Name: Spectral Karyotypering naar chromosoomafwijkingen bij mensen en muizen Studie met polycysteuze nierziekte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Leer Spectral Karyotyping (SKY) voor cytogenetisch onderzoek naar chromosoomafwijkingen bij mensen en muizen met polycysteuze nierziekte. Deze methode detecteert complexe chromosomale translocaties en structurele afwijkingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Auteurs willen Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi en Blair Mell bedanken voor hun technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door prijzen van de NIH (DK080640) en de Universiteit van Toledo &amp; ProMedica Translationeel Onderzoek Stimuleringsprogramma Award uit aan dr. Surya Nauli.

1. Cel voorbehandeling en metafase voorbereiding <ol><li> De cellen worden gekweekt in Wijziging Dulbecco&#39;s van Medium Eagle&#39;s (DMEM) bevattende 10-15% foetaal bovine serum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine bij 37 ° C met 5% CO 2 incubator, totdat zij bereikt 70-80% confluentie. </li><li> Behandel de cellen met Colcemid oplossing op 0,05 ug / ml gedurende 30-60 min. </li><li> Verzamel de medium met een drijvend cellen in 50 ml steriele valk centrifugebuizen. Spoel de cellen op de plaat met sterile1X-PBS. Na incubatie met steriel trypsine voor 1-2 min, de oogst en het verzamelen van de overige cellen in dezelfde buis. </li><li> Draai de buizen bij 1000 rpm gedurende 5 minuten, zuig het supernatant het verlaten van 0,5 ml en los pellet door de knop met de vinger alleen. </li><li> Afhankelijk van de pellet grootte, voeg 5-10 ml van hypotone oplossing van 0,56% KCl in dH 2 O en incubeer de suspensie bij 37 ° C gedurende 30-45 min. </li><li> Voeg een druppel methanol / azijnzuur(3:1 vol / vol) per ml van hypotone celsuspensie en zachtjes keer de buis voor het mengen. </li><li> Centrifugeer bij 1200 rpm voor 5 min en verzamel pellet als stap 1.4 vervolgens voeg 5 ml van vers methanol / azijnzuur (3:1 vol / vol) fixatief oplossing druppelsgewijze terwijl flicking de pellet continu. Deze procedure is van cruciaal belang, zodat de metafase spreads niet zal worden opgesloten in de cellen &#39;klonten, die het experiment in gevaar zou brengen. </li><li> Centrifugeer opnieuw op 1200 tpm voor 5 min en voeg 5-10 ml van ijskoude methanol / azijnzuur fixatief langs de wand van de buis. In dit stadium, indien nodig, kunnen de cellen worden opgeslagen in fixatief oplossing in een aangescherpt en verzegeld tube bij -20 ° C voor korte of -80 ° C voor lange termijn (jaar) voor toekomstig gebruik. </li><li> Clean slides in absolute ethanol, dan onderdompeling de dia in dH 2 O voor approximately10X teneinde een omhulsel van water vormen op het oppervlak van de dia. Plaats de foto op een glasplaat en drop 15-20μl celsuspensie (uit stap 1.8) Van 10 &quot;boven de dia. Plaats de dia in een waterbad ingesteld op 65-70 ° C voor 1-2 minuten en laat het drogen. </li><li> Controleer de glijbaan onder een lichtmicroscoop met behulp van 10X en 40X droge doelstellingen ervoor te zorgen dat er metafase chromosomen en de spreads zijn gelijkmatig verdeeld. Controleer of er cytoplasma aanwezig rond de chromosomen. Als cytoplasma aanwezig is doorgaan met slide voorbehandeling (pepsine spijsvertering), indien geen cytoplasma aanwezig is en de chromosomen hebben goede morfologie, dan is er geen noodzaak voor slide voorbehandeling. </li></ol> 2. Schuif de voorbehandeling (pepsine behandeling) <ol><li> Breng 120 ul van 1:200 RNase oplossing (20 mg / ml) opgelost in 2X-SSC op een 24 mm x 60 mm microscoop dekglaasje en omkeren van de metafase glijbaan naar beneden op het dekglaasje dan voorzichtig Keer de metafase schuif naar boven en incuberen bij 37 ° C voor 45 min. </li><li> Verwijder voorzichtig het dekglaasje, zonder krassen op de glijbaan en wassen in 2X SSC-buffer in een Coplin pot om de 5 min gedurende 15 minmet schudden. </li><li> Voeg 5-15 ul van pepsine stockoplossing (100 mg / ml in dH 2 O) in een schone bekerglas en voeg vervolgens 100 ml van voorverwarmde (37 ° C) 0,01 M HCl. Het is belangrijk dat de pepsine toe in een schone beker eerste en niet direct in de HCl-oplossing, anders zou het geen oplossen in oplossing. Incubeer de dia in een Coplin pot die de HCl / pepsine-oplossing bij 37 ° C gedurende 3-5 min. Deze stap is zeer kritisch als te veel spijsvertering zorgt ervoor dat de chromosomen te overdigested en te weinig spijsvertering laat het cytoplasma onverteerde dat kan leiden tot niet-specifieke binding van de sonde en interfereren met de hybridisatie-signaal. </li><li> Was de dia in een Coplin pot met 100 ml 1X-PBS voor 5 min tweemaal bij kamertemperatuur. </li><li> Was de dia in een Coplin pot met 100 ml 1X-PBS/MgCl 2 voor 5 min bij kamertemperatuur (50 ml van 1M MgCl 2 in 950 ml 1X-PBS). </li><li> Plaats de dia in een Coplin pot containing 100 ml 1% formaldehyde voor 10 min bij kamertemperatuur (1,7 ml van 37% formaldehyde in 100 ml van 1X-PBS/MgCl 2). </li><li> Was de dia in een Coplin pot met 100 ml 1X-PBS gedurende 5 minuten. </li><li> Observeer de dia onder een lichtmicroscoop behulp 40X droge lens te waarborgen dat de slides behoren worden verteerd en geen cytoplasma aanwezig is en het chromosoom morfologie behouden blijft. Selecteer een gebied voor hybridisatie gebruik een diamant pen. </li></ol> 3. Chromosoom en probe denaturatie en hybridisatie <ol><li> Bereid verse denaturering oplossing (70% formamide/2X SSC, pH 7,0) en Verwarm tot 70-80 ° C in een Coplin pot geplaatst in een waterbad Place de dia in het Coplin pot die de denaturering oplossing in een waterbad bij 70 ° C voor muis chromosomen en 80 ° C voor menselijke chromosomen voor 30s-1.5 min. </li><li> Onmiddellijk Plaats de dia in ijskoude 70% ethanol gedurende 3 minuten, gevolgd door 80% en 100% ethanol gedurende 3 minuten per stuk en de lucht drogen. Onderzoek de glijbaanvoor chromosoom morfologie. Goede chromosoom morfologie wordt aangeduid met donkere chromosomen en niet &quot;phase-light&quot; of halogeen chromosomen. </li><li> Verwarm de SkyPaint probe (SKY verf kit; injectieflacon # 1) bij 37 ° C met schudden voor 20 min, vortex en centrifugeer kort bij 1000 rpm voor een paar seconden. </li><li> Denatureren de probe op een thermocycler geprogrammeerd voor een tweefasige cyclus bij 85 ° C gedurende 5 min cyclus gevolgd door 37 ° C voor 60 min voor geëtiketteerde-probe DNA zorgen voor preannealing. </li><li> Breng 10μl van de gedenatureerde probe op het gebied van hybridisatie en bedek het met een 22 mm x 40 mm dekglaasje ervoor te zorgen dat niet om luchtbellen te vangen. Dicht de randen van de coverglass met rubber cement en incubeer in een bevochtigde kamer bij 37 ° C gedurende 48-72 uur. </li></ol> 4. Fluorescente probe detectie <ol><li> Verwijder het beschermglas en plaats de dia in een Coplin pot met voorverwarmde (45 ° C) wassen I-oplossing (vers bereid 50% formamide in 2x SSC). Was gedurende 5 minutendrie keer bij 45 ° C in een schuddend waterbad op 45 rpm </li><li> Was de dia in wasoplossing II (1X SSC) bij 45 ° C gedurende 5 min tweemaal met schudden. </li><li> Was de dia in wasoplossing III (4X SSC/0.1% Tween 20) gedurende 5 min bij 45 ° C met schudden. </li><li> Breng 80 ul van het blokkeren van reagens (SKY verf kit; flacon # 2), plaats een dekglaasje en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Verwijder de dia en laat de vloeistof uitlekken. Breng 80 pi van Cy5 kleuring reagens (Geconcentreerde Antibody Detection CAD kit; injectieflacon # 3), toepassen een dekglaasje en incubeer bij 37 ° C voor 40 min. </li><li> Was de dia met wasoplossing III bij 45 ° C gedurende 5 min driemaal met schudden. </li><li> Breng 80 ul van Cy5.5 vlekken reagens (Geconcentreerde opsporing van antilichamen tegen CAD-kit; flacon # 4), plaats een dekglaasje en incubeer bij 37 ° C gedurende 40 minuten. </li><li> Was de dia met wasoplossing III bij 45 ° C gedurende 5 min driemaal met schudden. </li><li> Kantel de foto en laat de vloeistof<html> af te voeren. Breng 20 ui van de anti-fade DAPI reagens (SKY verf kit; flacon # 5) en plaats een 24 mm x 60 mm microscoop dekglaasje. Verwijder voorzichtig luchtbellen die misschien gevormd zijn. Slides kunnen onmiddellijk worden afgebeeld of bewaard bij 4 ° C in het donker niet langer dan 1 week. </li></ol> 5. Afbeelding acquisitie en-analyse <ol><li> Afbeelding overname wordt bereikt door het bekijken van metafase dia&#39;s met behulp van een Olympus microscoop uitgerust met een 60x olie-immersie lens, een Spectral kubus (op maat ontworpen triple band pass filter), een DAPI filter en een Sagnac interferometer module met een CCD-camera. </li><li> Spectral-karyotypes werden uitgevoerd met Sky View-software (Applied spectrale imaging versie 1.62) naar aanleiding van de handleiding. </li><li> Na analyse van de beelden, kan de chromosomen worden beschouwd als kleurenafbeeldingen (met specifieke fluorescerende kleuren), pseudo kleurenbeelden (met kleuren voor classificatie) en omgekeerde DAPI beelden (specifieke banding patroon). </li></ol>e_title &quot;&gt; 6. representatieve resultaten Een complete SKY procedure duurt meestal ongeveer een week de tijd (figuur 1). Dit geldt ook voor beeldacquisitie en analyse op voorwaarde dat de cellen in de metafase zijn in voldoende aanbod. Karyotypering analyse onthult normale muis karyotype (40, XY) van cellen uit wild type muizen (figuur 2a). In Daarentegen cellen van PKD1 - / - mouse (PKD muismodel) toont een significante toename aantal chromosomen en structurele afwijkingen, zoals chromosoom deleties (Chromosome # 8) en translocaties (chromosomen # 11 en 19) (Figuur 2b). We ook vaatweefsel geanalyseerd vanuit het ADPKD patiënten. Een eenvoudige studie door telling de chromosomale nummers aangaven dat non-ADPKD en sommige ADPKD vasculaire samples normale chromosomale aantallen 23 paren (Figuur 2c) had. In het algemeen echter, we waargenomen falen van chromosomale segregatie, resulterend in 46 paren chromosomen in ADPKD monsters ipv 23 paren (figuur 2d). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig1.jpg" /> Figuur 1. SKY-protocol stroomdiagram. Stroomschema van de SKY-protocol geeft stappen om een experiment vanaf cel voorbehandeling en metafase voorbereidingen om beeld acquisitie en-analyse te voltooien. Een benaderende een week tijdlijn wordt gepresenteerd aan de linkerkant met stap-voor-stap procedures voor elke dag. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig2.jpg" /> Figuur 2. Spectral karyotypering op vereeuwigd muis cellijnen en vers geïsoleerde menselijke primaire cellen. Kleur en omgekeerde DAPI beelden van de individuele chromosomen zijn zichtbaar voordat de chromosomale sorteren. Na het sorteren worden de chromosomen gepresenteerd in de &quot;classificatie&quot; tafel. A) SKY beeld van een metafase verspreiding van wild-type muis bevat een normaal karyotype (40, XY). B) </strong&gt; SKY beeld van een metafase spreiding van PKD1 - / -. muis toont abnormaal aantal chromosomen (68 in plaats van 40) en chromosoom afwijkingen, zoals chromosoom deleties (chromosoom # 8) en chromosoom translocaties (chromosomen # 11 en 19) c), SKY beeld van een metafase spread vanuit het vasculaire weefsel van een non-ADPKD patient heeft normale karyotype (46, XX). d) SKY afbeelding van een metafase spread vanuit het vasculaire weefsel van een ADPKD patient bevat abnormale karyotype (92, XXXX). Delen van de gegevens zijn eerder gerapporteerd en met toestemming gebruikt 14.

<ol><li>Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+differentiation+along+metaphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Chemical differentiation along metaphase chromosomes.</a> Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).</li>
<li>Seabright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+banding+technique+for+human+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A rapid banding technique for human chromosomes.</a> Lancet. 2, 971-972 (1971).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).</li>
<li>Schrock, E., Zschieschang, P., O'Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+of+human%2C+mouse%2C+rat+and+ape+chromosomes--applications+for+genetic+diagnostics+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes--applications for genetic diagnostics and research.</a> Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumping+translocations+are+common+in+solid+tumor+cell+lines+and+result+in+recurrent+fusions+of+whole+chromosome+arms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosomes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms.</a> Genes, Chromosomes & Cancer. 30, 349-363 (2001).</li>
<li>Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+chromosome+abnormalities+in+haematological+malignancies+detected+by+multicolour+spectral+karyotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping.</a> Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).</li>
<li>Karpf, A. R., Matsui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disruption+of+cytosine+DNA+methyltransferase+enzymes+induces+chromosomal+instability+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells.</a> Cancer Research. 65, 8635-8639 (2005).</li>
<li>Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+spectral+karyotyping+to+the+analysis+of+the+human+chromosome+complement+of+interspecies+somatic+cell+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics+and+Cytogenetics%22%5BJournal%5D)">Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids.</a> Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).</li>
<li>Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+genetic+complementation+controlling+the+chromosomal+abnormalities+and+loss+of+heterozygosity+formation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer.</a> Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).</li>
<li>Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRied%2C+T+%22Journal+of+Molecular+Medicine+%28Berlin%2C+Germany%29%22">Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany)</a>. 75, 801-814 (1997).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation Research. 104, 860-869 (2009).</li>
<li>Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystins+1+and+2+mediate+mechanosensation+in+the+primary+cilium+of+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells.</a> Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).</li>
<li>Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cilia+are+fluid+shear+sensors+that+regulate+calcium+signaling+and+nitric+oxide+production+through+polycystin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1.</a> Circulation. 117, 1161-1171 (2008).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+from+humans+and+mice+with+polycystic+kidney+disease+are+characterized+by+polyploidy+and+chromosome+segregation+defects+through+survivin+down-regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation.</a> Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cytogenetic+analysis+of+the+bladder+carcinoma+cell+line+BK-10+by+spectral+karyotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosomes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping.</a> Genes, Chromosomes & Cancer. 25, 53-59 (1999).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Spectral Karyotypering (SKY) is een cytogenetica techniek die gebruikt wordt in het bestuderen van genomische en chromosomale composities. Deze techniek maakt gebruik van chromosoom painting probes, en de detectie van deze probes worden verworven door middel van een Sagnac interferometer. Het complete SKY proces duurt meestal ongeveer een week, en het gaat om een aantal belangrijke stappen (figuur 1). De SKY maakt gebruik van een standaard protocol, die voor het eerst werd beschreven door Padilla-Nash <...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro Mediatech Inc </td><td> 10 tot 013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Foetale bovine serum (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30088-03 </td><td></td></tr><tr><td> Penecillin / streptomycine </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 295 892 001 </td><td> 10 ug / ml </td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S77375-1 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256-01 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> SKY verf probe kit (Human) </td><td> Toegepaste Spectral Imaging </td><td> SKY000028 </td><td></td></tr><tr><td> SKY verf probe kit (muis) </td><td> Toegepaste Spectral Imaging </td><td> SKY000030 </td><td></td></tr><tr><td> Geconcentreerde antilichaam detectie kit </td><td> Toegepaste Spectral Imaging </td><td> SKY000033 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30236.01 </td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A433P-4 </td><td></td></tr><tr><td> Azijnzuur </td><td> Fisher Scientific </td><td> A38-212 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 109 169 001 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6887-5G </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> Fluka </td><td> 63069-500ML </td><td></td></tr><tr><td> 37% Formaldehyde </td><td> Mallinckrodt Baker </td><td> 2106-02 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Promega </td><td> V4261 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide </td><td> Fluka </td><td> 47671 </td><td> voor te bereiden vlak voor gebruik </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> Microscoop glaasjes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549 </td><td></td></tr><tr><td> Microscoop afdekglas 24x60mm </td><td> VWR Vista Vision </td><td> 16004-312 </td><td></td></tr><tr><td> Rubber cement </td><td> Elmer&#39;s (plaatselijke winkel) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hybridisatie / humidifiedchamber / lade </td><td> Simport </td><td> M920-2 </td><td> zet natte papieren handdoeken op de bodem </td></tr><tr><td> Thermocycler </td><td> Eppendorf </td><td> Epgradient S </td><td></td></tr><tr><td> Shaking platform / Orbital Shaker </td><td> Bellco Biotechnologie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schudden / waterbad </td><td> Precisie Wetenschappelijk </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DAPI filter kubus </td><td> Chroma-technologie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SKY filter kubus </td><td> Chroma-technologie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SpectraCube </td><td> Toegepaste Spectral Imaging </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Omgekeerde celkweek microscoop </td><td> Nikon </td><td> Nikon Eclipse TS100 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescentie microscoop </td><td> Olympus </td><td> IX70 </td><td> 60X olie </td></tr></tbody></table>

spectral karyotypering naar chromosoomafwijkingen bij mensen en muizen studie met polycysteuze nierziekte

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Conventionele methode om identificeren en classificeren individuele chromosomen afhankelijk van de unieke banding patroon van elk chromosoom in een specifieke soort geanalyseerd 1, 2. Deze klassieke banding techniek is echter niet betrouwbaar in identificeren complexe chromosomale aberraties zoals die in verband met kanker. Om de beperkingen van de strepen techniek te overwinnen, is Spectral Karyotypering (SKY) geïntroduceerd om veel betrouwbare informatie over chromosoomafwijkingen te bieden. SKY is een meerkleuren fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) techniek om metafase chromosomen te detecteren met spectrale microscoop 3, 4. SKY is bewezen een waardevol instrument voor de cytogenetische analyse van een breed scala van chromosoomafwijkingen geassocieerd met een groot aantal genetische ziekten en maligniteiten 5, 6. SKY betreft het gebruik van veelkleurige fluorescent-gelabelde DNA probes bereid uit de gedegenereerde oligonucleotide primers door PCR. Dus elke chromosoom heeft een unieke spectrale kleur na in-situ hybridisatie met probes, die differentieel gelabeld met een mengsel van fluorescerende kleurstoffen (Rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC en Cy5.5). De sondes gebruikt voor SKY bestaan ​​uit maximaal 55 chromosoom specifieke probes 7-10. De procedure voor SKY omvat verschillende stappen (Figuur 1). SKY vereist de beschikbaarheid van cellen met een hoge mitotische index van normaal of zieke weefsel of bloed. De chromosomen van een enkele cel, hetzij bij een vers geïsoleerde primaire cel of een cellijn worden op een glasplaatje. Dit chromosoom spread is gelabeld met een andere combinatie van fluorescerende kleurstoffen specifiek voor elk chromosoom. Voor de probe detectie en beeldacquisitie, de spectrale imaging-systeem bestaat uit Sagnac interferometer en een CCD-camera. Hierdoor kunnen de metingen van het zichtbare licht spectrum uitgezonden uit het monster en om een ​​spectraal beeld fro verwervenm de individuele chromosomen. HiSKY, de software die wordt gebruikt om de resultaten van de opgenomen beelden te analyseren, biedt een gemakkelijke identificatie van chromosoom afwijkingen. Het eindresultaat is een metafaseachtig en een karyotype classificatie beeld, waarin elk paar chromosomen heeft een afzonderlijke kleur (figuur 2). Dit maakt eenvoudige identificatie van chromosoom identiteiten en translocaties. Voor meer informatie kunt u terecht op Toegepaste Spectral Imaging website ( <a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a> ). SKY is recentelijk voor een identificatie van chromosoom segregatie gebreken en chromosoom afwijkingen bij mensen en muizen met autosomaal dominante polycystische nierziekte (ADPKD), een genetische ziekte die wordt gekenmerkt door stoornissen in de primaire cilia 11-13. Met behulp van deze techniek hebben we aangetoond dat de aanwezigheid van abnormale chromosoom segregatie en chromosomale afwijkingen bij ADPKD patiënten en muismodellen 14. Verdere analyses gebruik SKY niet alleen ons toegestaan ​​om chromosomale aantal en de identiteit identificeren, maar ook om nauwkeurig te detecteren zeer complexe chromosomale aberraties zoals chromosoom deleties en translocaties (figuur 2).

Spectral Karyotypering (SKY) is een geavanceerde cytogenetica techniek om genomische en chromosomale afwijkingen te identificeren. Deze techniek profiteert van chromosoom schilderkunst probes, waarmee indeling van alle chromosomen. SKY kan ook worden aangegeven complexe chromosoomafwijkingen en de segregatie defecten in muizen en mensen met diverse ziekten, waaronder polycystische nierziekte.

Spectral Karyotypering naar chromosoomafwijkingen bij mensen en muizen Studie met polycysteuze nierziekte

De conventionele methode om individuele chromosomen te identificeren en te classificeren is afhankelijk van het feit dat het unieke bandenpatroon van elk chromosoom in een specifieke soort ...

Het doel van deze procedure is om chromosomen te labelen met paint-probes om chromosoomafwijkingen en segregatiedefecten te identificeren bij muizen en mensen met polycysteuze nierziekte. Dit wordt bereikt door eerst cellen van mensen of muizen te oogsten en te behandelen met smid, gevolgd door het fixeren en prepareren van metafase-spreidingen op glazen objectglaasjes. Vervolgens wordt het glaasje voorbehandeld om extra RNA en cytoplasma te verwijderen die de hybridisatie kunnen beïnvloeden.Dit gebeurt door respectievelijk digestie met RNases en pepsine. Vervolgens worden het chromosoom en de probe gedenatureerd, gevolgd door hybridisatie om de chromosomen te labelen. De laatste stap is de detectie van de probe met fluorescerende kleurstoffen.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die chromosomale numerieke en structurele abnormaliteiten aantonen via fluorescentie, microscopie en beeldvastlegging en -analyse met Skyview-software. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals klassieke GIMs-buigtechnieken, is dat deze aanvullende informatie verschaft over complexe chromosomale aberraties, zoals chromosomale translocaties en complexe chromosomale herschikkingen die niet gekarakteriseerd kunnen worden met klassieke buigtechnieken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van polycysteuze nierziekten, zoals het mechanisme van cysteuze niervorming.De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Wiam Abu, een getalenteerde senior postdoc uit ons laboratorium. Begin hiermee door endotheelcellen te kweken in DMEM met 10 tot 15% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C en 5% koolstofdioxide totdat de cellen een confluentie van 70 tot 80% bereiken. Behandel de cellen vervolgens met Cole-oplossing bij een uiteindelijke concentratie van 0,05 mg/mL gedurende 30 tot 60 minuten bij 37 °C voordat ze worden geoogst. Om de cellen te oogsten, verzamelt u eerst het medium met alle zwevende cellen in steriele centrifugebuisjes van 50 mL.Spoel de cellen op de plaat één keer af met steriele PBS na incubatie met steriele trypsin gedurende één tot twee minuten, en oogst en verzamel de resterende cellen in dezelfde buis. Nadat de cellen zijn gepelletteerd door centrifugatie bij 1000 rotations per minute gedurende vijf minuten, wordt het grootste deel van het supernatant uit de buis geaspireerd, waarbij ongeveer 0.5 milliliters bovenop het pellet achterblijft. Los het celpellet los door tegen de buis te tikken.Voeg vervolgens, afhankelijk van de grootte van het pellet, 5 tot 10 milliliter van een hypertonische oplossing van 0,56% kaliumchloride in gedestilleerd water toe en incubeer de suspensie bij 37 °C gedurende 30 tot 45 minuten. Gebruik na de incubatie een kleine pipette van één milliliter om één druppel ijskoude fixeeroplossing toe te voegen per milliliter hypertonische celsuspensie. Keer de buis vervolgens voorzichtig om om te mengen, nadat de cellen vijf minuten zijn gecentrifugeerd bij een snelheid van 1.200 toeren per minuut.Zuig het supernatant af zoals eerder beschreven. Voeg vervolgens langzaam één milliliter verse fixatievloeistof toe terwijl u de pellet losvlikt. Voeg daarna voorzichtig nog vier milliliter fixatievloeistof tegen de wand van de buis toe.Deze procedure is cruciaal om te voorkomen dat de metafase-spreidingen gevangen raken in celklonters. Nadat de centrifugatiestap is herhaald en het supernatant is afgezogen, worden de vijf tot 10 milliliters fixatief vervangen door het fixatief langzaam langs de wanden van de buis te pipetteren. In dit stadium kunnen de cellen in een goed afgesloten buis worden bewaard bij -20 °C voor kortstondige opslag of bij -80 °C voor langdurige opslag totdat men klaar is om verder te gaan.Wanneer u klaar bent om verder te gaan, controleert u het aantal metafasechromosomen in de celpreparaat. Maak het preparaat schoon in absolute ethanol. Dompel het preparaat vervolgens ongeveer 10 keer in gedestilleerd water om een waterslaag op het oppervlak van het preparaat te vormen, plaats het preparaat op een glasplaat en laat 15 tot 20 µL celsuspensie vanuit een hoogte van 10 inch op het preparaat vallen.Plaats het preparaat gedurende één tot twee minuten in een waterbad ingesteld op 65 tot 70 °C en laat het drogen. Controleer het preparaat onder een lichtmicroscoop met de 10x en 40x droge objectieven. Controleer of er metafase-chromosomen aanwezig zijn en of de spreidingen gelijkmatig verdeeld zijn. Controleer het cytoplasma rondom de chromosomen.Als er cytoplasma aanwezig is, zoals hier te zien is, ga dan verder met de voorbehandeling van het preparaat. Als er geen cytoplasma aanwezig is en de chromosomen een goede morfologie hebben, is voorbehandeling van het preparaat niet nodig bij 120 microliters van een vers bereide 1:200 oplossing van 20 milligram per milliliter RNA-oplossing opgelost in tweevoudige SSC op een dekglas van 24 millimeter bij 60 millimeter.Keer het metafase-preparaat om, zodat de zijde met het monster op het dekglas rust. Keer het metafase-preparaat vervolgens voorzichtig weer om. Plaats het preparaat in een bevochtigingskamer en incubeer het 37 graden Celsius gedurende 45 minuten.Zodra de incubatietijd is verstreken, wordt het dekglas voorzichtig verwijderd zonder het objectglas te beschadigen en wordt er tweemaal gewassen met SSC-buffer in een klempot, drie keer gedurende vijf minuten per keer onder schudden. Voeg ondertussen vijf tot 15 µL pepine van 100 mg/mL in gedestilleerd water toe aan een schoon bekerglas, en voeg vervolgens 100 mL 0,01 M zoutzuur toe, voorverwarmd tot 37 °C. Het is belangrijk om de PEP's eerst aan het schone bekerglas toe te voegen, anders lossen ze niet op.Overbreng deze oplossing naar een copan-pot. Incubeer de wasplaat in de koppelingspot bij 37 °C gedurende maximaal drie tot vijf minuten na de digestie. Was de plaat twee keer in een copin-pot met 1x PBS gedurende vijf minuten per keer onder schudden.Volg dit met een wasbeurt van vijf minuten in een copin-pot met PBS aangevuld met magnesiumchloride. Daarna volgt een incubatie van 10 minuten in een copin-pot met 1% formaldehyde, gevolgd door een laatste wasbeurt van vijf minuten in een cochin-pot met 1x PBS. Dehydrateer vervolgens de objectglazen in cochin-potten met een reeks ethanol van 70%, 80% en 100% gedurende telkens twee minuten, en laat ze daarna aan de lucht drogen.Observeer het preparaat onder een lichtmicroscoop met een 40x droge lens om er zeker van te zijn dat de preparaten correct zijn gedigesteerd, dat er geen cytoplasma aanwezig is en dat de chromosomenmorfologie behouden is. Selecteer vervolgens met een diamantpen een gebied voor hybridisatie. Plaats de vers bereide denatureringsoplossing in een copin-pot en verwarm deze voor tot 70 °C in een waterbad.Plaats de objectglas vervolgens in de cochin-pot met de voorverwarmde denatureringsoplossing in een waterbad van 70 °C gedurende 30 seconden tot één minuut. Plaats het objectglas na de incubatie onmiddellijk gedurende drie minuten in ijskoude 70% ethanol, gevolgd door 80% en 100% ethanol gedurende drie minuten per stap, en laat het daarna aan de lucht drogen. Controleer het objectglas op chromosoommorfologie; de chromosomen moeten donker verschijnen en mogen niet bleek of glanzend zijn.Geeft een goede chromosoomstructuur of morfologie aan. Warm de sky paint op. Incubeer op 37 °C onder schudding gedurende 20 minuten.Vortex vervolgens en centrifugeer kort gedurende enkele minuten bij 1000 toeren. Denatureer de probe gedurende vijf minuten in een thermocycler bij 85 °C, gevolgd door incubatie bij 37 °C. Breng 10 µL van de gedenatureerde probe aan op het hybridisatiegebied en dek dit gedurende één uur af met een dekglas van 22 mm bij 40 mm.Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ingesloten raken en verzegel de randen van het dekglas met rubbercement, incubeer dit vervolgens in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 48 tot 72 uur. Verwijder het dekglas voorzichtig en plaats het preparaat in een koppelpot met vers bereide wassolution, die vooraf is opgewarmd tot 45 °C. Was drie keer gedurende vijf minuten bij 45 °C in een schudwaterbad bij 45 omwentelingen per minuut.Was de coupes vervolgens twee keer in wasoplossing twee bij 45 °C gedurende vijf minuten per keer onder schudden, gevolgd door vijf minuten in wasoplossing drie bij 45 °C onder schudden. Breng daarna 80 µL blokkeringsreagens aan. Plaats vervolgens een dekglas en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten.Verwijder het dekglas en laat de vloeistof weglopen. Breng 80 µL sci-fi kleuringsreagens aan. Plaats een dekglas en incubeer 37 °C gedurende 40 minuten. Was na de incubatie de slide drie keer gedurende vijf minuten met wasoplossing drie van 45 °C onder shaking.Breng vervolgens 80 µL PS 5.5 kleuringsreagens aan. Plaats een dekglas en incubeer 37 °C gedurende 40 minuten; was na de incubatie drie keer met wasoplossing drie, zoals eerder beschreven. Kantel tot slot de objectglas en laat de vloeistof weglopen.Breng 20 µL van het Antifa dappy-reagens aan en plaats voorzichtig een dekglas van 24 mm bij 60 mm op de microscoopglaasjes; verwijder eventuele luchtbellen die zijn ontstaan. De preparaten kunnen onmiddellijk worden afgebeeld of gedurende maximaal één week bij 4 °C in het donker worden bewaard. Deze afbeelding van een normale metafase-spreiding van een wild-type muis is vastgelegd met een Olympus-microscoop uitgerust met een 60x olie-immersielens.Een op maat ontworpen triple band-pass filter, bekend als een spectrale kubus, een dappy-filter, en een sac-interferometermodule met een CCD-camera. Spectrale karyotyperingen werden uitgevoerd met behulp van skyview-software. Het linker bovenpaneel toont de gelabelde metafase-spreiding, en het rechter bovenpaneel toont een brightfield-afbeelding van de spreiding.Het onderste paneel toont de chromosomen die in oplopende volgorde zijn gesorteerd met behulp van skyview-software. Deze sky-afbeelding van een metafase-spreiding van een pkd one homozygote knockout-muis laat een abnormaal aantal chromosomen zien, waarbij 68 chromosomen aanwezig zijn in plaats van 40. Ook zijn chromosoomafwijkingen zichtbaar, zoals de deletie van chromosoom 8 en chromosoomtranslocaties, zoals die tussen chromosoom 5 en 16, en ook tussen chromosoom 11 en 19.Deze SKY-afbeelding van een metafase-spreiding van menselijke chromosomen uit het vaatweefsel van een patiënt zonder A-D-P-K-D vertoont het normale vrouwelijke karyotype van 44 autosomen en twee XXX-chromosomen. Deze definitieve SKY-afbeelding toont een metafase-spreiding uit het vaatweefsel van een A-D-P-K-D-patiënt met een abnormaal karyotype van 88 autosomen en vier XXXX-geslachtschromosomen. Eén master.Deze techniek kan in vijf dagen worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

spectral-karyotyping-to-study-chromosome-abnormalities-humans-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Chromosomics: Detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman OctoChrome FISH-test

DNA herstelmechanismen zijn essentieel om de genomische integriteit en preventie mutatie en kanker. Het doel van dit protocol is om instabiliteit van het genoom te kwantificeren door middel van directe observatie van chromosoomafwijkingen in metafase verspreidt van de muis B-cellen met behulp van fluorescente in situ hybridisatie (FISH) voor telomeer DNA herhalingen.

Snelle analyse van chromosoomafwijkingen in Muis B-lymfocyten door PNA-FISH

De zebravis is een populaire tool voor het modelleren chronische nierziekte (CKD). Echter, hun kleine formaat maakt het onmogelijk om de nierfunctie te evalueren met behulp van traditionele methoden. We beschrijven een fluorescerende kleurstof nier speling assay 1 dat kwantitatieve analyse van de zebravis nierfunctie bij CKD maakt.

Evaluatie van de zebravis Kidney Functie Met behulp van een TL-Ontruiming Assay

Het gebruik van ultrahoge veld MRI als een niet-invasieve manier om fenotypische informatie te verkrijgen van knaagdiermodellen voor polycystische nierziekte en om interventies te monitoren, wordt beschreven. In vergelijking met de traditionele histologische aanpak, kunnen MRI-beelden in vivo worden verkregen, wat longitudinale follow-up mogelijk maakt.

Het gebruik van ultra-hoge gebied MRI in kleine knaagdieren Modellen van Polycystic voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotypering and Drug Monitoring

Ionenkanalen tot expressie in renale tubulaire epitheel spelen een belangrijke rol in de pathologie van polycystische nierziekte. Hier beschrijven we de experimentele protocollen die worden gebruikt om patch-clamp-analyse en intracellulaire calciumgehalte metingen uit te voeren in cystic epitheel vers geïsoleerd van knaagdieren nieren.

Implementeren Patch Clamp en Live-fluorescentie microscopie om functionele eigenschappen van vers geïsoleerde PKD Epithelium Monitor

Primaire cilia beïnvloeden verschillende signaalroutes. De cochlea van zoogdieren is ideaal voor het onderzoeken van planaire celpolariteit (PCP) signalering. Cilia-disfunctie beïnvloedt cochleaire uitgroei, cellulaire patterning en oriëntatie van haarcellen, uitlezingen van PCP. Ons doel is om PCP-signalering in muis cochlea te analyseren via fenotypische analyse, immunohistologie en rasterelektronenmicroscopie.

Evaluatie van Planar-Cell-Polariteit Phenotypes in ciliopathie Mouse Mutant Cochlea

Het huidige protocol beschrijft de bruikbaarheid van meervoudige fluorescentie in situ hybridisatie (mFISH) en spectraal karyotypering (SKY) bij het identificeren van inter-chromosomale stabiele afwijkingen in de beenmergcellen van muizen na blootstelling aan totale lichaamsbestraling.

Detectie van Inter-chromosomale Stable aberraties door Multiple Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (mFISH) en Spectral Karyotypering (SKY) in bestraalde muizen

Als de genetische varianten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens begint te worden blootgelegd, wordt het steeds belangrijker systemen waarmee snel evalueren de biologische betekenis van deze geïdentificeerde varianten te ontwikkelen. Dit protocol wordt beschreven methoden voor de evaluatie van menselijke genfunctie tijdens vrouwelijke meiose ik met behulp van de muis eicellen.

Met behulp van de muis eicellen te beoordelen van menselijke genfunctie tijdens de meiose I

Dit protocol demonstreert robotische echografie (VS) als een praktisch, kosteneffectief en snel alternatief voor traditionele niet-invasieve beeldmodaliteiten.

Gebruik van 3D-robotechografie voor in vivo analyse van muizennieren

We beschrijven een techniek waarbij een deel van de abdominale aorta van een muis getransplanteerd orthotopically is om net onder de nierslagaders in een allogene of syngene ontvanger. Deze techniek kan nuttig zijn in studies waarin transplantatie van grote slagaders van gelijke grootte is als voordelig.

Orthotope Aorta Transplantatie in Muizen voor de Studie van vasculaire aandoeningen

Leer Spectral Karyotyping (SKY) voor cytogenetisch onderzoek naar chromosoomafwijkingen bij mensen en muizen met polycysteuze nierziekte. Deze methode detecteert complexe chromosomale translocaties en structurele afwijkingen.

Spectral Karyotypering naar chromosoomafwijkingen bij mensen en muizen Studie met polycysteuze nierziekte

Meer video's verkennen