opbrengst en zuiverheid voor het isoleren van cellen van complexe tumorweefsel te verbeteren.

Isolatie van immuuncellen van primaire tumoren

Er bestaan verschillende zeldzame populaties van dendritische celsubpopulaties in lymfoïde organen en daarom zijn ze lastig te isoleren in voldoende aantallen en zuiverheid voor immunologische experimenten. Hier beschrijven we een methode met hoge efficiëntie en hoog rendement voor het isoleren van alle momenteel bekende belangrijke subpopulaties van dendritische cellen in de milt van muizen.

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Wij rapporteren een protocol met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering met plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) met hoge zuiverheid uit het beenmerg van lupus-muizen gevoelig voor functionele studies pDC isoleren.

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

We laten zien hoe te identificeren en te isoleren 6 deelverzamelingen van myeloïde voorlopercellen uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een combinatie van magnetische en fluorescentie sorteren (MACS en FACS). Dit protocol kan worden gebruikt voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten en RNA/eiwit analyses.

Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

We beschrijven het gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) te beoordelen van de kwaadaardige potentieel van genetisch gemanipuleerde hematopoietische cellen. HSCT is handig voor de evaluatie van verschillende kwaadaardige hematopoietische cellen in vivo , alsmede het genereren van een grote cohort van muizen met myelodysplastic syndromes (MDS) of leukemie ter evaluatie van nieuwe therapieën.

Gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie te beoordelen van de oorsprong van myelodysplastisch syndroom

We beschrijven hier een protocol om te onderzoeken van de cytotoxiciteit van pre-geactiveerde CD8+ T cellen tegen kankercellen door het detecteren van apoptotic kanker cellen via real-time microscopie. Dit protocol kan mechanismen achter myeloïde cel-geïnduceerde T cel onderdrukking onderzoeken en evalueren van de verbindingen die zijn gericht op het aanvullen van T cellen via blokkade van onderdrukkende myeloïde immuuncellen.

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Hier presenteren we een protocol om primaire microglia te isoleren en te zuiveren in diermodellen van demyeliniserende ziekten, met behulp van kolomvormige magnetisch geactiveerde celsortering.

Isolatie van primaire microglia van muizen door magnetisch geactiveerde celsortering in diermodellen van demyelinisatie

We beschrijven een methode om tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's) van muizen te gebruiken door middel van flowcytometrie voor adoptieve celoverdracht. Dit protocol heeft tot doel de specifieke cytotoxiciteit van TIL's tegen tumoren in een syngene alvleesklierkanker muismodel te verifiëren en inzicht te verschaffen in de ontwikkeling van adoptieve celtherapieën voor alvleesklierkanker.

Op flowcytometrie gebaseerde isolatie en therapeutische evaluatie van tumor-infiltrerende lymfocyten in een muismodel van alvleesklierkanker

Een nauwkeurige en praktische methode om de parameters te meten achtige stam in myocardiale weefsel is van grote klinische waarde, want het is aangetoond, dat de stam is een meer gevoelige en eerder marker voor contractiele dysfunctie dan de vaak gebruikte parameter EF.

Magnetic Resonance Afgeleide myocard Strain Assessment Met behulp van functie Tracking

De identificatie van hersentumor initiëren cellen (BTICs), de zeldzame cellen binnen een heterogene tumor bezit stamcel eigenschappen, geeft nieuwe inzichten in de menselijke hersenen tumor pathogenese. We hebben verfijnd specifieke kweekomstandigheden te verrijken voor BTICs, en we routinematig gebruik van flowcytometrie om verder te verrijken deze populaties. Zelfvernieuwing en assays transcript analyse door eencellige RT-PCR kan vervolgens worden uitgevoerd op deze geïsoleerde cellen.

Verwerking van primaire hersentumor Weefsel voor Stem Cell Testen en Flow sorteren

Leer een snelle methode voor immunofenotypering van myeloïde suppressorcellen (MDSC) en verrijking van Gr-1+ leukocyten uit muizenspleten met behulp van flowcytometrie en AutoMACS-celsortering.

Voorbereiding van de myeloïde suppressor cellen (MDSC) van naïeve en pancreas tumor-dragende muizen met behulp van flowcytometrie en geautomatiseerde Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS) (Video) | JoVE Journal

Voorbereiding van de myeloïde suppressor cellen (MDSC) van naïeve en pancreas tumor-dragende muizen met behulp van flowcytometrie en geautomatiseerde Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

Meer video's verkennen