Name: Micropipet Aspiratie van substraat-attached Cellen to Cell Stijfheid Schatting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Leer micropipet aspiratie om celstijfheid te meten bij substraat-gehechte cellen. Deze techniek analyseert visco-elastische eigenschappen en helpt bij het begrijpen van biomechanische veranderingen in ziekte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Pulling Glas Micropipetten Uitrusting: Micropipet Puller, Microforge. Glas: Boroscillicate glazen capillairen (~ 1,5 mm buitendiameter, ~ 1,4 mm interne diameter). <ol><li> Micropipetten getrokken met dezelfde basisbenadering waarmee glas micro-elektroden bereiden voor elektrofysiologie opnamen. In het kort wordt een glazen capillair verwarmd in het midden en wanneer het glas begint te smelten de twee helften van de capillaire elkaar getrokken opwekken van twee micropipetten. Meerdere commerciële trekkers zijn beschikbaar om deze taak variërend van relatief eenvoudige verticale trekkers die zwaartekracht gebruikt om de twee pipetten uit elkaar te zeer geavanceerde horizontale trekkers die meerdere programmeerbare opties om de snelheid en andere parameters van de pull variëren bieden voeren. Beide typen trekkers werden in onze experimenten. </li><li> Vereistes voor de geometrie van de pipetpunt: De toppen van de pipetten in deze experimenten typisch variëren van 2 tot 6 urn uitwendige diameter afhankelijk van de grootte van de cel. Een andere belangrijke parameter is de vorm van de tip, die moet ongeveer een cilindrische buis (zie figuur 1). Dit kan worden bereikt door het optimaliseren van de parameters van de trek en verificatie van de vorm van de tip onder de microscoop tot de gewenste vorm is verkregen. De optimale lengte van de schacht pipet afhankelijk van de hoeveelheid van verwachte vervorming: als de vervormingen klein &lt;10 urn, is het voldoende dat het cilindervormige deel van de pipet ook relatief kort is (dezelfde orde van grootte), voor grotere vervormingen dienovereenkomstig aanpassen. In het algemeen verhogen van de warmte en / of toename in &quot;pull&quot; vermindert de diameter van de tip. De toename van de &quot;pull&quot; genereert ook een tip met een langere taper. In onze experimenten met een Sutter P-97 horizontale pipet trekker, het programmageoptimaliseerd om de volgende parameters: Hitte van 473, Pull 22, Velocity 22, Time 200; Pressure 500. Het is ook mogelijk om cilindrische tips door aan een lange schacht en breken en polijsten. Gedetailleerde instructies hoe de verschillende types van de pipetten bereiden gegeven in de handleiding Sutter. </li><li> Microforge: Het is ook aanbevolen om te vuren-polijsten van de punt van de pipet om een glad glazen oppervlak dat een goede afdichting maakt naar de plasmamembraan te genereren. Dit gebeurt doordat de punt van de pipet om de nabijheid van een verwarmde glazen bol een zeer een fractie van een seconde met een microforge. Soortgelijke techniek wordt routinematig gebruikt voor het bereiden van micro-elektroden voor elektrofysiologische opnames. </li><li> Vullen van de Micropipet: Micropipetten worden gevuld met een fysiologische zoutoplossing, zoals PBS of niet-fluorescerende groeimedium. Belangrijk is dat de oplossing dient te worden aangevuld met 30% serum dat zal de cel mem makenBrane om soepel in de pipet. Twee benaderingen kunnen worden gebruikt om zich te ontdoen van luchtbellen in de punt van de pipet: (i) een punt van de pipet kan worden ondergedompeld in de oplossing eerst zodat de vloeistof aan het uiteinde te voorzien door capillaire krachten gevolgd door opvullen van de pipet aan de andere kant of (ii) de gehele pipet kan worden gevuld vanaf de achterkant door voorzichtig tikken op de schacht van de pipet om de bellen uit de tip. </li><li> Opmerking: pipetten moeten worden bereid op de dag van het experiment. </li></ol> 2. Bereiding van Cellen <ol><li> Enten van de cellen: Microaspiration wordt uitgevoerd op enkelvoudige cellen die ofwel gesuspendeerd blijven of aan de ondergrond. Om cellen in suspensie te zuigen, worden cellen opgetild hun substraten en gepipetteerd in een ondiepe longitudinale kamer die de omgekeerde microscoop gemonteerd vlak voor het experiment. Om substraat-gebonden cellen, cellen te zuigenworden gezaaid op kleine cover-slips (~ 10 mm diameter) die ook in de microaspiration kamer worden geplaatst voor het experiment. De reden om een ​​ondiepe longitudinale kamer gebruiken is om een ​​micropipet de cellen benadert een zeer kleine hoek, zo horizontaal mogelijk. Dit wordt gedaan om het membraan getrokken in de micropipet te worden gevisualiseerd op een vlak van focus (zie figuur 2) mogelijk. </li><li> Visualiseren celmembraan: Om het membraan uitsteeksel in de pipet voldoen worden celmembranen gekleurd met een lipofiel fluorescerende kleurstof, zoals Dii met een standaard kleuringsprotocol. <ol type="i"><li> Warm PBS oplossing. </li><li> Verdun de stock DII een werkconcentratie (5 uM) met verwarmde PBS oplossing. </li><li> Sonificeer gedurende 5 minuten om kleurstof aggregaten breken. </li><li> Spin down gedurende 5 minuten en neem supernatant. </li><li> Was de cellen in PBS 3 x 5 min elk. </li><li> Incubeer de cellen met de kleurstof, zodatOplossing voor 30 min in een 37 ° C incubator. </li><li> Spoel de cellen met PBS 3 maal gedurende 5 minuten elk. </li></ol></li><li> Opmerking: Het is mogelijk om DII kleuring van het membraan te vervangen door het visualiseren van de sub-membraan cytoskelet die ook wordt samengetrokken met het membraan in de pipet. Er moet worden gehouden rekening echter dat verstoren het cytoskelet kan veranderen de biomechanische eigenschappen van de cel. Bovendien, bij het uitvoeren van experimenten met microaspiration substraat bevestigde cellen, wordt aanbevolen om 3D beeldvorming gebruikt om de lengte van membraan projectie schatten in de pipet die onder een hoek met het brandvlak van de cellen. </li></ol> 3. Microaspiration en Image Acquisition Uitrusting: Omgekeerde fluorescentiemicroscoop, bij voorkeur met 3D deconvolutie-mogelijkheden (Zeiss Axiovert 200M met computer gestuurde Z-as beweging van de objectiviteites of een equivalent daarvan); videocamera is aangesloten op een computer (Axiocam MRM of een equivalent), Pressure Transducer (BioTek of een equivalent), Trillingsvrij station (TMD of een equivalent), micromanipulator (Narishige, Sutter, Burleigh of gelijkwaardig; manipulatoren kan mechanisch, hydraulisch of piëzo). Het is ook belangrijk om te benadrukken dat microaspiration kunnen worden uitgevoerd met een microscoop zonder 3D mogelijkheden om de stijfheid van cellen in suspensie, zoals rode bloedcellen of neutrofielen 1,2 3, geïsoleerd organellen, zoals nuclei 4 of kunstmatige liposomen 5 schatten. Image Acquisition software: Zeiss AxioVision of een equivalent. <ol><li> Monteer de cellen in een kamer microaspiration, zoals hierboven beschreven, op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Plaats de cellen kiezen van een cel voor een experiment en plaats deze in het midden van het gezichtsveld. Het is belangrijk perform deze experimenten in een trillingsvrije omgeving, in het bijzonder voor de experimenten met substraat-gebonden cellen omdat minuut typische vibraties die ontstaan ​​op banken en gewone tafels zijn waarschijnlijk volledig afbreuk doen aan de creatie van de afdichting, de punt van de micropipet of resulteren in breken verschuivingen in de positie van de tip dat zal verdraaien de analyse van de resultaten. </li><li> Plaats een micropipet gevuld met PBS / media w / serum oplossing in een pipethouder aangesloten op een transducer flexibele slang met de diameter aangepast aan de connector van de pipet houder voor een strakke pasvorm. In het begin van elk experiment de druk in de pipet is geëquilibreerd tot de atmosferische druk. De pipet is gemonteerd op een micromanipulator dat goede controle over de bewegingen in een pipet micron bereik. Plaats een pipet onder een kleine hoek met de bodem van de kamer en breng de punt van de pipet om het midden van het gezichtsveld. The schacht van de pipet, een cilindrisch deel van de pipetpunt waarin het membraan wordt afgezogen, is horizontaal uitgelijnd met het brandvlak door (1) het positioneren van de pipet met een ondiepe hoek mogelijk (10-15 °) en (2) door buigen van de schacht van de pipet tegen de bodem van de kamer. Omdat de steel zeer dun is flexibel genoeg om te glijden op de bodem van de kamer, terwijl het naderen van een cel, zoals schematisch weergegeven in figuur 1. Langzaam omlaag brengen van de micropipet aan de zijkant van een enkele cel met behulp van de cursus manipulator tot nabij het vlak van focus voor de cel. Vervolgens met een fijne manipulator verplaatsen micropipet naar de rand van de cel totdat de punt van de pipet zachtjes raakt het membraan. Neem een ​​beeld aan de positie van de pipet observeren. Goede afdichtingen worden gemaakt wanneer het hele punt van de pipet is volledig in contact met het celoppervlak en het contact is stabiel. Er is geen sterke objectief criterium, maar over hoe goed het zegel is excEPT voor het visueel onderzoek. </li><li> Breng een stap van negatieve druk met behulp van de transducer en handhaven tot op membraan projectie is gestabiliseerd. De hoeveelheid druk die nodig is om het membraan te zuigen in de pipet afhankelijk van celtype en specifieke experimentele omstandigheden. In onze experimenten aanvankelijke vervorming wordt typisch waargenomen bij de toepassing van druk in het bereik van -2 to-15mm Hg. Wanneer de druk wordt toegepast, wordt het membraan geleidelijk vervormd in de pipet tot deze gestabiliseerd op bepaalde lengte, een proces dat typisch ongeveer 2-3 minuten. Gedurende deze tijd worden beelden van membraan vervorming gemeten elke 30 sec om de voortgang van het membraan dat wordt getrokken in de pipet volgen. </li><li> De druk naar het volgende niveau in 2-5 mm Hg stappen en herhaal de hele procedure tot membraan uitsteeksel loskomt uit de cel en gaat in de pipet, waarna het experiment gestopt. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Analyse Om de mate van vervorming membraan kwantificeren, wordt de aangezogen lengte (L) gemeten van de punt van de pipet om het hoekpunt van de omtrek van het membraan projectie. Het is belangrijk op te merken dat een grotere pipet zal meer kracht op het celmembraan van toepassing op hetzelfde drukniveau. Het verklaren van de variabiliteit tussen de diameters van de pipetten daarom wordt de aangezogen lengte genormaliseerd voor de pipet diameter (D) gemeten voor elke experiment. De gegevens kunnen verder worden geanalyseerd met een standaard lineair visco-elastisch halfruimte model van de endotheliale cel, zoals beschreven in de eerdere studies 6,7. Specifiek werd de elasticiteitsmodulus van de cellen geschat met de formule: <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886eq1.jpg" /> waarin E is Young&#39;s modulus, een is de binnensteradius van de pipet, Ap het drukverschil, L de lengte overeenkomt aangezogen en φ (η) een wand functioneren berekend met de kracht model, zoals beschreven door Theret et al. 7. Het is belangrijk op te merken dat meerdere modellen zijn gebruikt om de data microaspiration met een eindige elementen model dat veronderstelt dat een cel een vervormbaar gebied met isotrope homogene materiaaleigenschappen en vloeistofdruppel modellen, die ervan uitgaan dat cellen een bolvorm vormen analyseren kan continu vervormen, en te herstellen bij de uitslag, zoals beschreven in een aantal uitstekende reviews: 8-10. Microaspiration kan ook worden gebruikt om andere biomechanische parameters van cellen en weefsels, zoals cellulaire viscoelastische eigenschappen, corticale spanning en bijdrage van de verschillende structurele elementen aan cellen en weefsels biomechanica (zie de foto hierboven voor meer informatie) onderzoeken. 5. VertegenwoordigerResultaten In eerdere onderzoeken werd micropipet aspiratie uitgevoerd hetzij liposomen 5 of op cellen die niet aan het substraat 2,11-13. In onze studies zijn echter de cellen normaliter gehandhaafd aan het substraat veranderingen in het cytoskelet structuur die kunnen optreden wanneer cellen los 14-16 vermijden. Om het gebruik van microaspiration techniek voor substraat-aangehechte cellen valideren testten we of verstoring van F-actine resulteert in de afname cel stijfheid van de aorta van runderen endotheelcellen (BAECs), zoals geschat door deze benadering. Figuur 3 blijkt dat, zoals verwacht , dit is inderdaad het geval is. Specifiek Figuur 3A toont een typische reeks fluorescerende beelden van endotheliale membraan progressieve vervorming ondergaan in reactie op negatieve druk aangebracht door een micropipet. Zoals verwacht wordt het membraan geleidelijk opgezogen in de pipet en aspirated lengte toeneemt als functie van de toegepaste druk. De tijd-vakken van de vervorming zien dat verstoring van F-actine aanzienlijk aangezogen lengten van de projecties onder alle drukomstandigheden (Figuur 3B) 14 verhoogt. Met deze benadering hebben we ontdekt dat cellen stijfheid toeneemt wanneer celmembranen uitgeput cholesterol dat cholesterol verrijkt had geen effect 14. Figuur 4 toont een cholesterol verrijkte cel, een controle cel en een cholesterol geledigde cellen na het bereiken van maximale lengte bij aspiratie -15 mm Hg (4A). De uitsteeksels typisch beginnen te ontwikkelen at-10mmHg en de tijd-vakken membraan vervorming kan worden gemeten voor het onderdrukken van -10, -15 en -20 mm Hg (4B). Toepassing van een druk boven-25mmHg resulteerde in onthechting van de aangezogen projectie die een zelfstandige blaasje. Het drukniveau dat resulteerde in membraan detachement was similar onder verschillende omstandigheden cholesterol. Deze waarneming was zeer onverwacht omdat eerdere studies is gebleken dat membraan lipide dubbellagen een toename van de membraan cholesterol de stijfheid van het membraan 5,17 verhoogt. Onze verdere studies bevestigden deze waarnemingen met behulp van verschillende onafhankelijke benaderingen, met inbegrip van Atomic Force Microscopy 18,19 en Force Microscopie Traction 20. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematisch zijaanzicht van een opname pipet. De pipet wordt getrokken om een cilindrische schacht top (zijaanzicht) genereren. Micropipet parameters: D = 2a = inwendige diameter en ED = 2b = buitendiameter. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig2.jpg" /> Figuur 2. Micropipet naderen van een substraat aangesloten cel (A) Schematische zijaanzicht;. (B) Bright contrast beeld van een micropipet shank het aanraken van een typisch gevormde cel gebruikt in aspiratie experimenten; (C) TL-beeld van dezelfde cel gelabeld met DiIC 18. De micropipet is nog steeds aanwezig, maar is onzichtbaar (Van 14). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig3.jpg" /> Figuur 3. Validatie van meetcel stijfheid in substraat-ingeschreven cellen met behulp van microaspiration. A: Beelden van progressieve vervorming van BAECs membraan onder controle omstandigheden na blootstelling aan latrunculin De pipet is onzichtbaar op de afbeeldingen omdat het niet fluoresceren.. De cellen werden blootgesteld aan 2 uM latrunculin A gedurende 10 min met aanmerkelijk verminderde de hoeveelheid F-actine, zoals gemeten door rhodamine-fluorescentie phalloidin (niet getoond) maar had geen significant effect op de celvorm. In een latrunculin behandelde cel, een verdunning van het membraan in het midden van de projectie aangezogen maar het uitsteeksel wordt nog aan de cel. B. Effect van latrunculin A op het tijdsverloop van membraan vervorming wanneer L opgezogen lengte van het membraan projectie en D de diameter van de pipet voor controle cellen (n = 14) en cellen blootgesteld aan 2 uM latrunculin A gedurende 10 min (n = 5). De cellen werden afgezogen met -10 mm Hg (ruiten), -15 mm Hg (vierkanten) en -20 mm Hg (driehoeken). (Van 14.) <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig4.jpg" /> Figuur 4. Effect van cellulaire cholesterol op membraan vervorming van BAECs. . Een typische beelden membraan vervorming van cholesterol verrijkte, cholesterol arme en controle cellen (controle cellen werden blootgesteld aan MβCD: MβCD-cholesterol mengsel bij 1:1 ratio die geen effect op het niveau van vrij cholesterol was in de cellen (zie inzet). getoonde afbeeldingen tonen de maximale vervorming bij -15 mm Hg. De pijl geeft de positie van de aangezogen projectie. De bar is 30 pm. B. Gemiddelde tijd-cursussen van aangezogen lengten voor de drie experimentele celpopulaties. C. Maximale opgezogen lengten uitgezet als functie van de toegepaste druk. De maximale genormaliseerde lengte in lege cellen was significant lager dan die van controle cellen voor drukken -15 mm Hg en -20 mm Hg (P &lt;0,05). (Van 14.)

<ol><li>Rand, R. P., Burton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+red+cell+membrane.+I.+Membrane+stiffness+and+intracellular+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the red cell membrane. I. Membrane stiffness and intracellular pressure.</a> Biophys. J. 4, 115-135 (1964).</li>
<li>Discher, D. E., Mohandas, N., Evans, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+maps+of+red+cell+deformation%3A+hidden+elasticity+and+in+situ+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular maps of red cell deformation: hidden elasticity and in situ connectivity.</a> Science. 266, 1032-1035 (1994).</li>
<li>Schmid-Schönbein, G. W., Sung, K. L., Tözeren, H., Skalak, R., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+mechanical+properties+of+human+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Passive mechanical properties of human leukocytes.</a> Biophys. J. 36, 243-256 (1981).</li>
<li>Guilak, F., Tedrow, J. R., Burgkart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Re.s+Commun%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of the cell nucleus.</a> Biochem. Biophys. Re.s Commun. 269, 781-786 (2000).</li>
<li>Needham, D., Nunn, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+deformation+and+failure+of+lipid+bilayer+membranes+containing+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Elastic deformation and failure of lipid bilayer membranes containing cholesterol.</a> Biophys. J. 58, 997-1009 (1990).</li>
<li>Sato, M., Theret, D. P., Wheeler, L. T., Ohshima, N., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+micropipette+technique+to+the+measurement+of+cultured+porcine+aortic+endothelial+cell+viscoelastic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Application of the micropipette technique to the measurement of cultured porcine aortic endothelial cell viscoelastic properties.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 112, 263-268 (1990).</li>
<li>Theret, D. P., Levesque, M. J., Sato, F., Nerem, R. M., Wheeler, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+a+homogeneous+half-space+model+in+the+analysis+of+endothelial+cell+micropipette+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The application of a homogeneous half-space model in the analysis of endothelial cell micropipette measurements.</a> J. of Biomechanical Engineering. 110, 190-199 (1988).</li>
<li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of living cells.</a> J. Biomech. 33, 15-22 (2000).</li>
<li>Lim, C. T., Zhou, E. H., Quek, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+models+for+living+cells--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Mechanical models for living cells--a review.</a> Journal of Biomechanics. 39, 195(2006).</li>
<li>Zhao, R., Wyss, K., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+analytical+and+inverse+finite+element+approaches+to+estimate+cell+viscoelastic+properties+by+micropipette+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Comparison of analytical and inverse finite element approaches to estimate cell viscoelastic properties by micropipette aspiration.</a> Journal of Biomechanics. 42, 2768(2009).</li>
<li>Chien, S., Sung, K. L., Skalak, R., Usami, S., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+and+experimental+studies+on+viscoelastic+properties+of+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Theoretical and experimental studies on viscoelastic properties of erythrocyte membrane.</a> Biophys. J. 24, 463-487 (1978).</li>
<li>Evans, E., Kuhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+material+behavior+of+granulocytes+based+on+large+deformation+and+recovery+after+deformation+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Passive material behavior of granulocytes based on large deformation and recovery after deformation tests.</a> Blood. 64, 1028-1035 (1984).</li>
<li>Sato, M., Levesque, M. J., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells+exposed+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of cultured bovine aortic endothelial cells exposed to shear stress.</a> Arteriosclerosis. 7, 276-286 (1987).</li>
<li>Byfield, F., Aranda-Aspinoza, H., Romanenko, V. G., Rothblat, G. H., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+depletion+increases+membrane+stiffness+of+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cholesterol depletion increases membrane stiffness of aortic endothelial cells.</a> Biophys. J. 87, 3336-3343 (2004).</li>
<li>Byfield, F. J., Hoffman, B. D., Romanenko, V. G., Fang, Y., Crocker, J. C., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+role+of+cell+stiffness+in+modulation+of+volume-regulated+anion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Evidence for the role of cell stiffness in modulation of volume-regulated anion channels.</a> Acta. Physiologica. 187, 285-294 (2006).</li>
<li>Byfield, F. J., Reen, R. K., Shentu, T. -P., Levitan, I., Gooch, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+actin+and+cell+stiffness+is+modulated+by+substrate+stiffness+in+2D+and+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Endothelial actin and cell stiffness is modulated by substrate stiffness in 2D and 3D.</a> Journal of Biomechanics. 42, 1114(2009).</li>
<li>Evans, E., Needham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+surfactant+bilayer+membranes%3A+thermal+transitions%2C+elasticity%2C+rigidity%2C+cohesion+and+colloidal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Physical properties of surfactant bilayer membranes: thermal transitions, elasticity, rigidity, cohesion and colloidal interactions.</a> Journal of Physical Chemistry. 91, 4219-4228 (1987).</li>
<li>Sun, M., Northup, N., Marga, F., Huber, T., Byfield, F. J., Levitan, I., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cellular+cholesterol+on+membrane-cytoskeleton+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of cellular cholesterol on membrane-cytoskeleton adhesion.</a> J. Cell. Sci. 120, 2223-2231 (2007).</li>
<li>Shentu, T. P., Titushkin, I., Singh, D. K., Gooch, K. J., Subbaiah, P. V., Cho, M., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((oxLDL-induced+decrease+in+lipid+order+of+membrane+domains+is+inversely+correlated+with+endothelial+stiffness+and+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">oxLDL-induced decrease in lipid order of membrane domains is inversely correlated with endothelial stiffness and network formation.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, 218-229 (2010).</li>
<li>Norman, L. L., Oetama, R. J., Dembo, M., Byfield, F., Hammer, D. A., Levitan, I., Aranda-Espinoza, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+Cellular+Cholesterol+Content+Affects+Traction+Force%2C+Adhesion+and+Cell+Spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Modification of Cellular Cholesterol Content Affects Traction Force, Adhesion and Cell Spreading.</a> Cell Mol. Bioeng. 3, 151-162 (2010).</li>
<li>Mitchinson, J. M., Swann, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanical+Properties+of+the+Cell+Surface%3A+I.+The+Cell+Elastimeter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Mechanical Properties of the Cell Surface: I. The Cell Elastimeter.</a> J. of Experimental Biology. 31, 443-460 (1954).</li>
<li>Byfield, F. J., Tikku, S., Rothblat, G. H., Gooch, K. J., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OxLDL+increases+endothelial+stiffness%2C+force+generation%2C+and+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">OxLDL increases endothelial stiffness, force generation, and network formation.</a> J. Lipid Res. 47, 715-723 (2006).</li>
<li>Ohashi, T., Ishii, Y., Ishikawa, Y., Matsumoto, T., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+numerical+analyses+of+local+mechanical+properties+measured+by+atomic+force+microscopy+for+sheared+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Mater.+Eng%22%5BJournal%5D)">Experimental and numerical analyses of local mechanical properties measured by atomic force microscopy for sheared endothelial cells.</a> Biomed. Mater. Eng. 12, 319-327 (2002).</li>
<li>Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+adaptation+and+stiffness+matching+to+soft+elastic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates.</a> Biophysical Journal. 93, 4453(2007).</li>
<li>Kowalsky, G. B., Byfield, F. J., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((oxLDL+facilitates+flow-induced+realignment+of+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">oxLDL facilitates flow-induced realignment of aortic endothelial cells.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 295, 332-340 (2008).</li>
<li>Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cancer+progression+on+the+viscoelasticity+of+ovarian+cell+cytoskeleton+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Kole, T. P., Tseng, Y., Huang, L., Katz, J. L., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinase+regulates+the+intracellular+micromechanical+response+of+adherent+cells+to+rho+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Rho kinase regulates the intracellular micromechanical response of adherent cells to rho activation.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3475-3484 (2004).</li>
<li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+the+Actin+Cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton.</a> Science. 279, 509-514 (1998).</li>
<li>Okajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+for+the+Examination+of+Single+Cell+Rheology.+In%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy for the Examination of Single Cell Rheology. In.</a> Methods Mol. Biol. 736, 303-329 (2011).</li>
<li>Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+across+the+cell+surface+and+through+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction across the cell surface and through the cytoskeleton.</a> Science. 260, 1124-1127 (1993).</li>
<li>Fabry, B., Maksym, G. N., Butler, J. P., Glogauer, M., Navajas, D., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+the+microrheology+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Scaling the microrheology of living cells.</a> Physical Review Letters. 87, 148102(2001).</li>
<li>Park, C. Y., Tambe, D., Alencar, A. M., Trepat, X., Zhou, E. H., Millet, E., Butler, J. P., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+cytoskeletal+prestress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mapping the cytoskeletal prestress.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 298, C1245-C1252 (2010).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophys. J. 80, 1744-1757 (2001).</li>
<li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-tracking+microrheology+of+living+cells%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 301-326 (2009).</li>
<li>Shin, D., Athanasiou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoindentation+for+obtaining+cell+biomechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties.</a> J. Orthop. Res. 17, 880-890 (1999).</li>
<li>Ou-Yang, H. D., Wei, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+fluids%3A+probing+mechanical+properties+of+biological+systems+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Complex fluids: probing mechanical properties of biological systems with optical tweezers.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 61, 421-440 (2010).</li>
<li>Hosu, B. G., Sun, M., Marga, F., Grandbois, M., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+membrane+tethers+revisited+using+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic membrane tethers revisited using magnetic tweezers.</a> Phys. Biol. 4, 67-78 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Microaspiration een eenvoudige en zeer reproduceerbare methode cel stijfheid / vervormbaarheid schatten door negatieve druk op een celmembraan en het meten membraan vervormbaarheid in reactie op welbepaalde druk. Het werd voor het eerst ontwikkeld door Mitchison en Swann (1954) om de elastische eigenschappen van de zee-egel eitjes te karakteriseren om inzicht te verschaffen in de mechanismen van celdeling 21 en vervolgens te kijken naar de mechanische eigenschappen in de rode bloedcellen 1. Deze me...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Winkel / Modelnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Sutter pipet trekker </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Microforge </td><td> Narishige </td><td> MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Omgekeerde fluorescentiemicroscoop </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert 200M </td><td> De microscoop bij voorkeur voorzien 3D/deconvolution mogelijkheden. </td></tr><tr><td> Videocamera </td><td> Zeiss </td><td> Axiocam MRM </td><td></td></tr><tr><td> Image Acquisition sotware </td><td> Zeiss </td><td> AxioVision </td><td></td></tr><tr><td> Pneumatische Pressure Transducer </td><td> BioTek </td><td> DPM-1B </td><td> DPM1B Pneumatische Transducer Tester kan nu worden gevonden door FLUKE. </td></tr><tr><td> Pipetteer glas </td&gt; <td> Richland </td><td> Aangepaste glas </td><td> Pipetten werden aangepast met een binnendiameter 1,2 en 1,6 buitendiameter. </td></tr><tr><td> Dil Dye </td><td> Invitrogen </td><td> D282 </td><td> Goed oplost in DMSO </td></tr></tbody></table>

micropipet aspiratie van substraat-attached cellen to cell stijfheid schatting

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Groeiend aantal studies tonen aan dat biomechanische eigenschappen van individuele cellen belangrijke rol spelen in meerdere cellulaire functies, met inbegrip van celproliferatie, differentiatie, migratie en cel-cel interacties. De twee belangrijkste parameters van cellulaire biomechanica cellulair vervormbaarheid of stijfheid en het vermogen van de cellen samentrekken en genereren kracht. Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om cellen stijfheid schatten door de mate van vervorming membraan in reactie op negatieve druk van een glazen micropipet aan het celoppervlak, een techniek die genoemd Micropipet Verlangen of Microaspiration. Microaspiration wordt uitgevoerd door aan een glazen capillair met een micropipet maken met een zeer kleine tip (2-50 urn diameter afhankelijk van de grootte van een cel of een weefselmonster), die vervolgens wordt verbonden met een pneumatische drukopnemer en afgedaan nabijheid van een cel onder een microscoop. Wanneer depunt van de pipet raakt een cel, een stap van negatieve druk wordt uitgeoefend op de pipet door de pneumatische drukopnemer genereren welbepaalde druk op de celmembraan. Onder druk wordt het membraan opgezogen in de pipet en progressieve vervorming membraan of &quot;membraan projection&quot; in de pipet wordt gemeten als functie van de tijd. Het basisprincipe van deze experimentele benadering is dat de mate van vervorming membraan in reactie op een bepaalde mechanische kracht is een functie van membraan stijfheid. Hoe stijver het membraan, hoe langzamer de snelheid van membraanassociatie vervorming en hoe korter de steady-state aspiratie length.The techniek uitgevoerd op geïsoleerde cellen, zowel in suspensie en substraat vastgemaakte grote organellen worden, en liposomen. Analyse vindt plaats door vergelijking maximale membraan vervormingen bereikt onder een bepaalde druk voor verschillende celpopulaties of experimentele omstandigheden. Een &quot;stijfheid coëfficiënt&quot; is estimated getrokken waarbij de aangezogen lengte van vervorming membraan als functie van de toegepaste druk. Bovendien kunnen de gegevens verder worden geanalyseerd om de Young&#39;s modulus van de cellen (E), de meest voorkomende parameter stijfheid van materialen kenmerken schatten. Het is belangrijk op te merken dat plasma membranen van eukaryote cellen kunnen worden beschouwd als een bi-component systeem waar membraan lipide dubbellaag wordt underlied de sub-membraan cytoskelet en dat het het cytoskelet dat de mechanische steiger van het membraan vormt en domineert de vervormbaarheid van de cellulaire envelop. Deze benadering derhalve kan het sonderen van de biomechanische eigenschappen van het sub-membraan cytoskelet.

Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om cellen stijfheid te meten. Het algemene principe van deze benadering is membraan vervorming te meten in reactie op welbepaalde negatieve druk aangebracht door een micropipet op het celoppervlak. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om biomechanische eigenschappen van substraat-aangehechte cellen te bestuderen.

Micropipet Aspiratie van substraat-attached Cellen to Cell Stijfheid Schatting

Een groeiend aantal studies laat zien dat de biomechanische eigenschappen van individuele cellen een belangrijke rol spelen bij meerdere cellulaire functies, waaronder cel...

Het doel van het volgende experiment is om cellulaire viscoelastische eigenschappen te analyseren onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit wordt bereikt door negatieve druk uit te oefenen op het celmembraan via een glazen micropipet, verbonden met een druktransducer die is vervaardigd uit glazen capillairen met behulp van een micropipet-puller. De pipet is gemonteerd op een fijne micromanipulator die zich op de tafel van een omgekeerde microscoop bevindt, waarna de punt van de pipet in nauwe nabijheid van een cel wordt gebracht.Vervolgens wordt er een zegel gevormd tussen de punt van de pipet en het celmembraan, waarna de membraandeformatie in de pipet wordt gemeten als reactie op een toegepaste stap van negatieve druk. Er worden resultaten verkregen die de effecten van verschillende behandelingen op cellulaire biomechanische eigenschappen tonen, gebaseerd op de mate van membraandeformatie in reactie op een nauwkeurig gedefinieerde kracht. Het doel van ons laboratorium is om de impact van dyslipidemie op de biofysische en biomechanische eigenschappen van vasculaire endotheelcellen te onderzoeken, en we gaan u vandaag vertellen over een methode genaamd micropipet-aspiratie die wij gebruiken om celstijfheid te meten.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het fundamentele begrip van de cellulaire biomechanica in diverse mechanismen, zoals angiogenese, mechanische sensing, migratie en meer. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de cellulaire biomechanica, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals modelmembranen, intracellulaire organellen of weefsels. Om het celmembraan te visualiseren en de membraanprojectie in de pipet te observeren, worden vasculaire endotheliale celmembranen gekleurd met een lipofiele fluorescente kleurstof.Om te beginnen wordt de stockoplossing van de kleurstof verdund tot een werkconcentratie met een verwarmde PBS-oplossing; soniceren het mengsel gedurende vijf minuten om de D-aggregaten af te breken. Na een centrifugatie van vijf minuten in de microcentrifuge wordt het supernatant verwijderd en worden de vasculaire endotheelcellen gewassen door 0,5 milliliter PBS toe te voegen. Na vijf minuten wordt de oplossing geaspireerd en wordt dit wasproces nog twee keer herhaald.Voeg vervolgens de dice-oplossing toe aan de cellen en incubeer deze gedurende 30 minuten in een incubator op 37 graden Celsius. Was na de incubatie de cellen opnieuw met PBS zoals voorheen. Micropipetten worden getrokken door een glazen capillair in het midden te verhitten.Wanneer het glas begint te smelten, worden de twee helften van de capillair uit elkaar getrokken om twee micropipetten te vormen. De tips van de pipetten die in deze experimenten worden gebruikt, variëren doorgaans tussen de twee en zes micron. De buitendiameter, afhankelijk van de grootte van de cel, en de vorm van de tip moeten benaderen die van een cilindrische buis voordat de glazen capillair in de pipettrekker wordt geplaatst.In deze demonstratie wordt de Suter P 97 horizontale pipetpuller gebruikt met een geoptimaliseerd programma. Deze puller biedt meerdere programmeerbare opties om de snelheid en andere parameters van het trekproces te variëren. Ga over tot het activeren van het pullprogramma.Verifieer na het uitrekken van elke micropipet de vorm van de punt onder de microscoop. Vul de micropipet na het vuurpolijsten van de punt met een fysiologische zoutoplossing, zoals PBS of niet-fluorescente groeimedia. Belangrijk is dat de oplossing wordt aangevuld met 30% serum, wat de celmembraan in staat stelt om soepel in de pipet te bewegen. In deze demonstratie wordt een inverted fluorescentiemicroscoop met 3D-deconvolutiemogelijkheden gebruikt, met een videocamera die is verbonden met een computer, een druktransducer, een trillingsvrij station en een micromanipulator om cellen in een micro-aspiratiekamer te plaatsen door de cellen van hun substraten te tillen en ze in een ondiepe longitudinale kamer te pipetteren die op de inverted fluorescentiemicroscoop is gemonteerd.De reden voor het gebruik van een ondiepe longitudinale kamer is om een micropipet de cellen onder een zeer flauwe hoek te laten benaderen, zo dicht mogelijk bij het horizontale vlak. Dit wordt gedaan om het membraan dat in de micropipet wordt getrokken in één enkel focusvlak te kunnen visualiseren. Plaats een gevulde micropipet in een pipethouder die via flexibele slang is verbonden met een krachttransducer, waarbij de diameter is aangepast aan de connector van de pipethouder voor een nauwe aansluiting.Aan het begin van elk experiment wordt de druk in de pipet gelijkgesteld aan de atmosferische druk; monteer de pipet vervolgens op een micromanipulator die een nauwkeurige besturing van de pipetbewegingen in het micronbereik mogelijk maakt. Positioneer de pipet onder een flauwe hoek ten opzichte van de bodem van de kamer en breng de punt van de pipet naar het centrum van het gezichtsveld. De schacht van de pipet, het cilindrische deel van de pipetpunt waarin het membraan wordt opgezogen, dient horizontaal te worden uitgelijnd met het brandvlak.Om deze eerste positie te bereiken, plaatst u de pipet onder de kleinst mogelijke hoek en buigt u vervolgens de schacht van de pipet tegen de bodem van de kamer. Omdat de schacht zeer dun is, is deze flexibel genoeg om over de bodem van de kamer te glijden terwijl een cel wordt benaderd. Breng de micropipet langzaam naar de zijkant van een enkele cel met behulp van de grove manipulator, tot u zich dicht bij het focusvlak van de cel bevindt.Beweeg vervolgens met de fijne manipulator de micropipet naar de rand van de cel totdat de tip van de pipet de membraan zachtjes raakt. Neem een afbeelding om de positie van de pipet te observeren. Goede afdichtingen worden gecreëerd wanneer de gehele tip van de pipet volledig in contact staat met het celoppervlak en dit contact stabiel is.Pas vervolgens een stap van negatieve druk toe met behulp van de transducer en handhaaf deze totdat de projectie van het membraan is gestabiliseerd. De hoeveelheid druk die nodig is om het membraan in de pipet te aspireren, varieert afhankelijk van het celtype en de specifieke experimentele omstandigheden. Initiële deformatie wordt doorgaans waargenomen bij het toepassen van een druk in het bereik van min twee tot min 15 millimeter kwik.Wanneer de druk wordt aangelegd, vervormt het membraan zich geleidelijk in de pipet tot het op een bepaalde lengte is gestabiliseerd. Tijdens dit proces, dat gewoonlijk twee tot drie minuten duurt, moeten elke 30 seconden beelden van de membraanvervorming worden gemaakt om de progressie van het in de pipet getrokken membraan te volgen. Verhoog vervolgens de druk naar het volgende niveau in stappen van twee tot vijf millimeter kwik.Herhaal de volledige procedure totdat de membraanprojectie loslaat van de cel en in de pipet beweegt, waarna het experiment wordt gestopt. Om de mate van membraandeformatie te kwantificeren, wordt de geaspireerde lengte gemeten vanaf de tip van de pipet tot het hoogste punt van de omtrek van de membraanprojectie. Een grotere pipet zal bij hetzelfde druk niveau meer kracht uitoefenen op het celmembraan om rekening te houden met de variabiliteit tussen de diameters van de pipetten.De geaspireerde lengte is genormaliseerd voor de pipetdiameter die voor elk experiment is gemeten om het gebruik van de microaspiratietechniek voor aan het substraat gehechte cellen te valideren; er werd getest of een disruptie van F-actine resulteert in een afname van de celstijfheid van runder-aortale endotheelcellen zoals geschat met deze methode. Hier wordt, zoals verwacht, een typische reeks fluorescentiebeelden getoond van een endotheelmembraan dat een progressieve deformatie ondergaat als reactie op de negatieve druk die via een micropipet wordt uitgeoefend. Het membraan wordt geleidelijk in de pipet geaspireerd en de geaspireerde lengte neemt toe als functie van de uitgeoefende druk; tijdskoersen van de deformatie laten zien dat disruptie van F-actine de geaspireerde lengtes van de projecties onder alle drukcondities significant verhoogt.Met deze aanpak werd ontdekt dat de celstijfheid toeneemt wanneer cellulaire membranen zijn uitgeput van cholesterol, terwijl cholesterolverrijking geen effect had. Hier worden een cholesterolverrijkte cel, een controlecel en een cholesteroluitgeputte cel getoond nadat maximale aspiratielengten van minus 15 millimeter kwik zijn bereikt. De projecties begonnen zich doorgaans te ontwikkelen bij minus 10 millimeter kwik, en de tijdsverlopen van membraandeformatie konden worden gemeten voor de negatieve drukken van 10, 15 en 20 millimeter kwik.Hier zijn de maximale geaspireerde lengtes uitgezet als functie van de aangelegde druk. De maximale genormaliseerde lengte in uitgeputte cellen was significant lager dan die van controlecellen bij drukken van minus 15 millimeter kwik en minus 20 millimeter kwik. Toepassing van negatieve drukken boven de 25 millimeter kwik leidde tot het loslaten van de geaspireerde projectie, waardoor een afzonderlijke vesikel ontstond.Het drukniveau dat leidde tot membraanloslating was vergelijkbaar onder verschillende cholesterolcondities, wat een onverwachte observatie was. Eerdere studies tonen namelijk aan dat een toename van membraancholesterol de stijfheid van membraanlipidendubbellagen verhoogt. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee tot drie uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Bij het toepassen van deze techniek is het belangrijk om te onthouden dat dit experiment op individuele cellen wordt uitgevoerd.Daarom moeten drie tot vijf cellen per conditie en per experiment worden geanalyseerd, over een totaal van drie experimenten.

micropipette-aspiration-substrate-attached-cells-to-estimate-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We presenteren een protocol voor het buigen van draadvormige bacteriële cellen bevestigd aan een cover-slip oppervlak met een optische val van de cellulaire buigstijfheid te meten.

Het meten van de buigstijfheid van de bacteriële cellen Met behulp van een optische val

We presenteren twee onafhankelijke, microscoop-gebaseerde tools om de veroorzaakte nucleaire en cytoskelet vervormingen in enkele, levende hechtende cellen te meten in reactie op globale of lokale stam toepassing. Deze technieken worden gebruikt om de nucleaire stijfheid (dat wil zeggen, vervormbaarheid) te bepalen en om intracellulaire krachtoverbrenging tussen de kern en het cytoskelet sonde.

Biofysische Testen om de mechanische eigenschappen van de interfase celkern Probe: Basismateriaal Strain Toepassing en micronaaldjes Manipulatie

Een hechting frequentie test voor het meten van receptor-ligand interactie kinetiek wanneer beide moleculen zijn verankerd op het oppervlak van de interagerende cellen is beschreven. Deze mechanisch-gebaseerde test wordt geïllustreerd met behulp van een micropipet-druk menselijke rode bloedcel als adhesie sensor en integrine αLβ2 en intercellulaire adhesie molecuul-1 als interactie-receptoren en liganden.

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

De mechanische eigenschappen van endotheliale glycocalyx gemeten door inkeping met micron bollen op AFM uitkragingen. Endotheelcellen werden gekweekt in een aangepaste kamer onder fysiologische voorwaarden stroom glycocalyx expressie te induceren. De gegevens werden geanalyseerd met een dunne film model de glycocalyx dikte en modulus te bepalen.

Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy

Deze paper toont een protocol om de mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren door middel van microindentation gebruik van een Atomic Force Microscope (AFM).

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Hier wordt een methode beschreven die snelle, efficiënte en goedkope bereiding van polyacrylamide gels in een multiwell plate formaat mogelijk maakt. De methode vereist geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden overgenomen door elk onderzoekslaboratorium. Het zou bijzonder nuttig zijn in onderzoek gericht op het begrijpen van stijfheidsafhankelijke celreacties.

Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen

Ondergronden met stijfheid in het kilopascal-bereik zijn nuttig zijn te onderzoeken van de reactie van cellen op fysiologisch relevante stijfheid van de micro-omgeving. Met behulp van slechts een widefield fluorescentie Microscoop, kan de Youngs modulus van zachte siliconen gel worden bepaald met behulp van een inkeping met een geschikt gebied.

Meting van de stijfheid van zachte siliconen substraten voor Mechanobiology Studies met een Widefield fluorescentie Microscoop

Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.

Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

Hier wordt een methode gepresenteerd om afzonderlijke cellen mechanisch te fenotyperen met behulp van een op elektronica gebaseerd microfluïdisch platform dat mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) wordt genoemd. Dit platform handhaaft een gematigde doorvoer van 1-10 cellen / s terwijl het zowel de elastische als viskeuze biofysische eigenschappen van cellen meet.

Mechano-Node-Pore Sensing: een snel, labelvrij platform voor multi-parameter single-cell visco-elastische metingen

De verkenning van cellulair gedrag onder mechanische stress is cruciaal voor vooruitgang in cellulaire mechanica en mechanobiologie. We introduceren de Fluorescence Micropipette Aspiration (fMPA)-techniek, een nieuwe methode die gecontroleerde mechanische stimulatie combineert met uitgebreide analyse van intracellulaire signalering in afzonderlijke cellen. Deze techniek onderzoekt nieuwe diepgaande studies van mechanobiologie van levende cellen.

Fluorescentie-micropipetaspiratietest om mechanosensing van rode bloedcellen te onderzoeken

Leer micropipet aspiratie om celstijfheid te meten bij substraat-gehechte cellen. Deze techniek analyseert visco-elastische eigenschappen en helpt bij het begrijpen van biomechanische veranderingen in ziekte.

Micropipet Aspiratie van substraat-attached Cellen to Cell Stijfheid Schatting

Meer video's verkennen