Name: Laag moleculair gewicht eiwitverrijking op mesoporeuze silica dunne films voor de ontdekking van biomarkers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Leer eiwitverrijking op mesoporeuze silica dunne films voor serumproteoomanalyse en biomarkerontdekking. Deze methode verbetert de detectie van laag moleculair gewicht peptiden voor diagnostische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door Alliantie van nanogeneeskunde Pre-centrum Award (W81XWH-11-2-0168) en Texas Center for Cancer Nanomedicine (1U54CA151668-01).

1. Chip Fabrication <ol><li> Creëren bekledingsoplossing voor de chip gaat uit van het gehydrolyseerde silicaat precursoroplossing. Meng 14 ml tetraethylorthosilicaat (TEOS) met 17 ml ethanol, 6,5 ml gedeïoniseerd water en 0,5 ml 6M HCl onder sterk roeren (1200 rpm) met een roer verwarmingsplaat. Verwarm deze oplossing bij 80 ° C gedurende 2 uur, waarbij het roeren constant. </li><li> Bereid polymeer oplossingen door de gewenste tri-blok coploymer (Pluronic F127, L121 en P123) aan 10 ml ethanol bij kamertemperatuur krachtig roeren. Vul het mengsel door toevoegen van 7,5 ml van het silicaat (uit stap 1.1) in de tri-blokcopolymeer oplossing gevolgd door 2 uur krachtig roeren bij kamertemperatuur. Dit is het laatste bekledingsoplossing. </li><li> Breng 1 ml bekledingsoplossing tot 4 inch siliciumplak door spin-coating met een snelheid van 1500 rpm gedurende 20 seconden. Vervolgens warmte bij 80 ° C gedurende 12 uur. </li><li> Verwarm de films naar biologische su te verwijderenrfactant door temperatuur 1 ° C per minuut tot 425 ° C en bakken gedurende 5 uur. </li><li> Behandel de mesoporeuze silica (MPS) chip oppervlak met zuurstof plasma verassing (Plasma Asher - March Plasma System). (O 2 Capaciteit: 80 sccm, vermogen: 300 W, tijd: 10 minuten). </li><li> Optioneel oppervlak chemische modificatie: silanate chips in 3% organosilaan een Methanol: DI water (19:1) oplossing gedurende 72 uur bij kamertemperatuur in een N2 handschoenkast. Spoel na elkaar met methanol en DI-water. Harden chips bij 110 ° C gedurende 15 minuten in een ventilator werkende oven. </li></ol> 2. Voorbeeld Voorbehandeling <ol><li> Voeg TFA en ACN elk serummonster zodanig dat de uiteindelijke concentratie 0,01% TFA en 5% ACN. Vortex om te mengen. </li><li> Schudden deze monsters op een tafel vortex schudder bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li></ol> 3. Serum Fractionering <ol><li> Pre-bak chips &#39;s nachts in een oven bij 160 ° C. Als alternatief, opslage de chips in een exsiccator totdat u ze gaat gebruiken om hydratatie van het oppervlak te voorkomen door het omringende water in de lucht. </li><li> Gebruik perslucht om stof deeltjes die op het oppervlak van de chip. </li><li> Snijd prefab, gekocht CultureWell chambered dekglaasje om het gewenste aantal putten op te nemen. Schoon dekglaasje met 100% ethanol en vervolgens plaats op MPS-chip oppervlak. Druk op dekglaasje neer met een tang om een ​​complete afdichting met chip te verzekeren. </li><li> Pipetteer 10 ui van het serum te brengen in elk 3 mm goed. Gedurende 30 minuten in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur. </li><li> Pipetteer up serum van putten en gooi ze weg. Pipetteer 10 pi gedeïoniseerd water aan elk putje wegwassen grotere eiwitten. Herhaal 4 keer. </li><li> Pipetteer 5 pi elutiebuffer (0,1% TFA + 50% ACN) aan elk monster goed. Pipetteer op en neer 30 keer tijdens het verplaatsen van de pipetpunt rond in de put om de elutiebuffer mengen. (Alleen elutiebuffer toepassing 1-2 monsters tegelijk met elutiebuffer voorkomenverdampen zo snel). </li><li> Na het mengen en pipetteer alle elutiebuffer en plaats in een microcentrifugebuis totdat u ze gaat MALDI-TOF-analyse uit te voeren. </li><li> Om de complexiteit van een biologisch monster emuleren en verrijking effect evalueren oogsten laagmoleculaire onze on-chip fractionering systeem we geselecteerd en geassembleerd standaard mengsel van proteïnen en peptiden toe zesentwintig verschillende soorten met een brede reeks molecuulgewichten (900-66 500 Da) en PI (4.0 tot 10.2) en concentraties (0,5-8 pmol / pl) (zie eiwit lijst in tabel 1). </li></ol> 4. MALDI-TOF analyse van peptiden <ol><li> Spot 0,5 pi van monster tot MALDI richtplaat en laten drogen. </li><li> Spot 0,5 pi matrix (α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA), 5 g / L) of verzadigde oplossing van trans-3 ,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic zuur (SA) in 50% acetonitrile met 0,1% TFA en laat co-kristallisatie. &lt;/ Li&gt; <li> Spot 0,5 pi van kalibratie-oplossing voor elke kalibratie plek en laten drogen. </li><li> Plaats richtplaat in de MALDI-TOF massaspectrometer. De machine moet worden ingesteld op een positieve reflector mode met een laser intensiteit van 4200 en 3000 schoten per monster. De geselecteerde massabereik is 800 tot 5000 Da met een doel massa van 2000 Da zijn. </li><li> Voer dezelfde MALDI-TOF-analyse in lineaire modus, maar veranderen de massa bereik tot 900 tot 10.000 Da of 3000 tot 70.000 Da en een doel massa van 5000 Da. </li></ol> 5. Data-analyse <ol><li> De ruwe spectra werden verwerkt met de ConvertPeakList software en de gegevens werden geëxporteerd naar software voor preprocessing SpecAlign. Alle spectra werden uitgelijnd met behulp van de PAFFT correlatie methode en intensiteiten werden genormaliseerd om de totale ionen stroom (TIC) in elke overeenkomstige spectrum. Alle spectra werden gladgestreken en de-ruchtbaar met een factor 4 en 0,5 respectievelijk. Pieken werden gedetecteerd met een uitgangswaarde van 0,5 massa venster 21 en hoogte-ratio 1,5, werden negatieve waarden verwijderd voor analyse. </li><li> Hiërarchische clustering werd uitgevoerd met behulp van Cluster 3,0 en gevisualiseerd met MapleTree software. MALDI MS Data (m / z intensiteit van de piek) werd log-getransformeerd, genormaliseerd, en de mediane gecentreerd. Pearson correlatie gebruikt om de afstand tussen de monsters berekend en volledige koppeling clustering uitgevoerd. </li><li> Een onafhankelijke Student T-test werd gebruikt voor vergelijking van groepen (n = 2 groepen) voor elke gedetecteerde piek MS voor ongecontroleerde hiërarchische clustering analyse. Een P-waarde van 0,02 of lager werd als significant beschouwd te differentieel geoogst peptiden en eiwitten kiezen uit de verschillende mesoporeuze proteomische chips (Grote poriën vs kleine poriën). </li></ol> 6. Representatieve resultaten Zoals getoond in figuur 1, in dit onderzoek gefabriceerd een reeks mesoporeuze silica dunne films met verschillende nanotextures en uitgebreid onderzocht deir gebruik selectief vastleggen en verrijking LMW peptiden en eiwitten van humaan serum. Figuur 2a en b tonen de MS spectra van de onbewerkte serummonster peptiden in het traject van 900 tot 10.000 Da en eiwitten in het bereik van 3000 Da ~ 70000 respectievelijk . Deze spectra illustreren het signaal onderdrukking in de LMW regio vanwege de aanwezigheid van de geïoniseerde, zeer overvloedige hoog molecuulgewicht (HMW) eiwitten zoals albumine. Figuur 2c en d tonen de MS spectra van het serummonster na fractionering door MPS L121 (poriegrootte 6 nm). De meeste grote moleculen zijn uitgeput, waardoor een aanzienlijke verrijking van LMW componenten. Als controle werd dezelfde serummonster aangebracht op een poreuze zuivere silica oppervlak om de specificiteit van MPS dunne films LMWP herstel evalueren. Zoals in figuur 2e en f, was er geen significante oogsten van pepvloed of proteïnen uit de poreuze silica. Aldus kan worden geconcludeerd dat het de mesoporeuze architectuur niet silica oppervlak affiniteit dat de overhand vormt, in de verrijking van LMWP. Nauwkeurig gecontroleerde variaties in poriegrootte kan worden bereikt door het gebruik van copolymeren met verschillende hydrofobe bloklengten. Door de ontworpen eiwitten en peptiden mengsel werd het effect van poriegrootte de LMW peptide en proteïne herstel werkzaamheid onderzocht met MPS dunne films vervaardigd uit vier Pluronic oppervlakteactieve (F127, P123, L121 en L121 plus zwelmiddel) met verschillende volumeverhoudingen van de hydrofiele en hydrofobe elementen te vormen respectievelijk poriegrootten van 3,7 nm, 5.2 nm, 7.4 nm, en 9.0 nm. Deze reeks poriegrootten tot het herstel van een andere repertoire van peptiden en eiwitten van dezelfde serummonster via grootte en vorm uitsluiting (figuur 3). Het eiwit spectra hoog molecuulgewicht demonstrate de moleculaire cut-off van elk type van de chip. Naast de grootte-afhankelijke uitputting van HMW proteïnen, de op de chip fractionering van de standaarden wordt een oplossing differentieel en selectieve verrijking van LMW soorten geassocieerd met de poriën. De tweezijdige hiërarchische clustering getoond in figuur 3b de LMW normen verrijking verkregen met de verschillende MSC. Zelfs indien de peptiden onder de moleculaire afkapwaarde van de chips, er een positieve correlatie tussen de poriegrootte en het molecuulgewicht van de gevangen soort. De MSC met grote poriën, tot 9 nm, bij voorkeur groter oogsten peptiden, terwijl de kleinere peptiden efficiënter gewonnen door de chips met kleinere poriën. De structurele transformatie van de mesoporeuze inrichting is uitgevoerd in door de concentratie van het sjabloon polymeer. De concentratie van de sjabloon polymeer tot een verminderde grensvlak kromming tussen de fasenvan het water, het copolymeer en het silicaat, zodat de inleiding van de onderling overgang van een bolvormig naar een cilindrische structuur. Pluronic F127, met hoog molecuulgewicht bezit deze hoge structurele periodiciteit. Door de concentratie van F127 in uitgangsoplossing kunnen verschillende MPS dunne film periodieke nanostructuren worden verkregen 3D nanostructuur naar 2D nanostructuur. De 3D kubieke en honingraat zeshoekige nanostructuren, die over een meer wenselijke nanogaatje interconnectiviteit en toegankelijker nanogaatje morfologie, vertonen superieure prestaties in selectief verrijken van LMW peptiden dan de 2D zeshoekige structuur, ook al zijn ze vergelijkbaar poriegrootte distributies en dezelfde moleculaire cut-off voor serum te delen fractionering (Figuur 4). We hebben ook gestroomlijnde de vervoeging van organo-silaan op MPS chips door de invoering van zuurstof plasma verassen op de chip oppervlak voorbehandelen. Met het oog op kwalitatief studie van de elektrostatisch effect op bepaaldeive on-chip verrijking, gebruiken we de eiwitten en peptiden mengsel. MS analyse van de proteomics normen oplossing gefractioneerd op MPS chips bereid met L121 en geconjugeerd met de chemische functionele groepen is weergegeven in figuur 5. De positief geladen en negatief geladen de peptiden en eiwitten LMW opgevangen op de anionogene en kationogene de chips respectievelijk. De kwantitatieve vergelijking van de verschillende MPS-chips bij het ​​terugvinden van de peptiden met een positieve netto-lading wordt weergegeven in figuur 5a. De chips met negatieve lading en de chips zonder wijziging (een kleine negatieve lading oorspronkelijk) vertonen aanzienlijk hogere verrijking voor deze peptiden dan chips gemodificeerd met APTES (-NH2). Omgekeerd, de positief geladen MPS-chips beschikken over een uitzonderlijke mogelijkheid om die peptiden herstellen met negatieve netto-lading, zoals aangetoond in figuur 5b. Terwijl α-endorfine toont geen significante verandering due zijn PI ongeveer 6. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig1.jpg" /> Figuur 1. Principe van MPS chips fractionering en LMW verrijking. Na monster vlekken aan het oppervlak worden LMW eiwitten en peptiden in de poriën ingesloten terwijl de grotere soorten steeds buiten de poriën en worden verwijderd tijdens de wasstappen. De verrijkte fracties worden vervolgens geëlueerd en geanalyseerd door MALDI. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig2.jpg" /> Figuur 2. Peptide verrijking met behulp van de mesoporeuze silica dunne film chips. MALDI MS profielen in zowel de lage massa bereik (900 tot 10 000 Da) en de hoge massabereik (3000 tot 70 000 Da) vóór (a, b) en na (c, d) serum verwerking op mesoporeuze silica dunne films ( L121, 6 nm). De moleculaire herstel wordt aanzienlijk verminderd door het gebruik van lege niet-poreuze silica oppervlakken (e, f). <img alt="Figuur 3" src=&quot;/ Files/ftp_upload/3876/3876fig3.jpg&quot; /&gt; Figuur 3. Moleculaire cut-off en de grootte-afhankelijke verrijking van de MPS chips. (A) vergroot aanzicht van de MALDI spectra waaruit de karakteristieke moleculaire afkapwaarde van elk MPS chips correleren de poriëngrootte. (B) Twee-weg hiërarchische clustering van het peptide mix functies tussen de verschillende chips. De intensiteit van de rode en gele kleur geeft de relatieve peptide concentratie. Grote poriën versterkt het oogsten van grotere peptiden (3600 tot 8500 Da), terwijl de kleine peptiden (900 tot 3500 Da) werden voorkeur gewonnen uit de chips met kleinere poriën. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig4.jpg" /> Figuur 4. Fysieke karakteriseringen van MPS dunne films en selectief herstel met verschillende nanostructuren. XRD patronen (a, b, c), TEM (inset a, b, c) Pluronic F127 bij verschillende concentraties in de precursoroplossing: 4,0 x10 3 M (a), 6,0 x 10 ~ 3 M (b) en 8,0 x 10 -2 M (c). (D) Bar grafiek van de intensiteit van detectie ter illustratie van de selectieve peptiden herstel op 3D kubieke en 3D zeshoekige F127 proteomische chips (Cub en Hex, respectievelijk). De verschillende structurele wijzigingen vormen een selectieve verrijking. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig5_lg.jpg"><img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig5.jpg" /></a> Figuur 5. Charge-specifieke herstel van de chips met verschillende oppervlakte functies. Staafdiagram van de MS intensiteit van detectie van selectief gevangen peptiden op het gefunctionaliseerde chips. Volgens de iso-elektrische punt, de peptiden positief of negatief geladen bij pH 7,0. (A) Positief peptiden ((1) des-Arg1-bradykinine, (2) bradykinine, (3) substance P-amide, (4) neurotensine, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 - 38)) zijn speciaal verrijkt de negatief geladen surgezichten. (B) Negatieve peptiden ((7) Glu1-fibrinopeptide B (8) α-endorfine, (9) ACTH (18-39) (10) insuline (11) EGF (12) insuline-achtige GFII) zijn specifiek verrijkt de positief geladen oppervlakken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig6_lg.jpg"><img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig6.jpg" /></a> Figuur 6. On-chip stabilisatie van gefractioneerde serum. (A) Vertegenwoordiger MALDI profielen LMW peptiden en eiwitten geëlueerd onmiddellijk na serum fractionering (boven) en na 3 weken van on-chip opslag bij kamertemperatuur (onder). (B) Van boven naar beneden: Lineaire regressie-analyse van de gemiddelde intensiteiten van de gedetecteerde MS pieken in elke replicaatbak in vergelijking met 1 repliceren voor vers gefractioneerde serum en gefractioneerde serum na 3wk MPS chips opslag bij kamertemperatuur. Vergelijking, CV en determinatiecoëfficiënt (R 2) zijn aangegeven.

<ol><li>Wulfkuhle, J. D., Liotta, L. A., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+applications+for+the+early+detection+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Proteomic applications for the early detection of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 267-275 (2003).</li>
<li>Etzioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+early+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The case for early detection.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 243-252 (2003).</li>
<li>Hanash, S. M., Pitteri, S. J., Faca, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+plasma+proteome+for+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mining the plasma proteome for cancer biomarkers.</a> Nature. 452, 571-579 (2008).</li>
<li>Liotta, L. A., Ferrari, M., Petricoin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+proteomics%3A+written+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clinical proteomics: written in blood.</a> Nature. 425, 905-905 (2003).</li>
<li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood+peptidome%3A+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 961-967 (2006).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+plasma+proteome%3A+history%2C+character%2C+and+diagnostic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell Proteomics. 1, 845-867 (2002).</li>
<li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li>
<li>Liu, H., Sadygov, R. G., Yates, J. R., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+random+sampling+and+estimation+of+relative+protein+abundance+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics.</a> Anal. Chem. 76, 4193-4201 (2004).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics%3A+old%2C+old+fashioned%2C+but+it+still+climbs+up+the+mountains%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains.</a> Proteomics. 2, 3-10 (2002).</li>
<li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+of+the+nanotexture+of+mesoporous+silica+films+and+their+functionalized+derivatives+for+selectively+harvesting+low+molecular+weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Tailoring of the nanotexture of mesoporous silica films and their functionalized derivatives for selectively harvesting low molecular weight protein.</a> ACS Nano. 4, 439-451 (2010).</li>
<li>Bouamrani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+silica+chips+for+selective+enrichment+and+stabilization+of+low+molecular+weight+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mesoporous silica chips for selective enrichment and stabilization of low molecular weight proteome.</a> Proteomics. 10, 496-505 (2010).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Het bewijs is dat de montage van laag moleculair gewicht regio van de bloedsomloop proteoom is een rijke bron van diagnostische biomarkers voor de vroege opsporing van de ziekte. In deze technologie stelden wij een reeks mesoporeuze silica chips met verschillende poriën poriestructuren en wijzigingen selectief verrijken peptiden en laagmoleculaire eiwitten. Om eiwitstabiliteit evalueren, werden de MPS chips geïncubeerd met menselijk serum, gedroogd na wassen en opgeslagen 3wk bij kamertemperatuur. De verkregen eiwit / peptide patronen waren vergelijkbaar met die van verse gefractioneerde serum (figuur 6a), zoals blijkt uit de resultaten van de statistische analyse bleek in figuur 6b. De variabiliteit van de piek signalen gemeten aan de hand van de gemiddelde CV werd geschat op 12,7% voor ruwe serum en op 14.2% voor de gefractioneerde monsters. De marginale verschillen kunnen te wijten zijn aan de interne variabiliteit van de MALDI instrument en stelde voor dat de on-chip voorbehandeling en de bewaring veroorzaakte geen significante wijziging van de MS eiwitprofielen. Hetzelfde experiment werd uitgevoerd op niet-poreuze silicium. De gedroogde serum hersteld na opslag op silicium oppervlak werd gefractioneerd op de MPS chips, vooraleer MALDI-analyse. De arme MS profiel verkregen aangetoond dat de stabilisatie voordeel van de mesoporeuze oppervlak. In analogie met de eerder veronderstelde mechanismen, we veronderstellen dat de LMW soort gevangen in de nanoporiën werden bewaard tegen degradatie door de grootte uitsluiting van proteasen, of door sterische belemmering van hun proteolytische activiteit in de beperkte ruimte van de nanoporiën. De MPS-chip gebaseerde methode kan een krachtig instrument in de peptide en proteïne LMW profilering van complexe biologische vloeistoffen studie zijn. De MPS-chips zijn goedkoop te produceren en zorgen voor de productie opgeschaald tot de gelijktijdige verwerking van een groot aantal monsters te bereiken, het verstrekken van voordelige eigenschappen voor de experimentele screening en biomarker ontdekking.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Tetraethoxysilaan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 131903 </td><td> 98% </td></tr><tr><td> Spin coater </td><td> Brewer Science </td><td> Cee 200X </td><td></td></tr><tr><td> Plasma Asher </td><td> Nordson maart </td><td> AP-600 </td><td></td></tr><tr><td> Spectroscopische ellipsometer </td><td> JA Woollam Co </td><td> M-2000DI </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> Applied Biosystems </td><td> Voyager-DE-STR </td><td></td></tr><tr><td> α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur </td><td> Sigma-Aldrich Co </td><td> C8982 </td><td> Matrix voor MALDI-TOF </td></tr><tr><td> trans-3 ,5-dimethoxy-4-hydroxykaneelzuur </td><td> Sigma-Aldrich Co </td><td> 85429 </td><td> Matrix voor MALDI-TOF </td></tr><tr><td> Roer hete plaat </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11 tot 475-30Q </td><td></td></tr><tr><td> CultureWell chambered dekglaasje </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> GBL103350 </td><td> 3 mm diam. × 1 mm diepte, 3-10 uL, steriele </td></tr><tr><td> Pluronic F 127 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 106 PPO 70 PEO 106 </td></tr><tr><td> Pluronic L121 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 5 PPO 70 PEO 5 </td></tr><tr><td> Pluronic P123 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 20 PPO 70 PEO 20 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Fysisch-chemische eigenschappen en ontworpen concentraties (molecuulgewicht en Iso-Elektrisch punt) van het geselecteerde peptide en proteïne normen.

laag moleculair gewicht eiwitverrijking op mesoporeuze silica dunne films voor de ontdekking van biomarkers

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

De identificatie van circulerende biomarkers belangrijke mogelijkheden voor niet-invasieve benaderingen vroege diagnose en prognose, alsmede voor de bewaking van therapeutische efficiëntie. 1-3 Het circulerende laagmoleculaire proteoom (LMWP) bestaat uit kleine proteïnen werpen van weefsels en cellen of peptide fragmenten uit de proteolytische afbraak van grotere eiwitten geassocieerd met de pathologische toestand patiënten waarschijnlijk overeenstemming met de stand van de ziekte. 4,5 Ondanks deze potentiële klinische toepassingen, het gebruik van massaspectrometrie (MS) profiel van de LMWP van biologische vloeistoffen heeft bewezen zeer niet eenvoudig om groot dynamisch bereik van eiwitten en peptiden in serum. 6 Zonder monster voorbehandeling sommige van de meer voorkomende eiwitten verduisteren de detectie van lage overvloed species in serum / plasma. Current proteomics benaderingen zoals tweedimensionale polyacrylamidegel-electrophoresis (2D-PAGE) en shotgun proteomics methoden zijn arbeidsintensief, lage omzet en bieden beperkte geschiktheid voor klinische toepassingen. 7-9 Daarom is een meer effectieve strategie die nodig is om LMWP isoleren uit het bloed en de &#39;high throughput screening van klinische monsters laten . Hier presenteren we een snelle, efficiënte en betrouwbare multi-fractionering op basis van mesoporeuze silica chips om specifiek te richten en te verrijken LMWP. 10,11 mesoporeuze silica (MPS) dunne films met afstelbare eigenschappen op nanoschaal werden vervaardigd met behulp van de triblokcopolymeer template pad . Met andere polymeer sjablonen en polymeerconcentraties in de precursoroplossing, werden verschillende poriegrootte verdelingen poriestructuren, verbindingen en oppervlakte-eigenschappen bepaald en toegepast voor selectief herstel van lage massa eiwitten. De selectieve ontleding van de verrijkte peptiden in verschillende subklassen volgens de fysisch-chemische eigenschappen zal enHance de efficiëntie van het herstel en de opsporing van lage overvloed soorten. In combinatie met massaspectrometrie en statistische analyse hebben we aangetoond dat de correlatie tussen de nanoschaal kenmerken van de mesoporeuze silica dunne films en de specificiteit en de doeltreffendheid van lage massa proteoom oogsten. De resultaten die hierin tonen het potentieel van de nanotechnologie gebaseerde technologie om een ​​krachtig alternatief voor conventionele methoden voor LMWP oogsten bieden van complexe biologische vloeistoffen. Door de mogelijkheid om de eigenschappen van het materiaal af te stemmen, de mogelijkheid voor low-cost productie, de eenvoud en de snelheid van monstername en de sterk gereduceerde monster voor analyse, zal deze roman nanotechnologie aanzienlijk invloed hebben op het gebied van proteomics biomarker onderzoek en klinische proteomics beoordeling.

Wij ontwikkelden een technologie op basis van silica mesoporeuze dunne film voor het selectief herstel van laagmoleculaire peptiden en eiwitten van humaan serum. De fysisch-chemische eigenschappen van onze mesoporeuze chips zijn volledig afgestemd op grote controle in peptide verrijking &#39;en derhalve profiel van de serum proteoom voor diagnostische doeleinden.

Laag moleculair gewicht eiwitverrijking op mesoporeuze silica dunne films voor de ontdekking van biomarkers

De identificatie van circulerende biomarkers biedt een groot potentieel voor niet-invasieve benaderingen bij vroege diagnose en prognose, evenals voor de ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een technologie op basis van een mesoporeuze silica-dunne film voor de selectieve terugwinning van eiwitten en peptiden met een laag molecuulgewicht uit menselijk serum. Dit wordt bereikt door eerst chips met een mesoporeuze silica-dunne film te vervaardigen en deze voor te behandelen met zuurstofplasma-ashing. De tweede stap bestaat uit een eenvoudige voorbehandeling van het serum, waarna de eiwitten en peptiden met een laag molecuulgewicht uit het serum worden verrijkt door middel van on-chip fractionering.Na elutie van de eiwitten en peptiden met een laag molecuulgewicht van de chip, worden de moleculen geprofileerd met behulp van matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight massaspectrometrie. De laatste stap is het gebruik van professionele software voor de data-analyse. Uiteindelijk onthullen de massaspectra en de statistische analyseresultaten de specificiteit en effectiviteit van het oogsten van het proteoom met een laag molecuulgewicht.Het belangrijkste voordeel van deze technieken ten opzichte van bestaande technologieën, zoals 2D-PAGE en Western blotting, omvat het sterke vermogen om laag abundante eiwitten en peptiden met een laag molecuulgewicht in serum te verrijken, de hoge doorvoer en tijdefficiëntie, de vermindering van de vereiste serumhoeveelheid en de lage kosten. Een van de meest uitdagende aspecten van deze procedure is het beheersen van de morfologie van het nanoporenetwerk, zoals de poriegrootteverdeling, de porievorm en de onderlinge verbondenheid van de poriën. Deze kenmerken bepalen immers de sensitiviteit en specificiteit van het profileren van de doelbloedsignatuur.Om de nauwkeurigheid te waarborgen, streven we ernaar de modelratio van het startmateriaal zorgvuldig te controleren en de instructies nauwgezet te volgen voor het maken van de coatingoplossing voor de chip. Begin met het bereiden van de gehydrolyseerde silicaatprecursoroplossing. Meng 14 milliliters TEOS met 17 milliliters 200 proof ethanol, 6,5 milliliters gedeïoniseerd water en 0,5 milliliters zes molar zoutzuur onder krachtig roeren.Zet het krachtige roeren voort en verhit de resulterende oplossing gedurende twee uur bij 80 °C. Bereid vervolgens de triblok-copolymeeroplossing door de gekozen polymeeroplossing onder krachtig roeren toe te voegen aan 10 ml ethanol bij kamertemperatuur. In deze demonstratie wordt onic F1 27 gebruikt.Voltooi het mengsel door de silicaatoplossing aan dit tri-block copolymeer toe te voegen, gevolgd door twee uur krachtig roeren bij kamertemperatuur. Breng één milliliter van de resulterende coatingsolutie aan op een silicon wafer van vier inch via spin-coating met een snelheid van 1, 500 RPM gedurende 20 seconden. Verwarm de wafer vervolgens 12 uur lang bij 80 °C.Verhoog vervolgens de temperatuur met één graad Celsius per minuut tot 425 °C is bereikt en bak gedurende vijf uur bij deze temperatuur. Behandel daarna het oppervlak van de resulterende mesoporeuze silica- of MPS-chip met zuurstofplasmabranden. Meet vervolgens de filmdikte en de porositeit met een oxometer.Voeg ondertussen aan elk serummonster trifluorazijnzuur toe tot een eindconcentratie van 0,01% en acetonitril tot een eindconcentratie van 5%. Schud deze monsters vervolgens 30 minuten lang op een tafelvortexschudder bij kamertemperatuur, nadat de chips een nacht lang in een oven bij 160 °C zijn voorgebakken. Gebruik perslucht om eventuele deeltjes die zich op het oppervlak van de chip bevinden te verwijderen. Reinig het dekglas met 100% ethanol en plaats dit op het oppervlak van de NPS-chip om de monsterputjes te creëren.Druk het dekglas met een pincet aan om een volledige afdichting met de chip te waarborgen. Pipetteer vervolgens 10 µL serummonster in elke well. Incubeer gedurende 30 minuten in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur om de eiwitten met een laag molecuulgewicht de poriën te laten binnendringen. Aspireer na de incubatie het serum uit de wells en gooi dit weg.Pipetteer vervolgens 10 µL gedeïoniseerd water in elke put om grotere eiwitten weg te wassen. Herhaal deze wasstap vier keer, waarbij slechts één tot twee putten tegelijk worden behandeld. Voeg om verdamping te voorkomen snel 5 µL elutiebuffer toe aan elk monster.Pipette 30 keer op en neer terwijl de pipetpunt in de well wordt bewogen om te mengen. Aspireer na het mengen alle elutiebuffer en breng dit over in een microcentrifugebuis tot het tijd is voor matrix-assisted laser desorption ionization time of flight-analyse. Voer de MALDI-TOF-analyse uit door 0,5 µL van het monster op de MALDI-targetplaat te spotten en te laten drogen; spot vervolgens 0,5 µL matrix in 50% acetonitril met 0,1% TFA en laat dit co-kristalliseren. Spot daarna 0,5 µL kalibratie-oplossing op de kalibratiespot. Plaats de targetplaat na het drogen in de MALDI-massaspectrometer.Het apparaat moet worden ingesteld op de positieve reflectormodus met een laserintensiteit van 4 en 203.000 shots per monster. Voer eerst de analyse uit met een geselecteerd massa-bereik van 800 tot 5.000 Dalton en een doelmassa van 2000 Dalton. Voer vervolgens dezelfde MALDI-TOF-analyse uit in lineaire modus, maar wijzig het massa-bereik naar 900 tot 10.000 Dalton of 3000 tot 70.000 Dalton met een doelmassa van 5.000 Dalton.Verwerk na het multi top analyseproces de ruwe spectra met de convert peak list-software en exporteer deze vervolgens naar specal. Gebruik voor de voorverwerking de Align-software om alle spectra uit te lijnen met de peak alignment by fast Fourier transform of de P-A-F-F-T correlatiemethode, en normaliseer de intensiteiten naar de totale ionenstroom. Voer de piekdetectie uit met een hoogteratio van twee en 0,3% van het massavenster.Corrigeer de basislijn en verwijder de negatieve waarden vóór de analyse. Het importeren van T 2D-bestanden in de marker view is de eerste stap voor de gesuperviseerde verwerking van MALDI-gegevens van verschillende groepen. Begin met het openen van de marker view-software en importeer vervolgens de T 2D-bestanden.Selecteer de map met de T 2D-bestanden en stel de parameters voor de spectraverwerking in. Open vervolgens de monsterlijst. Markeer de monsters uit dezelfde groep en maak een groepslabel aan.Normaliseer de monsters met behulp van de totale oppervlaktesommen. Open vervolgens het optiesvenster. Stel een unieke kleur en een uniek symbool in voor elke groep.Voer vervolgens een principale componentenanalyse en een T-test uit, waarbij de actieve datasamples in verschillende groepen worden verdeeld op basis van de scores van PC één en PC twee. De biomarker-kandidaten worden bepaald aan de hand van de PC-loading plots, die een samenvatting geven van het intensiteitsprofiel van de geselecteerde biomarker door te klikken op de profielplots voor de geselecteerde pieken. Punten met hogere waarden kunnen verschillende groepen onderscheiden.Sorteer na het vergelijken van groepen met een T-test de tabel op oplopende P-waarden om de pieken te bepalen die verschillende groepen kunnen onderscheiden; hier worden de MS-spectra van het serummonster getoond voor peptiden in het bereik van 900 tot 10.000 Daltons, en voor eiwitten in het bereik van 3000 tot 70.000 Daltons. De spectra van de onbewerkte monsters illustreren de signaalonderdrukking in het gebied van het lage molecuulgewicht door de aanwezigheid van goed geïoniseerde, zeer overvloedige eiwitten met een hoog molecuulgewicht, zoals albumine; na fractionering door de MPS-dunne films is het merendeel van de grote moleculen verwijderd, wat resulteert in een significante verrijking van de componenten met een laag molecuulgewicht. Als controle werd hetzelfde serummonster aangebracht op een niet-poreus oppervlak van puur silica.Om de specificiteit van MPS-dunne films voor het herstel van het proteoom met een laag molecuulgewicht te evalueren, werd vastgesteld dat er geen significante oogst van peptiden of eiwitten plaatsvond vanaf de niet-poreuze silica. Hieruit kan worden geconcludeerd dat de mesoporeuze architectuur, en niet de affiniteit van het silica-oppervlak, de bepalende factor is bij de verrijking van LMWP. Nauwkeurig gecontroleerde variaties in poriegrootte kunnen worden gerealiseerd door het gebruik van copolymeren met verschillende hydrofobe bloklengtes.Het effect van de poriegrootte op de efficiëntie van het herstel van LMW-peptiden en eiwitten werd onderzocht met behulp van MPS-dunne films, geprepareerd uit vier onische surfactanten met verschillende volumeverhoudingen van de hydrofobe en hydrofiele componenten. Hier wordt een vergroot aanzicht van de MALDI-spectra getoond, waarin de karakteristieke moleculaire cutoff van elke MPS-chip wordt aangetoond, wat correleert met de poriegrootte. Het bereik van de poriegroottes leidde via grootte- en vormuitsluiting tot het herstel van een verschillend repertoire aan peptiden en eiwitten uit hetzelfde serummonster.Dit kan ook worden waargenomen in de tweewegs hiërarchische clustering van de kenmerken van de peptidemicst tussen de verschillende chips. De intensiteit van de rode of gele kleur geeft de relatieve peptideconcentratie aan. Grotere poriën verbeterden de opbrengst van grotere peptiden, terwijl kleine peptiden bij voorkeur werden teruggewonnen uit de chips met kleinere poriën.Verschillende MPS-dunne film periodieke nanostructuren gevormd met tri-blokcopolymeren met een hoog molecuulgewicht, zoals onic F1 27 met vergelijkbare poriegrootteverdelingen, kunnen worden verkregen door de polymeersamenstelling in de precursoroplossing aan te passen. De 3D-kubische en honingraat-hexagonale nanostructuren bezitten een gunstigere nanoporie-interconnectiviteit en een meer toegankelijke nanoporie-morfologie. Als gevolg hiervan vertonen zij een superieure prestatie bij het selectief verrijken van LMW-peptiden dan de 2D-hexagonale structuur.Dit is het geval, ondanks dat ze vergelijkbare poriegrootteverdelingen en dezelfde moleculaire afsnijwaarde voor serumfractionering delen. De conjugatie van Organy lane op MPS-chips werd gestroomlijnd door de introductie van oxygen plasma ashing om het chipoppervlak voor te behandelen. Deze figuur demonstreert het lading-specifieke herstel voor de chips met verschillende oppervlaktefuncties via een staafdiagram van de MS-intensiteit van de detectie van selectief gevangen peptiden op de gefunctionaliseerde chips.Op basis van hun isoelektrisch punt zijn de peptiden bij pH 7,0 positief of negatief geladen, naast de uitputting van eiwitten met een hoog molecuulgewicht. De resultaten tonen aan dat het structurele ontwerp en de chemische functionalisering van de NPS de specificiteit van de peptideverrijking verder hebben verhoogd. Met deze ontwikkeling.Wij verwachten dat deze techniek de weg vrijmaakt voor onderzoekers op het gebied van proteomics om nieuwe biomarkers te verkennen voor vroege diagnose of therapeutische evaluatie in de vloeistoffen van het lichaam bij menselijke en dierlijke modellen. Bijgevolg zal dit leiden tot een verbeterde gepersonaliseerde behandeling van belangrijke ziekten.

low-molecular-weight-protein-enrichment-on-mesoporous-silica-thin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een begeleide materiaal screening benadering van sol-gel afkomstig eiwit gedoteerde microarrays met behulp van een opkomende methode pin-drukken van fabricage ontwikkeling wordt beschreven. Deze methode wordt aangetoond door de ontwikkeling van acetylcholinesterase en multikinaseremmer microarrays, die voor rendabele kleine moleculen screening.

A Guided Materialen Screening aanpak voor de ontwikkeling van kwantitatieve Sol-gel Afgeleid Eiwit Microarrays

We beschrijven een werkwijze voor het profileren speekseleiwitten met multiplex-microsfeer gebaseerde antilichaam arrays. Monoklonale antilichamen werden covalent gebonden aan fluorescerende kleurstof gecodeerd 4,5 urn polymere microsferen middels carbodiimide chemie. De gewijzigde microsferen werden afgezet in glasvezel-microwells eiwit niveaus in het speeksel te meten met behulp van fluorescentie sandwich immunoassays.

Multiplexed Fluorescent Microarray voor menselijk speeksel bij Eiwit analyse met behulp van Polymer microsferen en Glasvezel-Bundles

Verschillende pathologische biomarkers kunnen niet gemakkelijk worden gedetecteerd door huidige technieken vanwege hun lage concentratie in biologische vloeistoffen, de aanwezigheid van degraderende enzymen en grote hoeveelheden eiwitten met een hoog molecuulgewicht. Chemisch gefunctionaliseerde hydrogel-nanodeeltjes kunnen eiwitten met een lage abundantie verzamelen, bewaren en concentreren, waardoor de detectie van voorheen ondetecteerbare biomarkers mogelijk wordt.

Hydrogel Nanoparticle Oogsten van plasma of urine voor het opsporen van Low Overvloed Eiwitten

Een procedure voor de bereiding van poreuze hybride scheidingsmedia, bestaande uit een macroporeuze polymeermonoliet intern gecoat met een microporeuze coördinatiepolymeer met een groot oppervlak, wordt gepresenteerd.

Voorbereiding van de zeer poreuze Coordination Polymer Coatings op Macroporeuze Polymer Monoliths voor Enhanced Verrijking van fosfopeptiden

Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van lage overvloedige molecules in complexe oplossingen met behulp van moleculaire inprenting in combinatie met een capaciteit biosensor.

Ultrasensitive detectie van Biomarkers met behulp van een moleculaire Imprinting gebaseerd capacitieve Biosensor

Hier presenteren we een protocol om te synthetiseren van bioinspired silica materialen en immobiliseren enzymen daarin. Siliciumdioxide wordt gesynthetiseerd door natrium-silicaat en een amine 'levensmiddelenadditief', die met een gecontroleerde snelheid neutraliseren te combineren. Materiaaleigenschappen en functie kunnen worden gewijzigd door in situ enzym immobilisatie of post synthetische zure elutie van ingekapselde additieven.

Voorbereiding van functionele Silica met behulp van een methode Bioinspired

Hier presenteren we een protocol bij scherm extracellulaire proteïne microarrays voor de identificatie van nieuwe receptor-ligand interacties in hoge-doorvoer. Ook beschrijven we een methode ter verbetering van de opsporing van voorbijgaande eiwit-eiwitinteractie met behulp van eiwit-microbead complexen.

Extracellulaire eiwit Microarray technologie voor detectie van High Throughput van lage affiniteit Receptor-Ligand interacties

Een protocol voor de bereiding van poly (pentafluorfenyl acrylaat) (poly(PFPA)) geënt silica kralen wordt gepresenteerd. Vervolgens wordt het functionalized oppervlak van poly(PFPA) geïmmobiliseerd met antilichamen en met succes gebruikt voor de scheiding van de eiwitten door middel van immunoprecipitation.

Voorbereiding van Poly(pentafluorophenyl acrylate) matiemaatschappij SiO2 parels eiwitreiniging

Dit protocol laat zien hoe de kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV's) van menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kunnen worden geïsoleerd met een eenvoudige benchtop-instelling op laboratoriumschaal. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, sEV-markers en morfologie van geïsoleerde hUC-MSC-sEV's worden gekenmerkt door respectievelijk nanodeeltjestrackinganalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop.

Een eenvoudige benchtop-filtratiemethode om kleine extracellulaire blaasjes te isoleren van menselijke mesenchymale stamcellen

Dit protocol beschrijft een CRISPR-Cas-gemedieerde, multianalyte synthetische urine biomarker test die point-of-care kankerdiagnostiek mogelijk maakt door middel van de ex vivo analyse van tumor-geassocieerde protease-activiteiten.

CRISPR-Cas-gemedieerde Multianalyte Synthetische Urine Biomarker Test voor Draagbare Diagnostiek

Leer eiwitverrijking op mesoporeuze silica dunne films voor serumproteoomanalyse en biomarkerontdekking. Deze methode verbetert de detectie van laag moleculair gewicht peptiden voor diagnostische toepassingen.

Laag moleculair gewicht eiwitverrijking op mesoporeuze silica dunne films voor de ontdekking van biomarkers

Meer video's verkennen