Aviditeit op basis van extracellulaire Interactie Screening (AVEXIS) voor de Scalable detectie van lage-affiniteit extracellulaire receptor-ligand interacties
5 maart 2012
AVEXIS een high throughput assay ontwikkeld eiwit interactie systematisch scherm nieuwe extracellulaire receptor-ligand paar betrokken bij cellulaire opname processen. Het is specifiek ontworpen om voorbijgaande eiwit interacties die zijn moeilijk te identificeren met behulp van andere high throughput benaderingen op te sporen.
Het algemene doel van deze procedure is om nieuwe extracellulaire eiwitinteracties te ontdekken die betrokken zijn bij cellulaire herkenningsprocessen, in het bijzonder membraaneigesloten receptoreiwitten. De AveXis-aanpak is ontworpen om de zeer zwakke interactie-affiniteiten te omzeilen die typerend zijn voor deze klasse van eiwitinteracties en het feit dat membraaneiwitten moeilijk biochemisch te manipuleren zijn. Dit wordt bereikt door eerst een recombinante eiwitbibliotheek samen te stellen van de extracellulaire regio's van celoppervlaktereceptoren.
Dit wordt bereikt door expressieplasmiden te ontwerpen om de ectodomeinregio's van de receptoren te produceren als oplosbare fragmenten, zowel als monomere gebiotineerde lokaas- als pentameer enzymgelabelde prooi. De tweede stap is om de eiwitten te exprimeren en te normaliseren om klaar te zijn voor interactiescherming. Alle eiwitten worden geproduceerd in zoogdiercellen om ervoor te zorgen dat post-translationele modificaties zoals diss, sulfide, bindingen en glycosylering worden toegevoegd.
Een cruciale stap in het protocol is om ervoor te zorgen dat de lokaas- en prooi-eiwitten binnen de bibliotheek allemaal zijn genormaliseerd tot binnen drempelwaarden. Vervolgens komt het spannende deel, het screenen op nieuwe interacties. De Bates worden gerangschikt in afzonderlijke putjes van een microplaat en vervolgens getest op interacties met behulp van de prooi.
Vervolgens wordt een wasstap uitgevoerd. De laatste stap is om het substraat voor het enzym toe te voegen om eventuele gevangen prooi op de arrays van lokaas-eiwitten te detecteren. Uiteindelijk kunnen de resultaten van een VEX-screen laten zien welke celsurferreceptoren bindingspartners kunnen vormen en daarom betrokken kunnen zijn bij de herkennings- en communicatieprocessen tussen cellen.
Het grote voordeel van deze techniek van een populaire eiwitextractiemethode, zoals de yeast two hybrid of biochemische zuiveringen, is dat het specifiek is ontworpen om extracellulaire eiwit-eiwitinteracties te detecteren. Het is vooral geschikt voor het ontdekken van nieuwe interacties tussen membraangebonden receptoreiwitten. Deze interacties zijn moeilijk te detecteren met behulp van andere technieken omdat membraaneiwitten biochemisch moeilijk te manipuleren zijn en hun typische tegenreceptorinteracties extreem zwak zijn.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken met betrekking tot hoe cellen elkaar herkennen en communiceren. Op moleculair niveau kan het worden gebruikt om vragen te beantwoorden met betrekking tot basisbiologische processen, zoals welke receptoreiwitten die op het oppervlak van eieren en sperma worden weergegeven, elkaar combineren, of welke receptor-ligandinteracties verantwoordelijk zijn voor cellulaire gedragingen zoals myocyetfusie of neurale crestvorming. De grootste uitdaging bij deze aanpak is het samenstellen van de lokaas- en prooi-eiwitbibliotheken waarbinnen kan worden gescreend op interacties.
Het is ook erg belangrijk om ervoor te zorgen dat de lokaas- en prooi-eiwitten binnen de drempelwaarden die vereist zijn voor de test worden genormaliseerd. Dit vermindert het aantal valse negatieven en valse positieven. Ik had voor het eerst het idee voor deze methode tijdens mijn promotie toen ik probeerde een bindingspartner te identificeren voor het CD 200 celoppervlakte-eiwit.
In wezen stelde ik de vraag, wat is het bindingspatroon voor deze specifieke celoppervlaktereceptor? Zelfs vandaag de dag blijft dit een technisch moeilijke vraag om te beantwoorden. Toen het menselijk genoom echter bijna voltooid was, realiseerde ik me dat we nu, omdat we een complete lijst hadden van alle celoppervlaktereceptoren in het genoom, in plaats daarvan binnen deze set van receptoreiwitten konden vragen welke technisch kunnen interacteren.
Dit is een veel gemakkelijkere vraag om te beantwoorden, en AveXis was de methode die we ontwikkelden om het te beantwoorden. Zodra een bibliotheek van lokaas- en pre-expressievectoren is opgesteld, bereid om ze in HEC 2 9 3 E cellen te transfecteren, begin met het zaaien van de cellen de dag voor transfectie bij een dichtheid van 250.000 cellen per milliliter in 50 milliliters freestyle 2 9 3 media om een efficiënte biotin-elatatie te garanderen. Voeg biotin toe aan het medium dat wordt gebruikt om lokaas-eiwitten te produceren, niet prooi-eiwitten, met alle bereide platen, en incubeer de cellen een nacht in standaardcondities.
Omdat biotin een lage oplosbaarheid en nauwkeurige oplossing heeft, geven we de voorkeur aan het afwegen van het extra biotin en het vervolgens toevoegen aan het medium en krachtig schudden. Transfecteer de volgende dag 50 milliliter gekweekte cellen met 25 microgram van het lokaas- of prooiplasamide met behulp van een geschikt transfectiemiddel om biotinylerde lokaas-cot-transfecties te produceren. Het lokaasconstruct met een 10-tot-1-verhouding met plasmiden die een gesecreteerde vorm van het ELI-eiwit biotinligase coderen per oogst.
De culturen vijf dagen na transfectie door eerst de cellen te pellen door centrifugatie bij 3000 keer de zwaartekracht gedurende 20 minuten en ten tweede het S-supernatant te filteren door een 0,22 micron filter. Een van de belangrijkste kenmerken van AveXis is dat recombinante eiwitten worden uitgescheiden, dus ze kunnen worden verdund of geconcentreerd tot binnen drempelactiviteiten. We ontdekten dat recombinante eiwitten een variabele expressie hebben tot vier ordes van grootte, dus de normalisatie-stap vermindert het voorkomen van valse positieven tijdens de screeningfasen.
Om met de normalisatie van het lokaas te beginnen, moet ongeconjugeerd de-biotine uit het medium worden verwijderd door middel van dialyse, omdat het zal concurreren met het gebiotineerde lokaaseiwit voor binding aan strept in-bindingsplaatsen. Begin met het beveiligen van het lokaas in een dialysebuis. Om een effectieve dialyse van de recombinante eiwitten te garanderen, hebben we gevonden dat het belangrijk is om overtollige oppervlakte aan het dialysebuisje te bieden. Typisch bieden we twee tot drie keer meer buis dan daadwerkelijk vereist is voor het volume dat wordt gedialyseerd.
Gedurende een periode van 24 uur, dialyseer het lokaas uitgebre
Overzicht
AVEXIS is een high-throughput proteïne-interactie-assay die is ontworpen om systematisch te screenen op nieuwe extracellulaire receptor-ligandparen die betrokken zijn bij cellulaire herkenningsprocessen. Deze methode detecteert effectief transiënte proteïne-interacties die gewoonlijk moeilijk te identificeren zijn met andere high-throughputtechnieken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Eiwitinteracties
Achtergrond
- In het membraan ingebedde receptorproteïnen zijn cruciaal voor cellulaire herkenning.
- Zwakke interactie-affiniteiten bemoeilijken de detectie van deze interacties.
- Traditionele methoden zoals gist twee-hybride zijn minder effectief voor membraanproteïnen.
- AVEXIS is ontwikkeld om deze uitdagingen aan te pakken met behulp van een recombinante proteïnebibliotheek.
Doel van de studie
- Om nieuwe extracellulaire eiwitinteracties te ontdekken.
- Om de communicatieprocessen tussen cellen te begrijpen.
- Om receptor-ligand-interacties te identificeren die relevant zijn voor biologische processen.
Gebruikte methoden
- Samenstelling van een recombinante eiwitbibliotheek van extracellulaire receptorregio's.
- Expressie van eiwitten in zoogdiercellen voor correcte posttranslationele modificaties.
- Normalisatie van bait- en prey-eiwitten om vals-positieven te verminderen.
- Screening op interacties met behulp van microtiterplaten en enzymdetectie.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van bindingspartners voor diverse celoppervlakreceptoren.
- Demonstratie van de effectiviteit van AVEXIS bij het detecteren van zwakke interacties.
- Inzicht in cellulaire gedragingen die worden beïnvloed door receptor-ligand-interacties.
- Vestiging van een betrouwbare methode voor het screenen van membraaneiwitinteracties.
Conclusies
- AVEXIS biedt een robuust platform voor het bestuderen van extracellulaire eiwitinteracties.
- Deze methode kan ons begrip van cellulaire communicatie aanzienlijk verbeteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen het verkennen van interacties omvatten die relevant zijn voor de ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het detecteren van extracellulaire receptor-ligandinteracties met een lage affiniteit blijft een kritieke flessenhals bij de doelwitvalidatie voor de ontwikkeling van biologica en celtherapie. AVEXIS maakt schaalbare screening mogelijk van transiënte interacties (t1/2 ≤ 0,1 sec) met lage percentages fout-positieven, wat direct bijdraagt aan het mechanistische risicobeheer van extracellulaire targets. Deze mogelijkheid verhoogt het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door biologisch relevante interacties te identificeren die door conventionele high-throughput-methoden worden gemist.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door directe extracellulaire interacties tussen membraangebonden receptoren en liganden te detecteren.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door middel van systematische screening van recombinante ectodomeinbibliotheken in een microtiterplaatformaat.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in de targetselectie door interacties met fysiologische relevantie te identificeren, ondanks zwakke monomerische affiniteiten.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Produceert genormaliseerde gebiotinyleerde bait-eiwitten en pentamerische enzym-gelabelde prey-eiwitten die geschikt zijn voor high-throughput interactiescreening.
- Reproduceerbaarheid: Normalisatie van de expressieniveaus van bait en prey vermindert fout-positieven en maakt consistente detectie over verschillende screening-runs mogelijk.
- Schaalbaarheid: Compatibel met microtiterplaat-formaten, waardoor na de bibliotheekpreparatie duizenden interacties per dag gescreend kunnen worden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Identificeert receptor-ligandparen die betrokken zijn bij cellulaire herkenningsprocessen die relevant zijn voor de ontwikkelingsbiologie en weefselhomeostase.
- Mechanische Risicoreductie: Valideert directe binaire interacties die kunnen worden gereciproceerd en herhaald, wat het vertrouwen in het target ondersteunt voorafgaand aan preklinische investeringen.
- Afstemming van Biomarkers: Gedetecteerde interacties kunnen biomarkerstrategieën informeren wanneer ze gekoppeld zijn aan cellulaire gedragingen zoals myocytfusie of neurale kamvorming.
Integratie van Pipeline & Workflow
AVEXIS past binnen het continuüm van ontdekkingen, van targetidentificatie tot leadoptimalisatie, in het bijzonder voor extracellulaire targets waarbij de interactiesterkte conventionele screening beperkt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door directe extracellulaire interacties te detecteren die over het hoofd worden gezien vanwege een lage affiniteit.
- Screening: Levert assay-ready, genormaliseerde eiwitbibliotheken die reproduceerbare, kwantitatieve interactiedetectie in een high-throughput formaat mogelijk maken.
- Analytics: Biedt colorimetrische read-outs via β-lactamase-hydrolyse, kwantificeerbaar bij 485 nm, wat interactiescoring en hit-prioritering mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt discovery aan preklinische relevantie door interacties te identificeren die cellulaire communicatie en herkenning reguleren.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het screenen van extracellulaire interactomen over meerdere targetfamilies en projecten heen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanische risicoreductie van extracellulaire targets door detectie van biologisch relevante interacties met een lage affiniteit.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde eiwitexpressie, normalisatie en detectie verminderen variabiliteit en verhogen de betrouwbaarheid van screening.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door interactienetwerken in een vroeg stadium te onthullen, waardoor biologische uitval in een late fase wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risicogestuurde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerd extracellulair interactiepotentieel.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in mammaliaanse celkweek, recombinant eiwitproductie en enzymatische detectie-assays.
- Afhankelijk van streptavidine-gecoate microtiterplaten, platenlezers en normalisatie-infrastructuur (dialyse, concentratie).
- Standaardisatie tussen teams is noodzakelijk voor de preparatie van de eiwitbibliotheek, normalisatiedrempels en protocollen voor hit-validatie.
- Toepasbaar op type I-, II- en GPI-gekoppelde receptoren en gesecreteerde eiwitten; niet geschikt voor multipass membraaneiwitten zoals ionkanalen.
- Praktische beperking: De preparatie van de bibliotheek is arbeidsintensief; de screeningsefficiëntie is afhankelijk van consistente normalisatie van bait en prey.
