Name: Aviditeit op basis van extracellulaire Interactie Screening (AVEXIS) voor de Scalable detectie van lage-affiniteit extracellulaire receptor-ligand interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Leer AVEXIS voor het detecteren van zwakke extracellulaire receptor-ligand interacties met behulp van een recombinant eiwitbibliotheek. Deze methode helpt onderzoekers bij het identificeren van nieuwe bindingspartners voor membraaneiwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Wellcome Trust subsidie ​​nummer [077108] toegekend aan GJW.

1. Het samenstellen van een bibliotheek van Bait and Prey Plasmide-expressievectoren <ol><li> Stel een lijst celoppervlaktereceptor en uitgescheiden eiwitten van belang te gescreend interacties en ophalen de sequenties van een geschikte eiwitsequentie database. De eiwitten die het N-terminale signaalpeptide secretorische geschikt (deze omvatten type I GPI gekoppeld en uitgescheiden eiwitten). Gewoonlijk is een eiwitfamilie (bijvoorbeeld immunoglobulinesuperfamilie of de receptoren tot een specifiek celtype zoals erythrocyten) geselecteerd. </li><li> Bepaal de omvang van de extracellulaire gebieden identificeert de locatie van het signaalpeptide en transmembraan gebied met proteïne kenmerk voorspelling software. Wij gebruiken meestal de SignalP v3.0 5 en TMHMM v2.0 6. </li><li> Ontwerp primersets dat de gehele ectodomein fragment elke receptor versterken. Wij hebben een reeks lokaas en prooi vectoren die voor dit doel geschikt die eenerkrijgbaar van Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/">http://www.addgene.org/~~V</a> ). Ontwerp de sense primer rond het begin methionine een Notl restrictie-enzym site en een optimale Kozak sequentie omvatten, die wordt gevolgd door 25 baseparen exact gen sequentie (Fig. 2A). </li><li> Ontwerp de antisense primer type I receptor eiwitten afkappen vlak voor de voorspelde transmembraangebied zodat de gehele ectodomein als oplosbaar recombinant eiwit tot expressie. Voeg een Ascl restrictieplaats in deze primer die vervolgens zou zich moeten vertalen in frame van een C-terminale rat Cd4d3 +4 eiwit tag 7 (Fig. 2A). </li><li> Amplify de ectodomein fragmenten uit alle genen met behulp van deze primers en klonen ze in het aas of prooi vector. We vinden het soms handig om ze eerst te klonen in de shuttle worden geblokkeerd voordat subklonering in een geschikte zoogdier expressievector, hebben we een afgeleide van de pTT3 vector 3,4 te gebruiken. Zowel het aas en prooi vectoren contain C-terminale eiwitlabels als volgt (fig. 2B). <ol><li> Aas: Een tag met domeinen 3 en 4 van de rat CD4 (Cd4d3 +4) eiwit, gevolgd door een peptidesequentie die een substraat voor het E.coli BirA enzym kan dus monobiotinylated een specifiek lysineresidu (Fig. 2B) . De Cd4d3 +4 tag wordt herkend door de OX68 monoklonale antilichaam wordt gebruikt om de expressie van het lokaas eiwitten door ELISA kwantificeren. Het lokaas eiwitten zijn dus monomere en monobiotinylated. Extra lokaas eiwit vectoren waarin het peptide biotinylatable vervangen door een 6-tag zijn voor zuivering zijn. </li><li> Prooien: prooien ook een rat Cd4d3 +4 tag gevolgd door een peptide sequentie van de rat kraakbeen oligomere matrixeiwit (COMP) en een C-terminaal β-lactamase enzym. De COMP peptide zorgt ervoor dat de prooi vormen pentamers een keer uitgedrukt (Fig. 2B). </li></ol></li></ol> 2. Prey-en Bait-eiwitexpressie We maken gebruik vaneen geschikte hoge expressie systeem met suspensiekweek van de HEK293E cellijn 4 van eiwit bibliotheken te produceren, maar elk zoogdier-expressie-systeem dient geschikt. Een commercieel beschikbare alternatief is de Freestyle systeem. Cellen gekweekt worden routinematig op een schudplateau (125 opm) bij 37 ° C, 5% CO2 70% relatieve vochtigheid. Zowel positieve als negatieve controle eiwitten moeten ook worden uitgedrukt. De rat Cd4d3 +4 tag alleen-fragment is beschikbaar als zowel een aas en prooi en zijn geschikt negatieve controles. Ook aas en prooi vectoren die een positieve controle coderen zijn beschikbaar (Addgene), we gebruiken meestal de rat CD200-Cd200R interactie 8. <ol><li> Zaad HEK293E cellen de dag voor transfectie met een dichtheid van 2,5 x 10 mL 5 cellen -1. We routinematig de cultuur van de cellen in volumes van 50 ml in Freestyle293 media aanleiding van de aanbevelingen van de fabrikant. Voor een efficiënte biotinylatie te garanderen, aan te vullen thij celkweekmedium gebruikt aas eiwitten met D-biotine produceren tot een uiteindelijke concentratie van 100 uM. Medium gebruikt om de prooi tot expressie niet moeten worden aangevuld met D-biotine. </li><li> De volgende dag, transfecteren cellen met behulp van een geschikt transfecties reagens (bijv. 293fectin). Gebruik 25 ug van het lokaas of prooiplasmide constructen voor een 50 ml cultuur te transfecteren. De gebiotinyleerde lokaas produceren co-transfecteren het plasmide dat codeert voor het lokaas te construeren met een plasmide dat uitgescheiden vorm van het E.coli eiwit-biotine ligase codeert ( BIRA) die verkrijgbaar is bij Addgene. Co-transfecteren lokaas plasmiden met een 10:1 ratio (2,5 ug) van het plasmide dat codeert voor het afgescheiden BirA eiwit. </li><li> Oogst culturen vijf dagen na transfectie door eerst pelletiseren van de cellen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 20 minuten gevolgd door filtratie van de supernatant door een 0,22 pm filter. </li></ol> [Tip: Bait and prooi eiwits moeten worden opgeslagen onverdund bij 4 ° C en als een algemene richtlijn moet gebruikt worden binnen een jaar worden. Voeg bacteriostatics zoals 50 ug / ml polymyxine B sulfaat of 10 mM NaN3 bacteriële besmetting van de supernatanten voorkomen.] 3. Normalisatie van de Bait and Prey Monsters Een van de belangrijkste kenmerken van de AVEXIS test is dat omdat de recombinante eiwitten worden uitgescheiden kunnen worden verdund of geconcentreerd (genormaliseerde) om binnen de vastgestelde drempel activiteiten voordat het gebruikt wordt in de test. Wij hebben gevonden dat het niveau waarop de recombinante eiwitten tot expressie diverse overspannen - tot 4 grootteorden - en dus de normalisatiestap vermindert het aantal valse positieven bij de schermen. 3.1 Bait normalisatie Opmerking: geconjugeerd D-biotine worden verwijderd uit de media (gewoonlijk door dialyse), aangezien het concurreren met de gebiotinyleerde bait eiwit binden aan bindingsplaatsen streptavidine. <ol><li> Overdracht aas supernatanten in dialyse slang, etiket, stevig knippen en dialyse uitgebreid tegen een geschikte buffer, zoals PBS om vrij biotine te verwijderen. </li></ol> [Tip: Wij hebben gevonden dat voldoende dialyse normaal bereikt 6 x 50 ml lokaas supernatanten tegen een volume van 4,5 L PBS met 4 veranderingen over een periode van 24 uur. Onvoldoende dialyse kan worden waargenomen door een remming van eiwit binding bij lage verdunningen tijdens het aas normalisatie stap (Fig. 3A). <ol start="2"><li> Voer een ELISA om de relatieve niveau waarop het lokaas eiwitten tot expressie te bepalen. Bereid een verdunningsreeks van het gebiotinyleerde aas eiwitten en ze vast op streptavidine gecoate microtiterplaat. Gebruik de rat Cd4d3 +4 tag te detecteren en kwantificeren van de gevangen aas eiwitten met behulp van een monoklonaal antilichaam (OX68). Concentraat of aas eiwitten verdunnen tot het minimum bedrag dat nodig is om alle biot verzadigenin bindingsplaatsen in de put een streptavidine-beklede platen. </li><li> Blok de putjes van een streptavidine-beklede platen met fosfaat gebufferde saline/0.1% Tween-20 (PBST) / 2% bovine serum albumine (BSA) gedurende 15 minuten. </li><li> In een aparte plaat, een verdunningsreeks (vier 01:03 verdunningen gewoonlijk voldoende) van het lokaas eiwitten in PBST / 2% BSA en overdracht aan putjes van een streptavidine-beklede platen. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was 3x in PBST. Voeg 100 ul van 2 ug / ml muis anti-rat Cd4d3 +4 IgG (OX68) geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was 3x in PBST. Voeg 100 pi anti-muis alkalische fosfatase van 1:5000 verdunning in PBST / 2% BSA en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was 3x in PBST en een definitieve wassen in PBS om eventuele resten van schoonmaakmiddel te verwijderen. Voeg 100 pi 1 mg / ml substraat 104 in diethanolamine buffer (10% diethanolamine (v / v), 0,5 mM MgCl2, 10 mM NaN3, pH9.8, opgeslagen van licht bij 4° C). </li><li> Na een uur maatregel absorptie bij 405 nm. Representatieve lokaas normalisatie resultaten worden getoond in Figuur 3A. </li><li> Bait eiwitten die tot expressie komen op een niveau dat onvoldoende zijn om alle biotine-bindingsplaatsen van een streptavidine-gecoate plaat te verzadigen, indien gebruikt onverdund, moet worden geconcentreerd met behulp van Vivaspin concentrators (Vivascience, 10kDa MWCO). Als een gids, schatten we dat ~ 5 ug van een typische aas eiwit (~ 80 kDa) voldoende is om een ​​plaat met 96 putjes te verzadigen. <ol><li> Lokaas eiwitten die in hoge concentraties worden verdund in PBST / 2% BSA tot een concentratie voldoende om de streptavidine-beklede platen verzadigen. De activiteit van de aas moet worden opnieuw gecontroleerd na verdunning of concentratie om ervoor te zorgen dat zij alle biotine bindingsplaatsen in het streptavidine-gecoate plaat te verzadigen. </li></ol></li></ol> 3,2 Prey normalisatie <ol><li> Kwantificering van de relatieve waarop de prooi eiwitten worden uitgedrukt in het β-lactamaseenzymactiviteit. </li><li> Eerst een verdunningsreeks van de supernatant die de prooi eiwitten in PBST / 2% BSA buffer. Voeg 20 pi van de verdunningen 60 ul van een 242 uM (0,125 mg / ml) nitrocefin oplossing (Calbiochem). </li><li> Onmiddellijk over de plaat een microtiterplaat lezer dat een absorptie gemeten bij 485 nm per minuut gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur is. Representatieve prooi normalisatie resultaten worden getoond in figuur 3B. </li><li> Concentreer je monsters met behulp van centrifugale concentrators of verdunnen ze in PBST / 2% BSA een drempel activiteit van ~ 2 nmol min -1 omzet van nitrocefin te bereiken. Praktijk wordt dit bereikt wanneer de nitrocefin gehydrolyseerd binnen ~ 7 minuten. </li></ol> 4. AVEXIS Screening Procedure <ol><li> Was een streptavidine-gecoate plaat in PBST. </li><li> Voeg 100 ul van PBST / 2% BSA in elk putje en incubeer gedurende 30 minuten aan een valse eiwitbindingsplaatsen binnen elke goed te blokkeren. </li&gt; </ol> [Tip: om resten van het wassen buffer na wasstappen te verwijderen, de plaat wordt getikt - krachtig - op keukenpapier] <ol start="3"><li> Verwijder de blokkeeroplossing een smart beweging van de plaat over een spoelbak en voeg 100 ul genormaliseerde gebiotinyleerd monomere lokaas de geschikte putjes en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het aas monsters van de plaat door upturning de plaat en slim te vegen over een wastafel, en was 3 keer in PBST. </li><li> Voeg 100 pi van de genormaliseerde pentamerized prooi construct in elk putje en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur was als in stap 4.4 en alleen uitvoeren een laatste wassen met PBS. </li><li> Voeg 60 ul van 242 uM nitrocefin oplossing (5 mg opgelost in 500 pL nitrocefin DMSO, meng en verder de nitrocefin verdund in 40 ml PBS en passeren door een 0,22 pm filter voor het toevoegen aan platen) en incuberen bij kamertemperatuur . Positieve interacties kan worden waargenomenop het oog aangezien de gele nitrocefin wordt gehydrolyseerd tot een rode kleur. Kwantificeren door het lezen van de absorptie bij 485 nm met behulp van een plaat lezer. Een typische plaat en kwantificering is weergegeven in Fig. 4. </li></ol> [Tip: positieve interacties worden gewoonlijk binnen 2 uur bij kamertemperatuur maar platen worden geplaatst bij 4 ° C gedurende 16 uur om alle mogelijke interacties worden opgespoord. We hebben ook ontdekt dat neergeslagen nitrocefin en tekortkomingen in het plastic van de microtiterplaat, zoals krassen / vingerafdrukken af ​​en toe naar artefactual valse positieven op 485 nm leiden ondanks dat er geen openlijke nitrocefin hydrolyse. Het is daarom raadzaam om foto&#39;s van de platen te nemen om visueel op te nemen nitrocefin omzet in de putten.] 5. Representatieve resultaten Een voorbeeld van een representatieve AVEXIS afschermplaat is in figuur 4. Men moet in acht hydrolyse (geel naar rood) van de nitrocefin substraat in depositieve controle putjes (zowel het antilichaam gemedieerde prooi opnameknop en positieve controle interactie) in ongeveer tien minuten. Sommige interacties binnen het scherm zijn ook waargenomen binnen deze tijdschaal, maar anderen kan het langer duren (enkele uren) te verschijnen. Gewoonlijk een hit-van ongeveer 0,4-0,6% (positieve interactie elke 150-250 interacties gescreend) typisch afhankelijk van het eiwit libraries worden gescreend. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig1.jpg" /> Figuur 1. Identificatie van receptor-ligand interacties tussenbeide komen voor cellulaire processen met behulp van erkenning AVEXIS. Het schema toont twee samenwerkende cellen (A en B) uitwisselen van informatie interactie tussen membraan ingebedde receptoreiwitten. AVEXIS een schaalbaar eiwit interactie assay speciaal ontworpen nieuwe receptor-ligand paren die worden gekenmerkt door een zeer zwakke interactie sterke identificeren. Recombinant zoluble eiwit bibliotheken die de hele ectodomein van de cel receptor aan de oppervlakte repertoire van beide cellen zijn ofwel samengesteld als pentamere β-lactamase-gelabeld prooien (cel type A) of monomere biotine-gelabeld aas (voor cel-type B). De pentamerisation van prooien verhoogt de lokale concentratie van de ectodomains een algemene aviditeit voordeel bewerkstelligen zodat zelfs zeer kortstondige interacties worden opgespoord. Het aas bibliotheek is gekleed op streptavidine-gecoate platen en systematisch gezocht heeft naar interacties met de prooi eiwitten. Na een korte wasbeurt, worden alle gevangen prooien gedetecteerd met behulp van de β-lactamase activiteit in verband met de prooi. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig2.jpg" /> Figuur 2. Lokaas en prooi construct ontwerp. (A) De rat CD200 receptor eiwit als voorbeeld van hoe de gehele ectodomains van celoppervlak receptor eiwitten bepaald en primers zijn ontworpen om zowel lokaas teen prooi expressie constructen. De cDNA en vertaald eiwitsequentie zijn vanaf de N-terminale signaalpeptide de membraanomspannende transmembraangebied van rat CD200. Een sense primer is ontworpen om een ​​5 &#39;Notl restrictie-enzym site optimale Kozaksequentie gevolgd door 25 basen van exact volgorde aan de CD200 cDNA sequentie behoren. De antisense primer omvat een Ascl website en 25 bases van de exacte overeenkomst volgorde onmiddellijk stroomopwaarts van de geselecteerde ectodomein truncatie residu bevindt. Om de ectodomein te houden in frame met de rat Cd4d3 +4 tag, moet de Ascl site te vertalen als Gly-Ala-Pro. (B) Een schematische voorstelling van het aas en prooi expressie constructen. Elk bevat receptor ectodomains geflankeerd door Notl en Ascl sites en een Cd4d3 +4 tag. De lokaas bevatten een C-terminaal peptide sequentie die specifiek kunnen worden door cotransfectie monobiotinylated met een plasmide dat een afgescheiden BirA enzym. De prooien worden gevolgd door het pentamerisation sequentievan het kraakbeen oligomere matrix eiwit (COMP) en β-lactamase enzym. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig3.jpg" /> Figuur 3. Normalisatie van het aas en prooi eiwitten. (A) Representatieve voorbeelden van aas normalisatie. Een verdunningsreeks van vier gedialyseerde lokaas supernatanten werden aangetoond d.m.v. ELISA met een anti-CD4 tag monoklonale antilichaam. De vier aas worden uitgedrukt op verschillende niveaus 1&gt; 2&gt; 3&gt; 4. Aas moet worden genormaliseerd naar een drempelwaarde dat de biotine bindingsplaatsen in elke goed verzadigd. Sterk uitgedrukt aas kan worden verdund aan eiwit te besparen (bijv. aas 1 kan worden verdund ~ 1:100), en slecht uitgedrukt aas geconcentreerd. Verminderde metingen bij lage verdunningen worden soms waargenomen bij sommige aas (bijv. aas 2) die is toe te schrijven aan de aanwezigheid van niet-geconjugeerde D-biotine door onvolledige dialyse. (B) De niveaus waarop prooi eiwitten zijn exingedrukt wordt gekwantificeerd met behulp van de hydrolyse snelheid van een β-lactamase substraat, nitrocefin. In het getoonde voorbeeld zijn de drie prooien uitgedrukt op verschillende niveaus prooi 1&gt; 2&gt; 3. Prooien worden genormaliseerd tot activiteit van ~ 2 nmol min -1, hetgeen overeenkomt met hydrolyse van 14,5 nmol nitrocefin voltooien ~ 7 minuten (bijv. prooi 1). De andere prooien in dit voorbeeld worden geconcentreerd voor gebruik in screening. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig4.jpg" /> Figuur 4. Vertegenwoordiger AVEXIS screening resultaten. (A) Een foto van een vertegenwoordiger AVEXIS screening plaat. Een prooi eiwit wordt probed tegen 41 verschillende aas en een positieve interactie wordt gedetecteerd in goed E2. Controles in de afschermplaten omvat: een gebiotinyleerde anti-CD4 antilichaam alle prooi eiwit vangen toegevoegd en (G6), een controle interactie: rat CD200 (lokaas)-Cd200R (prooi) met Cd200R prooi gebruikt drempel verdunning (H3), 1:10 (H4) en 1:100 (H5). Negatieve controles waren: een Cd4d3 +4 aas afgetast met de prooi eiwit wordt gescreend (H1) en de Cd200R prooi (H2). (B) Kwantificering van de absorptie waarden van hetzelfde scherm in drievoud uitgevoerd. Datapunten zijn gemiddelden ± SD.

<ol><li>Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+the+human+membrane+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Prediction of the human membrane proteome.</a> Proteomics. 10, 1141-1141 (2010).</li>
<li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+biological+systems%3A+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5, 1405-1405 (2009).</li>
<li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome research. 18, 622-622 (2008).</li>
<li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic acids research. 30, e9-e9 (2002).</li>
<li>Bendtsen, J. D., Nielsen, H., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Prediction+of+Signal+Peptides%3A+SignalP+3.0%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Improved Prediction of Signal Peptides: SignalP 3.0.</a> Journal of molecular biology. 340, 783-783 (2004).</li>
<li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model%3A+application+to+complete+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> Journal of molecular biology. 305, 567-567 (2001).</li>
<li>Brown, M. H., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+immunoglobulin+and+scavenger+receptor+superfamily+domains+as+chimeric+proteins+with+domains+3+and+4+of+CD4+for+ligand+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+engineering%22%5BJournal%5D)">Expression of immunoglobulin and scavenger receptor superfamily domains as chimeric proteins with domains 3 and 4 of CD4 for ligand analysis.</a> Protein engineering. 7, 515-515 (1994).</li>
<li>Wright, G. J., Puklavec, M. J., Willis, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid%2Fneuronal+cell+surface+OX2+glycoprotein+recognizes+a+novel+receptor+on+macrophages+implicated+in+the+control+of+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lymphoid/neuronal cell surface OX2 glycoprotein recognizes a novel receptor on macrophages implicated in the control of their function.</a> Immunity. 13, 233-23 (2000).</li>
<li>Dustin, M. L., Golan, D. E., Zhu, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+affinity+interaction+of+human+or+rat+T+cell+adhesion+molecule+CD2+with+its+ligand+aligns+adhering+membranes+to+achieve+high+physiological+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Low affinity interaction of human or rat T cell adhesion molecule CD2 with its ligand aligns adhering membranes to achieve high physiological affinity.</a> The Journal of biological chemistry. 272, (1997).</li>
<li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society transactions. 38, (2010).</li>
<li>de Wildt, R. M., Tomlinson, I. M., Ong, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+receptor-ligand+pairs+by+capture+of+long-lived+multivalent+interaction+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of receptor-ligand pairs by capture of long-lived multivalent interaction complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (2002).</li>
<li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129, 55-55 (2010).</li>
<li>Urech, D. M., Lichtlen, P., Barberis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+growth+selection+system+to+detect+extracellular+and+transmembrane+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Cell growth selection system to detect extracellular and transmembrane protein interactions.</a> Biochimica et biophysica acta. 1622, 117-117 (2003).</li>
<li>Voulgaraki, D., Mitnacht-Kraus, R., Letarte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115, 337-337 (2005).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Wu, W., Andre, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vast+repertoire+of+Dscam+binding+specificities+arises+from+modular+interactions+of+variable+Ig+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A vast repertoire of Dscam binding specificities arises from modular interactions of variable Ig domains.</a> Cell. 130, 1134-1134 (2007).</li>
<li>Martin, S., Sollner, C., Charoensawan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+Large+Extracellular+Protein+Interaction+Network+and+Its+Resolution+by+Spatiotemporal+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Construction of a Large Extracellular Protein Interaction Network and Its Resolution by Spatiotemporal Expression Profiling.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9, 2654-2654 (2010).</li>
<li>Crosnier, C., Bustamante, L. Y., Bartholdson, S. J., Bei, A. K., Theron, M., Uchikawa, M., Mboup, S., Ndir, O., Kwiatkowski, D. P., Duraisingh, M. T., Rayner, J. C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basigin+is+a+receptor+essential+for+erythrocyte+invasion+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.</a> Nature. 480, 534-537 (2011).</li>
<li>Sollner, C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+surface+interaction+network+of+neural+leucine-rich+repeat+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">A cell surface interaction network of neural leucine-rich repeat receptors.</a> Genome biology. 10, R99-R99 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Bij levende cellen worden waargenomen in vivo, hun plasma membranen vertonen zeer dynamische gedrag: in-en uitrollen membraanprocessen als ze contact op te nemen en communiceren met hun buren 2. De fysieke wisselwerking tussen het membraan-ingebed receptor-eiwitten die veel van deze contacten bemiddelen hebben zich ontwikkeld tot een uiterst zwak om dit zeer beweeglijke gedrag mogelijk te maken. Er wordt geschat dat de monomere interactie sterke punten zo zwak als 50 pM kan volstaan ​​om de spontane interacties op fysiologische receptor dichtheden 9, dat maakt het opsporen van nieuwe interacties extreem uitdagend 2,10 rijden. De AVEXIS hier beschreven methode is een gevoelige methode voor het detecteren van transiënte extracellulair eiwit: eiwit interacties die kunnen op een schaalbare manier worden uitgevoerd met een lage valse meldingen. Terwijl andere schaalbaar methoden zijn ontwikkeld voor het detecteren extracellulaire interacties 11-15een voordeel van AVEXIS is dat de experimentele parameters, zoals het aas en prooi activiteiten zijn gekwantificeerd om zelfs detecteren van de zwakste van de interacties (t 1/2 ≤ 0,1 s) met behoud van een lage valse meldingen 3. Daarnaast zijn de gestroomlijnde en robuuste monstervoorbehandelingsprocedures staat deze test uit te voeren op een veel grotere schaal dan andere testen en we hebben onlangs beschreven op een systematische interactie scherm in totaal meer dan ~ 16.500 mogelijke interacties 16. De test kan worden uitgevoerd op een eiwit dat het mogelijk is geven een oplosbare recombinante eiwit fragment. Dit omvat ook eiwitten die een N-terminale signaalpeptide als type I, GPI gekoppeld en uitgescheiden eiwitten bevatten. We hebben onlangs ontwierpen een reeks van vectoren die nu ons in staat stellen type II eiwitten tot expressie als aas 17. De test het algemeen niet geschikt voor multipass membraan eiwitten zoals ion transporters of pompen, omdat zij waarschijnlijk correct gevouwen buiten het kader van de plasmamembraan. We hebben toegepast om een verscheidenheid van verschillende systemen en succes uitgedrukt extracellulaire eiwitten zebravis 3,16,18, mens, muis en P. falciparum voor interactie schermen. In termen van de middelen die nodig zijn om een ​​AVEXIS scherm, hebben we ontdekt dat een belangrijk knelpunt is de selectie, bouw, en de volledige sequentie van het expressieplasmiden. Dit aspect van de methode kan tot een jaar ~ 100 lokaas en prooi constructies te maken, maar met de dalende kosten van gen-synthese, hebben we nu in de handel te bevorderen besteden dit aspect van het project. Het zoogdierexpressiesysteem samen met een groot schudden weefselkweek incubator (gebruiken we een INFORS HT Multitron Cell) kan een enkele onderzoeker uit te drukken en te normaliseren tot ~ 100 lokaas en prooi eiwitten per maand. Zodra de eiwitten worden geproduceerd en genormaliseerd, screening interacties is snel met tot twaalf 96-wells platen worden vervolgens verwerkt per dag. De enige maat apparatuur die wij hebben ontworpen om de productie van dergelijke grote aantal eiwitten vergemakkelijken is perslucht aangedreven zuiger die gebruikt wordt om tot voorbij vijf supernatanten door een filter 0.22μm parallel. De belangrijkste klasse van interacties die kunnen gemist worden in vergelijking met de interacties verwacht van de literatuur (fout-negatieven) zijn homophilic interacties, hoewel sommige van deze interacties kunnen worden gedetecteerd 3. In de gevallen waarin te verwachten interacties niet worden gedetecteerd, zijn wij van mening dat dit te wijten is aan de vorming van homophilic interacties door de prooi eiwitten (een prooi &quot;maskeren&quot;-effect), die vervolgens voorkomt verdere interacties met geïmmobiliseerde aas eiwitten. De frequentie waarmee interacties gedetecteerd afhankelijk van de inhoud van het eiwit bibliotheek worden gescreend. Als richtlijn voor de lezer, een scherm van&gt; 30, 000 interacties binnen de zebravis immunoglobuline superfamilie resulteerde in 188 meldingen - een frequentie van 0,6% 3,16,18. Een snelle controle kan worden uitgevoerd om positieve resultaten verifiëren om te bepalen of de interactie kan worden gedetecteerd in zowel lokaas-prooi oriëntaties, die kan dezelfde interactie onafhankelijk worden gedetecteerd of de eiwitten aanwezig als ofwel een lokaas of een prooi. Wanneer we deze heen en weer gaande gedrag waargenomen, is de binding vervolgens aangetoond om specifiek te zijn door aan te tonen direct verzadigbare binding van gezuiverde eiwitten met oppervlakte-plasmonresonantie. Benadrukt moet worden dat, omdat we binding aviditeit te verhogen door kunstmatig pentamerising de prooi eiwitten, we niet de test geschikt is voor kwantitatief vergelijken van interactie sterke punten te overwegen. Om biofysische binding parameters van de interacties die we gebruiken monomere proteïnen en Surface Plasmon Resonance te verkrijgen. Ten slotte, als een interactie is geïdentificeerd, de high doorvoer aard van de assay maakt het relatief eenvoudig aan te passen aan de test scherm reagentia zoals antilichamen of kleine moleculen die de interactie blokkeren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Cat. Aantal </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Freestyle media </td><td> Invitrogen </td><td> 12338018 </td><td></td></tr><tr><td> Nitrocefin </td><td> Calbiochem </td><td> 484400 </td><td></td></tr><tr><td> SA gecoate microtiterplaten </td><td> Nunc </td><td> 734-1284 </td><td></td></tr><tr><td> OX68 antilichaam </td><td> AbDSerotec </td><td> MCA1022R </td><td></td></tr><tr><td> Dialysebuis </td><td> Doorboren </td><td> PN68100 </td><td></td></tr><tr><td> Polymyxine B </td><td> Sigma </td><td> P4932 </td><td></td></tr><tr><td> D-biotine </td><td> Sigma </td><td> B4639-5G </td><td></td></tr><tr><td> Substraat-104 </td><td> Sigma </td><td> 1040-506 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin-20 centrifugale concentrators </td><td> Sartorius </td><td> VS2002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 pm filters </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td></td></tr></tbody></table>

aviditeit op basis van extracellulaire interactie screening (avexis) voor de scalable detectie van lage-affiniteit extracellulaire receptor-ligand interacties

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellulair eiwit: eiwit interacties tussen uitgescheiden of membraan-tethered-eiwitten zijn van cruciaal belang voor zowel het initiëren intercellulaire communicatie en het waarborgen van de samenhang binnen meercellige organismen. Eiwitten voorspeld te vormen extracellulaire interacties worden gecodeerd met ongeveer een kwart van de menselijke genen 1, maar ondanks hun belang en de overvloed, de meeste van deze eiwitten zijn er geen gedocumenteerde bindende partner. De eerste plaats is dit te wijten aan hun biochemische eigenzinnigheid: membraan-ingebed eiwitten zijn moeilijk te oplosbaar in hun natieve conformatie en bevatten structureel belangrijke posttranslationele modificaties. Ook de interactie affiniteiten tussen receptor-eiwitten vaak gekenmerkt door een uiterst lage interactie sterke punten (halveringstijd &lt;1 seconde) zich verzetten tegen hun detectie met een groot aantal veelgebruikte high throughput methoden 2. We beschrijven hier een test, AVEXIS (aviditeit-based EXtracelluLAR Interactie Scherm) dat deze technische uitdagingen waarmee de detectie van zeer zwakke eiwit interacties (t 1/2 ≤ 0,1 sec) met een laag vals-positieve tarief 3 overwint. De test wordt gewoonlijk uitgevoerd in een high throughput formaat systematische screening van duizenden interacties in een geschikte vorm microtiterplaat (Fig. 1) in te schakelen. Het berust op de productie van oplosbare recombinante eiwit bibliotheken die de ectodomein fragmenten van celoppervlaktereceptoren of uitgescheiden eiwitten waarin het screenen van interacties bevatten, daarom is deze benadering voor type I, type II, GPI gekoppelde celoppervlakreceptoren en uitgescheiden eiwitten maar niet multipass membraan eiwitten zoals ionkanalen of transporteurs. Het recombinant eiwit bibliotheken worden geproduceerd met een handige en hoogwaardige zoogdierexpressiesysteem 4, die belangrijke posttranslationele modificaties zoals glycosyla zorgenTIE en disulfidebindingen worden toegevoegd. Uitgedrukt recombinante eiwitten worden uitgescheiden in het medium en geproduceerd in twee vormen: een gebiotinyleerde aas die kan worden vastgelegd op een streptavidine-gecoate vaste fase die geschikt zijn voor screening, en een pentamerised enzym-gelabeld (β-lactamase) prooi. De lokaas en prooi eiwitten worden aan elkaar in een binair wijze directe interactie tussen, vergelijkbaar met een conventionele ELISA (Fig. 1) detecteren. De pentamerisation van de eiwitten in de prooi wordt bereikt door een peptide sequentie van het kraakbeen oligomere matrix eiwit (COMP) en verhoogt de lokale concentratie van de ectodomains wat significante aviditeit winsten in staat te stellen zelfs zeer voorbijgaande interacties te detecteren. Door het normaliseren van de activiteiten van zowel het aas en ten prooi aan vooraf bepaalde niveaus voorafgaand aan de screening hebben we laten zien dat de interacties met monomere halfwaardetijden van 0,1 sec kan worden gedetecteerd met een laag percentage valse positieven 3.

AVEXIS een high throughput assay ontwikkeld eiwit interactie systematisch scherm nieuwe extracellulaire receptor-ligand paar betrokken bij cellulaire opname processen. Het is specifiek ontworpen om voorbijgaande eiwit interacties die zijn moeilijk te identificeren met behulp van andere high throughput benaderingen op te sporen.

Aviditeit op basis van extracellulaire Interactie Screening (AVEXIS) voor de Scalable detectie van lage-affiniteit extracellulaire receptor-ligand interacties

Extracellulaire eiwit-eiwitinteracties tussen gesecreteerde of membraangebonden eiwitten zijn essentieel voor zowel het initiëren van intercellulaire communicatie als...

Het algemene doel van deze procedure is het ontdekken van nieuwe extracellulaire proteïne-interacties die betrokken zijn bij cellulaire herkenningsprocessen, in het bijzonder membraangebonden receptorproteïnen. De AveXis-benadering is ontworpen om de zeer zwakke interactieaffiniteiten die kenmerkend zijn voor deze klasse van proteïne-interacties en het feit dat membraanproteïnen biochemisch moeilijk te manipuleren zijn, te omzeilen. Dit wordt bereikt door eerst een recombinante proteïnebibliotheek samen te stellen van de extracellulaire regio's van celoppervlakreceptoren.Dit wordt bereikt door expressieplasmiden te ontwerpen die de ectodomeingebieden van de receptoren produceren als oplosbare fragmenten, zowel als monomerische gebiotinyleerde baits als pentamere enzym-getagde prey. De tweede stap is het tot expressie brengen en normaliseren van de eiwitten om ze klaar te maken voor interactiescreening. Alle eiwitten worden geproduceerd in zoogdiercellen om ervoor te zorgen dat post-translationele modificaties, zoals disulfidebruggen en glycosylering, worden toegevoegd.Een cruciale stap in het protocol is om ervoor te zorgen dat de bait- en prey-eiwitten binnen de bibliotheek allemaal zijn genormaliseerd tot binnen de drempelwaarden. Daarna volgt het spannende gedeelte: het screenen op nieuwe interacties. De baits worden verdeeld over individuele putjes van een microtiterplaat en vervolgens onderzocht op interacties met behulp van de prey.Vervolgens wordt een wasstap uitgevoerd. De laatste stap is het toevoegen van het substraat voor het enzym om eventueel gevangen prey op de arrays van bait-eiwitten te detecteren. Uiteindelijk kunnen de resultaten van een VEX-screening aantonen welke celoppervlaktereceptoren in staat zijn om bindingspartners te vormen en dus betrokken kunnen zijn bij de herkennings- en communicatieprocessen tussen cellen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van populaire eiwitextractiemethoden, zoals de gist-twee-hybride methode of biochemische zuiveringen, is dat deze specifiek is ontworpen voor het detecteren van extracellulaire eiwit-eiwitinteracties. De methode is bijzonder geschikt voor het ontdekken van nieuwe interacties tussen membraangebonden receptorproteïnen. Deze interacties zijn moeilijk te detecteren met andere technieken, omdat membraaneiwitten biochemisch lastig te manipuleren zijn en hun interacties met tegenoverliggende receptoren doorgaans extreem zwak zijn.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over hoe cellen elkaar herkennen en met elkaar communiceren. Op moleculair niveau kan deze worden gebruikt om vragen te beantwoorden over fundamentele biologische processen, zoals welke receptorproteïnen op het oppervlak van eicellen en spermacellen met elkaar combineren, of welke receptor-ligandinteracties verantwoordelijk zijn voor cellulaire gedragingen zoals myocytenfusie of de vorming van de neurale lijst. De grootste uitdaging bij deze aanpak is het samenstellen van de bait-and-pray proteïnebibliotheken waarin gescreend wordt op interacties.Het is ook zeer belangrijk om ervoor te zorgen dat de bait- en prey-eiwitten genormaliseerd zijn binnen de drempelwaarden die vereist zijn voor de assay. Dit vermindert de frequentie van fout-negatieven en fout-positieven. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode tijdens mijn promotieonderzoek, toen ik probeerde een bindingspartner te identificeren voor het celoppervlakte-eiwit CD 200.In essentie stelde ik de vraag: wat is het bindingspatroon voor deze specifieke celoppervlaktereceptor? Zelfs vandaag de dag blijft dit een technisch moeilijke vraag om te beantwoorden. Destijds was het menselijk genoom echter bijna voltooid en ik realiseerde me dat we, omdat we nu een volledige lijst hadden van alle celoppervlaktereceptoren in het genoom, in plaats daarvan konden vragen welke receptoreiwitten binnen deze set technisch gezien met elkaar kunnen interageren.Dit is een veel makkelijker vraagstuk om te beantwoorden, en AveXis was de methode die we hebben ontwikkeld om dit te doen. Zodra een bibliotheek van bait- en prey-expressievectoren is vastgesteld, bereidt u de transfectie daarvan in HEC 2 9 3 E-cellen voor. Begin met het uitplaten van de cellen op de dag vóór de transfectie bij een dichtheid van 250, 000 cellen per milliliter in 50 milliliters Freestyle 2 9 3-medium om een efficiënte biotinylering te waarborgen. Vul het medium dat wordt gebruikt voor de productie van bait-eiwitten, maar niet voor prey-eiwitten, aan met d-biotine. Wanneer alle platen zijn voorbereid, worden de cellen overnacht geïncubeerd onder standaardcondities.Omdat biotine een lage oplosbaarheid heeft en een nauwkeurige oplossing vereist, geven wij de voorkeur aan het afwegen van de extra biotine, waarna deze aan het medium wordt toegevoegd en de volgende dag krachtig wordt geschud. Transfecteer 50 milliliter gecultiveerde cellen met 25 microgram van het bait- of prey-plasmide met behulp van een geschikt transfectiereagens om gebiotinyleerde baits te produceren; cotransfecteer het bait-construct in een verhouding van 10 op 1 met plasmiden die coderen voor een gesecreteerde vorm van het ELI-eiwit biotineligase per oogst.Oogst de culturen vijf dagen na transfectie door eerst de cellen te pelletteren middels centrifugatie bij 3000 ×g gedurende 20 minuten en vervolgens het supernatant te filteren door een 0,22 µm filter. Een van de belangrijkste kenmerken van AveXis is dat recombinante eiwitten worden uitgescheiden, waardoor ze kunnen worden verdund of geconcentreerd tot binnen de drempelwaarden voor activiteit. We stelden vast dat recombinante eiwitten een variabele expressie vertonen tot vier grootteordes, waardoor de normalisatiestap het voorkomen van fout-positieven tijdens de screeningsstappen vermindert.Om te beginnen met de normalisatie van het lokaas, moet niet-geconjugeerd biotinyl-vrij medium via dialyse worden verwijderd, aangezien dit zal concurreren met het gebiotinyleerde lokaaseiwit voor binding aan de streptavidine-bindingsplaatsen; begin hiermee door het lokaas in een dialysebuis te plaatsen. Om een effectieve dialyse van de recombinante eiwitten te garanderen, hebben we vastgesteld dat het belangrijk is om een overschot aan oppervlakte van de dialysebuis te voorzien. Doorgaans gebruiken we twee tot drie keer zoveel buis als feitelijk nodig is voor het volume dat wordt gedialyseerd.Dialyse het lokaas gedurende een periode van 24 uur uitgebreid tegen een geschikte buffer, zoals PBS, nadat de dialyse is uitgevoerd. Begin een ELISA door de wells van een met streptavidine gecoate microtiterplaat 15 minuten te blokkeren met PBST dat BSA bevat. Maak ondertussen op een schone plaat een reeks van vier 1:3 verdunningen van de lokaaseiwitten in PBST met 2% BSA.Breng na de incubatie van 15 minuten de verdunning over naar de strep TTR-gecodeerde plaat en incubeer de plaat gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was na een uur de wells en voeg vervolgens aan elke well 100 µL OX 68 van 2 µg/mL toe. Incubeer de plaat nogmaals een uur bij kamertemperatuur. Voer na de tweede incubatie opnieuw een wasserie uit en belaad de plaat met anti-US alkalische fosfatase.Incubeer de plaat nog een derde uur bij kamertemperatuur. Was de plaat nu drie keer met PBST en volg dit met een laatste wasbeurt met PBS. Om eventuele detergentresten te verwijderen, voegt u na een uur 100 µL van 1 mg/mL substraat 1 0 4 in diethanolaminebuffer toe.Meet bij kamertemperatuur de absorptie bij 405 nanometer. Een verdunningsreeks van vier verschillende gedialyseerde bait-supernatanten werd gedetecteerd via ELISA met gebruik van een anti-CD4-tag monoklonaal antilichaam. Indien de onverdunde expressie-baitproteïnen onvoldoende zijn om alle biotine-bindingsplaatsen van een streptavidine-gecoate plaat te verzadigen, concentreer de proteïnen dan met een Viva spin concentrator. Gebruik anders het baitproteïne in een verdunde concentratie in PBST met 2%BSA.Dat is precies voldoende om de biotinebindingsplaats van de assay te verzadigen. Kwantificeer de relatieve niveaus waarop de pre-proteïnen tot expressie komen met behulp van de bèta-lactamase-enzymactiviteit. Begin met het maken van een verdunningsreeks van het supernatant dat de paraproteïnen bevat in PBST 2%BSA-buffer.Voeg vervolgens 20 µL van de verdunning toe aan 60 µL van een nitrose stepin-oplossing in een plaat. Plaats de plaat onmiddellijk in een platenlezer en meet de absorptie bij 485 nm elke minuut gedurende de volgende 20 minuten met behulp van centrifugale concentrators of verdunning in PBST met 2% BSA. Stel de uiteindelijke concentratie van de monsters zo in dat alle nitros in de assay in ongeveer zeven minuten worden gehydrolyseerd, wat neerkomt op ongeveer twee ol nitros turnover per minuut.Begin de AveXis-screening door een strep TAVR ENC-gecoate plaat te wassen in PBST en de plaat droog te kloppen tegen een papieren handdoek. Voeg vervolgens PBST met BSA toe aan elke well en incubeer de plaat gedurende 30 minuten. Dit blokkeert ongewenste eiwitbindingsplaatsen.Verwijder uit elke put de blokkeeroplossing door de plaat met een korte, krachtige beweging boven een gootsteen leeg te schudden en voeg 100 µL genormaliseerde gebiotinyleerde monomere bait toe aan de betreffende putten. Incubeer de plaat een uur bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de bait-monsters uit de plaat met een soortgelijke beweging en was de plaat drie keer met PBST.Klop vervolgens droog na de derde wasbeurt. Voeg nu 100 µL van het genormaliseerde pentameer-prey-construct toe aan elke well en incubeer de plaat gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de plaat na een uur nog drie keer met PBST en volg dit met een laatste wasbeurt met uitsluitend PBS.Voeg ten slotte 60 µL nitrous seven-oplossing toe aan elke put en incubeer de plaat gedurende twee uur bij kamertemperatuur, of bij voorkeur gedurende 16 uur bij 4 °C. De volgende dag zullen positieve interacties rood zijn gekleurd. Maak een foto van de plaat voor een visueel verslag en kwantificeer vervolgens de reacties bij een absorbentie van 485 nm met een plaatlezer.Ongeveer 10 minuten na het begin van de AveXis-screeningreactie waren geel tot rode kleurveranderingen zichtbaar in zowel de antilichaam-gemedieerde prey-capture-controle als in de interactie van de positieve controle. Deze kleurverandering duidt op hydrolyse van het nitrose-substraat. Enkele positieve interacties zijn op deze tijdschaal waarneembaar, maar de meeste verschenen pas na enkele uren.Doorgaans is een hitrate van ongeveer 0,4 tot 0,6% positieven waargenomen. Zodra de eiwitbibliotheken zijn klaargemaakt, kan het screeningsgedeelte van deze techniek snel worden uitgevoerd. Het is heel goed mogelijk om tot 12 platen per dag te screenen nadat een interactie is geïdentificeerd.De belangrijkste volgende stap is om eerst aan te tonen dat de interactie herhaald kan worden met behulp van nieuwe, onafhankelijke eiwitpreparaten. Ten tweede bepalen we altijd of de interactie onafhankelijk is van de oriëntatie tussen bait en prey, oftewel: kan de interactie worden gereciprokeerd? Dit houdt in dat de domeinen van de bait-vector in de prey-vector worden gekloond en vice versa.Interacties die herhaald en beantwoord kunnen worden, worden beschouwd als betrouwbaar en zijn altijd als positief aangetoond. Met behulp van andere technieken, zoals oppervlakteplasmonresonantie, maken we graag gebruik van oppervlakteplasmonresonantie om eventuele interacties die we opnieuw identificeren, aanvullend te valideren. Belangrijk is dat dit aantoont dat de twee gezuiverde componenten direct kunnen interageren en dat dit ook kan worden gebruikt om aan te tonen dat de binding verzadigbaar is en daarom specifiek.

avidity-based-extracellular-interaction-screening-avexis-for-scalable

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video laat zien experimenten met daarop volgende analyse van eiwit-eiwit interacties door het gebruik van micro-oppervlakken met een patroon. De aanpak biedt de mogelijkheid om eiwit interacties op te sporen in levende cellen en combineert een hoge doorvoer-mogelijkheden met de mogelijkheid te extraheren kwantitatieve informatie.

In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon

In this video, we demonstrate the amplified luminescent proximity homogeneous assay—a bead-based proximity assay. It utilizes homogeneously-sized acceptor and donor beads, immobilized with two proteins that tend to interact to screen potential small molecules inhibiting protein interactions.

Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay: A Bead-Based Proximity Assay to Screen Small Molecules Inhibiting Protein-Protein Interactions

Peptide array screening is een hoogdoorlaattest voor het identificeren van interactieplaatsen tussen eiwitten. Dit maakt het mogelijk om meerdere interacties van een doeleiwit in kaart te brengen en kan dienen als een methode voor het identificeren van plaatsen voor remmers die een eiwit aanspreken. Hier beschrijven we een protocol voor het screenen en analyseren van peptide arrays.

Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays

De gepresenteerde protocollen beschrijven twee op enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) gebaseerde technieken voor de snelle onderzoeking van ligand-receptor interacties: De eerste test stelt de bepaling van constante disassociatie tussen ligand en receptor mogelijk. De tweede test maakt een snelle screening van blokkerende peptiden voor ligand-receptor interacties mogelijk.

Een ELISA Based Binding en concurrentie methode om snel bepalen Ligand-receptor interacties

Biopanning bacteriële display bibliotheken is een bewezen techniek voor ontdekking van peptide affiniteit reagentia, een robuust alternatief voor antilichamen. De semi-automatische sorteermethode hierin heeft gestroomlijnd biopanning als u wilt verkleinen van het optreden van valse positieven. We illustreren hier het denkproces en de technieken toegepast in de beoordeling van kandidaten en het minimaliseren van de downstream-analyse.

Semi-automatische Biopanning van bacteriële Display bibliotheken voor Peptide affiniteit reagens detectie en analyse van de resulterende isolaten

Hier presenteren we een protocol bij scherm extracellulaire proteïne microarrays voor de identificatie van nieuwe receptor-ligand interacties in hoge-doorvoer. Ook beschrijven we een methode ter verbetering van de opsporing van voorbijgaande eiwit-eiwitinteractie met behulp van eiwit-microbead complexen.

Extracellulaire eiwit Microarray technologie voor detectie van High Throughput van lage affiniteit Receptor-Ligand interacties

Metingen van de drug target betrokkenheid staan centraal in effectieve Geneesmiddelenontwikkeling en chemische sonde validatie. Hier, detail we een protocol voor het meten van de drug-target engagement met behulp van hoge inhoud imaging in een microplate-compatibele adaptie van de cellulaire thermische shift test (CETSA).

Met behulp van hoog gehalte Imaging om te kwantificeren Target Engagement in Adherente cellen

Dit manuscript beschrijft een genoom-schaal celgebaseerde screening benadering om extracellulaire receptor-ligand interacties te identificeren.

Celoppervlakreceptoridentificatie met genoomschaal CRISPR/Cas9 genetische schermen

Deze studie was gericht op het presenteren van een strategie voor het identificeren van drug-peptide interacties. De strategie omvat het biopanning van drug-herkennende korte peptiden op basis van een kwarts-kristal microbalans (QCM) biosensor, gevolgd door bioinformatica analyse voor het kwantitatief beoordelen van de informatie verkregen voor de drugherkenning en annotatie van de drug-bindende sites op eiwitten.

Biosensor-gebaseerde high throughput biopanning en bioinformatica analyse strategie voor de wereldwijde validatie van drug-eiwit interacties

Het huidige protocol beschrijft nieuwe hulpmiddelen voor SPR-bindingstests om CV-N-binding aan HA, S-glycoproteïne, gerelateerde hybride-type glycanen en oligosacchariden met een hoog mannosegehalte te onderzoeken. SPR wordt gebruikt om de KD te bepalen voor het binden van dimerische of monomere CV-N aan deze glycanen.

Engineering antivirale middelen via Surface Plasmon Resonance

Dit artikel stelt een nieuwe generatie multiparametrische analytische platforms voor met een verhoogde doorvoer voor de karakterisering van extracellulaire vesikelsubsets. De methode is gebaseerd op een combinatie van multiplexed biosensing-methoden met metrologische en morfomechanische analyses door atomaire krachtmicroscopie, gekoppeld aan Raman-spectroscopie, om vesiculaire doelen te kwalificeren die vastzitten op een microarray-biochip.

Multimodaal analytisch platform op een multiplexed surface plasmon resonance imaging chip voor de analyse van extracellulaire vesikel subsets

Leer AVEXIS voor het detecteren van zwakke extracellulaire receptor-ligand interacties met behulp van een recombinant eiwitbibliotheek. Deze methode helpt onderzoekers bij het identificeren van nieuwe bindingspartners voor membraaneiwitten.

Aviditeit op basis van extracellulaire Interactie Screening (AVEXIS) voor de Scalable detectie van lage-affiniteit extracellulaire receptor-ligand interacties (Video) | JoVE Journal

Aviditeit op basis van extracellulaire Interactie Screening (AVEXIS) voor de Scalable detectie van lage-affiniteit extracellulaire receptor-ligand interacties

Meer video's verkennen