Micropipet Aspiratie van substraat-attached Cellen to Cell Stijfheid Schatting

Het doel van het volgende experiment is om cellulaire viscoelastische eigenschappen te analyseren onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit wordt bereikt door negatieve druk uit te oefenen op het celmembraan via een glazen micropipet, verbonden met een druktransducer die is vervaardigd uit glazen capillairen met behulp van een micropipet-puller. De pipet is gemonteerd op een fijne micromanipulator die zich op de tafel van een omgekeerde microscoop bevindt, waarna de punt van de pipet in nauwe nabijheid van een cel wordt gebracht.

Vervolgens wordt er een zegel gevormd tussen de punt van de pipet en het celmembraan, waarna de membraandeformatie in de pipet wordt gemeten als reactie op een toegepaste stap van negatieve druk. Er worden resultaten verkregen die de effecten van verschillende behandelingen op cellulaire biomechanische eigenschappen tonen, gebaseerd op de mate van membraandeformatie in reactie op een nauwkeurig gedefinieerde kracht. Het doel van ons laboratorium is om de impact van dyslipidemie op de biofysische en biomechanische eigenschappen van vasculaire endotheelcellen te onderzoeken, en we gaan u vandaag vertellen over een methode genaamd micropipet-aspiratie die wij gebruiken om celstijfheid te meten.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het fundamentele begrip van de cellulaire biomechanica in diverse mechanismen, zoals angiogenese, mechanische sensing, migratie en meer. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de cellulaire biomechanica, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals modelmembranen, intracellulaire organellen of weefsels. Om het celmembraan te visualiseren en de membraanprojectie in de pipet te observeren, worden vasculaire endotheliale celmembranen gekleurd met een lipofiele fluorescente kleurstof.

Om te beginnen wordt de stockoplossing van de kleurstof verdund tot een werkconcentratie met een verwarmde PBS-oplossing; soniceren het mengsel gedurende vijf minuten om de D-aggregaten af te breken. Na een centrifugatie van vijf minuten in de microcentrifuge wordt het supernatant verwijderd en worden de vasculaire endotheelcellen gewassen door 0,5 milliliter PBS toe te voegen. Na vijf minuten wordt de oplossing geaspireerd en wordt dit wasproces nog twee keer herhaald.

Voeg vervolgens de dice-oplossing toe aan de cellen en incubeer deze gedurende 30 minuten in een incubator op 37 graden Celsius. Was na de incubatie de cellen opnieuw met PBS zoals voorheen. Micropipetten worden getrokken door een glazen capillair in het midden te verhitten.

Wanneer het glas begint te smelten, worden de twee helften van de capillair uit elkaar getrokken om twee micropipetten te vormen. De tips van de pipetten die in deze experimenten worden gebruikt, variëren doorgaans tussen de twee en zes micron. De buitendiameter, afhankelijk van de grootte van de cel, en de vorm van de tip moeten benaderen die van een cilindrische buis voordat de glazen capillair in de pipettrekker wordt geplaatst.

In deze demonstratie wordt de Suter P 97 horizontale pipetpuller gebruikt met een geoptimaliseerd programma. Deze puller biedt meerdere programmeerbare opties om de snelheid en andere parameters van het trekproces te variëren. Ga over tot het activeren van het pullprogramma.

Verifieer na het uitrekken van elke micropipet de vorm van de punt onder de microscoop. Vul de micropipet na het vuurpolijsten van de punt met een fysiologische zoutoplossing, zoals PBS of niet-fluorescente groeimedia. Belangrijk is dat de oplossing wordt aangevuld met 30% serum, wat de celmembraan in staat stelt om soepel in de pipet te bewegen. In deze demonstratie wordt een inverted fluorescentiemicroscoop met 3D-deconvolutiemogelijkheden gebruikt, met een videocamera die is verbonden met een computer, een druktransducer, een trillingsvrij station en een micromanipulator om cellen in een micro-aspiratiekamer te plaatsen door de cellen van hun substraten te tillen en ze in een ondiepe longitudinale kamer te pipetteren die op de inverted fluorescentiemicroscoop is gemonteerd.

De reden voor het gebruik van een ondiepe longitudinale kamer is om een micropipet de cellen onder een zeer flauwe hoek te laten benaderen, zo dicht mogelijk bij het horizontale vlak. Dit wordt gedaan om het membraan dat in de micropipet wordt getrokken in één enkel focusvlak te kunnen visualiseren. Plaats een gevulde micropipet in een pipethouder die via flexibele slang is verbonden met een krachttransducer, waarbij de diameter is aangepast aan de connector van de pipethouder voor een nauwe aansluiting.

Aan het begin van elk experiment wordt de druk in de pipet gelijkgesteld aan de atmosferische druk; monteer de pipet vervolgens op een micromanipulator die een nauwkeurige besturing van de pipetbewegingen in het micronbereik mogelijk maakt. Positioneer de pipet onder een flauwe hoek ten opzichte van de bodem van de kamer en breng de punt van de pipet naar het centrum van het gezichtsveld. De schacht van de pipet, het cilindrische deel van de pipetpunt waarin het membraan wordt opgezogen, dient horizontaal te worden uitgelijnd met het brandvlak.

Om deze eerste positie te bereiken, plaatst u de pipet onder de kleinst mogelijke hoek en buigt u vervolgens de schacht van de pipet tegen de bodem van de kamer. Omdat de schacht zeer dun is, is deze flexibel genoeg om over de bodem van de kamer te glijden terwijl een cel wordt benaderd. Breng de micropipet langzaam naar de zijkant van een enkele cel met behulp van de grove manipulator, tot u zich dicht bij het focusvlak van de cel bevindt.

Beweeg vervolgens met de fijne manipulator de micropipet naar de rand van de cel totdat de tip van de pipet de membraan zachtjes raakt. Neem een afbeelding om de positie van de pipet te observeren. Goede afdichtingen worden gecreëerd wanneer de gehele tip van de pipet volledig in contact staat met het celoppervlak en dit contact stabiel is.

Pas vervolgens een stap van negatieve druk toe met behulp van de transducer en handhaaf deze totdat de projectie van het membraan is gestabiliseerd. De hoeveelheid druk die nodig is om het membraan in de pipet te aspireren, varieert afhankelijk van het celtype en de specifieke experimentele omstandigheden. Initiële deformatie wordt doorgaans waargenomen bij het toepassen van een druk in het bereik van min twee tot min 15 millimeter kwik.

Wanneer de druk wordt aangelegd, vervormt het membraan zich geleidelijk in de pipet tot het op een bepaalde lengte is gestabiliseerd. Tijdens dit proces, dat gewoonlijk twee tot drie minuten duurt, moeten elke 30 seconden beelden van de membraanvervorming worden gemaakt om de progressie van het in de pipet getrokken membraan te volgen. Verhoog vervolgens de druk naar het volgende niveau in stappen van twee tot vijf millimeter kwik.

Herhaal de volledige procedure totdat de membraanprojectie loslaat van de cel en in de pipet beweegt, waarna het experiment wordt gestopt. Om de mate van membraandeformatie te kwantificeren, wordt de geaspireerde lengte gemeten vanaf de tip van de pipet tot het hoogste punt van de omtrek van de membraanprojectie. Een grotere pipet zal bij hetzelfde druk niveau meer kracht uitoefenen op het celmembraan om rekening te houden met de variabiliteit tussen de diameters van de pipetten.

De geaspireerde lengte is genormaliseerd voor de pipetdiameter die voor elk experiment is gemeten om het gebruik van de microaspiratietechniek voor aan het substraat gehechte cellen te valideren; er werd getest of een disruptie van F-actine resulteert in een afname van de celstijfheid van runder-aortale endotheelcellen zoals geschat met deze methode. Hier wordt, zoals verwacht, een typische reeks fluorescentiebeelden getoond van een endotheelmembraan dat een progressieve deformatie ondergaat als reactie op de negatieve druk die via een micropipet wordt uitgeoefend. Het membraan wordt geleidelijk in de pipet geaspireerd en de geaspireerde lengte neemt toe als functie van de uitgeoefende druk; tijdskoersen van de deformatie laten zien dat disruptie van F-actine de geaspireerde lengtes van de projecties onder alle drukcondities significant verhoogt.

Met deze aanpak werd ontdekt dat de celstijfheid toeneemt wanneer cellulaire membranen zijn uitgeput van cholesterol, terwijl cholesterolverrijking geen effect had. Hier worden een cholesterolverrijkte cel, een controlecel en een cholesteroluitgeputte cel getoond nadat maximale aspiratielengten van minus 15 millimeter kwik zijn bereikt. De projecties begonnen zich doorgaans te ontwikkelen bij minus 10 millimeter kwik, en de tijdsverlopen van membraandeformatie konden worden gemeten voor de negatieve drukken van 10, 15 en 20 millimeter kwik.

Hier zijn de maximale geaspireerde lengtes uitgezet als functie van de aangelegde druk. De maximale genormaliseerde lengte in uitgeputte cellen was significant lager dan die van controlecellen bij drukken van minus 15 millimeter kwik en minus 20 millimeter kwik. Toepassing van negatieve drukken boven de 25 millimeter kwik leidde tot het loslaten van de geaspireerde projectie, waardoor een afzonderlijke vesikel ontstond.

Het drukniveau dat leidde tot membraanloslating was vergelijkbaar onder verschillende cholesterolcondities, wat een onverwachte observatie was. Eerdere studies tonen namelijk aan dat een toename van membraancholesterol de stijfheid van membraanlipidendubbellagen verhoogt. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee tot drie uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Bij het toepassen van deze techniek is het belangrijk om te onthouden dat dit experiment op individuele cellen wordt uitgevoerd.

Daarom moeten drie tot vijf cellen per conditie en per experiment worden geanalyseerd, over een totaal van drie experimenten.