Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

Deze video beschrijft een procedure voor het volgen van signaleringsgebeurtenissen van de T-celreceptor met behulp van gelijktijdige acquisitie via twee kanalen. Totaal interne reflectie-fluorescentiemicroscopie of TIRF-microscopie. T-cellen worden eerst getransfecteerd met een plasmide dat GFP-getagd ZAP 70 codeert. Er wordt een door glas ondersteunde lipide dubbellaag geprepareerd, waarin lipide-verankerde peptide-MHC-complexen, adhesiemoleculen en co-stimulerende moleculen zijn opgenomen.

De met ZAP 70 getransfecteerde T-cellen worden toegevoegd aan de dubbellaag wanneer de T-celreceptoren worden geactiveerd door peptide-MHC-complexen. De met de T-celreceptor geassocieerde CD3-ketens worden gefosforyleerd door de SARC-familiekinase LCK, waarna de kinase zap 70 vanuit het cytoplasma wordt gerekruteerd. De T-celreceptor wordt vervolgens fluorescent gelabeld en er wordt beeldvorming uitgevoerd waarbij de cellen zijn ondergedompeld in een medium met een lagere brekingsindex dan het dekglas en worden verlicht door een laserstraal onder een hoek die totale interne reflectie ondergaat.

Dit genereert een evanescente golf op de glas-waterinterface, die exponentieel afneemt in het medium, waardoor een penetratiediepte van 100 tot 200 nanometers wordt bereikt. Hierdoor worden alleen fluorforen in het plasmamembraan of zeer dicht daarbij geëxciteerd. Analyse van de resulterende beelden onthult dat signalering plaatsvindt in microclusters van de T-celreceptor.

Het belangrijkste voordeel van TIRF-microscopie of conventionele confocale microscopie is dat u een betere resolutie verkrijgt, waardoor signaleringsclusters of signaleringscomplexen, zoals TCR-microclusters, eenvoudig gevisualiseerd kunnen worden. Travis Crites en Chen, beiden postdocs in mijn laboratorium, zullen demonstreren hoe primaire muis-T-cellen getransfecteerd kunnen worden met behulp van de maxi nucleofection-technologie, om ze vervolgens te imagen met total internal reflection fluorescence microscopy of TIRF-M, gestimuleerd met een glassupported lipid bilayer die antigen bevat.

Deze methode is uitgebreid gebruikt om signalering in diverse immuuncellen te bestuderen, waaronder T-cellen, B-cellen, natural killer-cellen en mestcellen. De methode is breed toepasbaar en kan worden gebruikt om de meeste receptorsystemen in zoogdiercellen te bestuderen, vooral wanneer signalering in clusters plaatsvindt. Personen die nieuw zijn met deze methode kunnen in het begin moeite hebben, aangezien T-cellen zeer moeilijk te transfecteren zijn.

Daarnaast is een nauwkeurige coördinatie vereist zodat de levensvatbaarheid van de T-cellen en de transfectie-efficiëntie, de kwaliteit van de bilaren alsook de uitlijning van de microscoop aan de eisen voldoen. De eerste stap van deze procedure is het transfecteren van naïeve of in vitro geactiveerde primaire T-cellen met expressieplasmiden en coderende signaleringsmoleculen gelabeld met GFP, met behulp van een AM maxa mouse T-cell nucleo effector kit. Alle T-cellen die in deze studie zijn gebruikt, uitten de A-N-D-T-C-R die het MCC-peptide herkent, gevonden op het MHC-molecuul IE van K. De hier getoonde transfectieprocedure wordt uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant.

Er worden echter enkele tips gegeven om de levensvatbaarheid van de T-cellen na transfectie te bevorderen. Zowel de levensvatbaarheid als de transfectie-efficiëntie zijn hoger in in vitro geactiveerde T-cellen dan in naïeve cellen; daarom maakt dit protocol gebruik van in vitro geactiveerde T-cellen bij de start. Bereid voor elke transfectie twee milliliter aangevuld T-celmedium door 1,9 milliliter medium uit de kit, 20 µL component A, 20 µL component B en 100 µL foetaal runderserum te combineren in een buisje van twee milliliter.

Breng twee milliliters medium over naar elke put van een 12-wellplaat. Plaats de plaat gedurende ten minste een uur in een bevochtigde incubator bij 37 °C om het medium te laten equilibreren; resuspensie van getransfecteerde cellen in medium dat koud is of geen pH van 7,2 heeft, zal leiden tot celdood. Om het transfectiemengsel te bereiden, combineert u 82 microliters mouse T-cell nucleo effector solution met 18 microliters supplement twee en vijf micrograms endotoxinevrij plasmide-DNA bij een concentratie van niet minder dan 0,5 micrograms per microliter; meng dit grondig door te tikken.

Breng vijf tot 10 miljoen cellen over naar een centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 75 ×g op kamertemperatuur. Gebruik na het centrifugeren een vacuümaspirator om zoveel mogelijk van het supernatant te verwijderen om de celpellet in het transfectiemengsel te resuspenderen en aspireer de celpellet voorzichtig en langzaam drie tot vier keer totdat er geen grote celklonters meer aanwezig zijn. Breng de suspensie met een pipet voorzichtig over naar een gecertificeerde amaxa cuvette, waarbij u er zeker van bent dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.

Selecteer het nucleaire effectorprogramma X 0 0 1 op het nucleo-effectorapparaat. Plaats de vete in de Q-vetehouder en druk op de knop om het geselecteerde programma toe te passen. Verplaats vervolgens onmiddellijk de vete en het vooraf geëquilibreerde kweekmedium naar de zuurkast.

Voeg met de meegeleverde plastic pipet ongeveer 500 microliters van het vooraf geëquilibreerde medium toe aan de vete. Voeg vervolgens de celсусpensie druppelsgewijs toe aan het medium in de plaat.

Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende vier uur om een lage expressie van de GFP-getagde eiwitten mogelijk te maken en de verschijning van artefacten door overexpressie te minimaliseren. In deze sectie wordt een methode beschreven voor het uitlijnen van de microscoop voor gelijktijdige imaging met twee kanalen voordat alle componenten van de microscoop worden ingeschakeld. Start de computer en de software op.

Controleer vervolgens of alle hardwarecomponenten door de software worden herkend. Aangezien de software zonder foutmeldingen start, zijn alle componenten gedetecteerd. Verdun één µL subresolutie.

Voeg de Flores heldere multifunctionele fluorescerende microsferen toe aan twee milliliters PBS voor gebruik als colocalisatiestandaard. Voeg vervolgens 0,25 milliliters van de microsfeer-suspensie toe aan elke put van een lab tech acht-puts kamer-dekglaassysteem. Plaats het kamer-objectglassysteem op het platform boven de objectief.

Stel vervolgens de focus in op de live preview voor de kralen die aan het glas absorberen. Het linkerpaneel is het kanaal waarin GFP-getransfecteerde cellen zichtbaar zullen zijn. Het rechterpaneel toont gelabelde TCR tijdens live-cell imaging-experimenten.

Gebruik de Y-uitlijning van de XY, Z-vezelkoppeling om de positie van de laserstraal aan te passen, zodat de straal uit het objectief komt en op het plafond wordt geprojecteerd. Het is belangrijk om dit te doen wanneer het objectief zich in de positie bevindt waarin het glasvlak in focus is. Als de straal op het plafond diffuus is, is de straal niet gecollimeerd.

Stel de Z-micrometer in om een volledige collatietest te bereiken voor elk van de laserlijnen die in het experiment worden gebruikt. Stel vervolgens met een laservermogensmeter het laservermogen in op 20 tot 30 micro watts voor elk kanaal. T-cellen zijn uiterst gevoelig voor laserstraling en de bestraling is beperkt tot een gecombineerd totaal van 50 micro watts.

Stel vervolgens de hoek voor het gazon in. Draai aan de Y-uitlijnmicrometer op de vezelkoppeling om de straal weg van het plafond te bewegen totdat de hoek ten opzichte van de optische as van de objectieven 90 graden nadert.

Zodra de kritische hoek voor totale interne reflectie is bereikt, zal het laserlicht het objectief niet meer verlaten. Om vast te stellen of de uitlijning van de turf is bereikt, stelt u scherp boven en onder het vlak van het dekglas. Merk op dat wanneer de kralen die aan het oppervlak zijn geadsorbeerd uit focus raken, veel kralen in de oplossing te zien zijn. Om een goede uitlijning van de turf te bereiken, is het noodzakelijk om de hoek van de bundel ten opzichte van het objectief te vergroten.

Naarmate de hoek van de bundel wordt vergroot, beginnen de kralen die nabij het oppervlak zweven te verdwijnen en neemt de intensiteit van de kralen die aan de interface zijn geabsorbeerd toe. Wanneer de kralen die aan de interface zijn geabsorbeerd nu uit focus worden gebracht, blijven er geen zwevende kralen in de oplossing zichtbaar. Op dit punt is de opstelling correct uitgelijnd, aangezien alleen de kralen die aan het dekglas zijn geabsorbeerd in focus kunnen zijn.

Richt vervolgens de rode en groene fluorescentiekanalen ten opzichte van elkaar uit door scherp te stellen op de kraaltjes en de positie van identificeerbare kenmerken in de beelden van beide kanalen te vergelijken. Gebruik de X- en Y-micrometerschroeven op één camerastatief om de relatieve positie van de kraaltjes zo dicht mogelijk bij elkaar te brengen. Let hierbij op het heldere kraaltje in het linkerbenedenkwadrant van beide beelden om de ruimtelijke uitlijning tussen de twee kanalen te waarborgen.

Dit kenmerk wordt in beide afbeeldingen naar dezelfde relatieve positie gebracht. Leg de afbeelding van beide kanalen vast en sla deze op. Deze afbeeldingen zullen worden gebruikt als colocalisatiestandaard om de twee kanalen uit te lijnen.

Een voorbeeld van deze uitlijning is hier te zien voorafgaand aan de uitlijning. Een van de kanalen is gedraaid ten opzichte van het andere, zoals getoond in deze afbeelding waarin beelden van de twee kanalen van de subresolutie-beads over elkaar zijn gelegd. Na aanpassingen zijn de beelden uitgelijnd, zoals hier wordt getoond.

De kwaliteit van de uitlijning kan verder worden gecontroleerd door beelden van GFP-getransfecteerde levende cellen te vergelijken. Let op hoe de Laila-podia van de twee kanalen perfect zijn uitgelijnd, nadat de twee beelden zijn uitgelijnd met behulp van de kalibratie die is vastgesteld met de fluorescente microbeads.

Zodra de microscoop is ingesteld, worden stroomkamers voorbereid die glasondersteunde lipide dubbellagen bevatten waarin antigenen worden gepresenteerd, en wordt turf M uitgevoerd om eerst de interactie van TRANSFECTE T-cellen met het substraat te visualiseren. Volg het door Ana en Dustin beschreven protocol om een stroomkamer te assembleren met planaire lipide dubbellagen, gevormd op een glazen dekglas met Ni-NTA lipiden, het adhesiemolecuul ICAM-1 en peptide-MHC-complexen. MCC-geladen IEFK worden via histidinetags in de dubbellaag geïncorporeerd.

Het co-stimulatorische molecuul CD 80 wordt geïncorporeerd. Plaats de flowcel met behulp van een GPI-anker op de tafel van de microscoop en stabiliseer deze door de kamer met een spanningstang aan een adapterplaat op de microscooptabel te bevestigen om deze te immobiliseren. Bevestig vervolgens het door de fabrikant geleverde verwarmingselement op de flowcel om de temperatuur ervan te regelen.

Positioneer het objectief op een dubbellaag en stel het vlak van de dubbellaag scherp om de verwarming van het objectief en de flowcel mogelijk te maken; schakel de verwarmers van de flowcel en het objectief in om de temperatuur van de kamer naar 37 °C te brengen. Na vier uur incubatie worden de getransecteerde T-cellen overgebracht naar een buis van 15 milliliter en gecentrifugeerd bij een snelheid van 80 ×g. Resuspendeer de cellen in 300 µL H-B-S-B-S-A-buffer. Voeg vervolgens H 57 FAB of het H 57 single chain variable fragment toe om de TCR te labelen tot een eindconcentratie van 10 µg/mL voor fab of 20 µg/mL voor het single chain variable fragment.

Breng de cellen over naar een fax-buisje van vijf milliliter. Injecteer vervolgens de cellen met behulp van een slip-tip spuit van één milliliter via een driewegkraan in de flowkamer. Stel de beeldvormingscondities zo in dat de dual-channel live-acquisitie een live-voorbeeld van de TCR- en GFP-kanalen toont en zoek een veld met getransfecteerde cellen.

Vanwege intensiteitsverschillen tussen de TCR en GFP moet de schaling van de beelden mogelijk in real-time worden aangepast, zodat de cellen in beide kanalen gevisualiseerd kunnen worden. Bevestig, zoals hier het geval is, de turf-verlichting door het glaszvlak scherp te stellen om eventuele laterale membraankleuring te detecteren. Als de laterale membranen niet in focus komen, is de turf-uitlijning correct.

In deze live-preview is de laterale membraankleuring zichtbaar, zowel in het vlak van het dekglas als wanneer het dekglas uit focus wordt gebracht om de microscoop in een goede turf-uitlijning te brengen. De hoek van de laser ten opzichte van het objectief wordt vergroot en het laterale membraan raakt uit focus. Begin met het vastleggen van individuele beelden en time-lapse-sequenties met een interval van 10 seconden.

Gedurende vijf minuten werden de cellen geïncubeerd op glas-ondersteunde INTA-bilayers die zes moleculen per vierkante micrometer peptide bevatten, geladen met hist-getagd IEFK, 100 moleculen per vierkante micrometer Alexa 647-geconjugeerd hist-getagd ICAM-1 en 100 moleculen per vierkante micrometer GPI-verankerd CD80. Dual-channel simultane acquisitie TIRF-microscopie werd uitgevoerd in de continue aanwezigheid van Alexa 546-geconjugeerd H57 FAB-fragment.

Om de TCR te kleuren werden de cellen tot één uur na het eerste contact met de dubbellaag afgebeeld. Het aantal ZAP 70-clusters per cel werd geanalyseerd met behulp van geautomatiseerde software voor het tellen van clusters. In elk geval werden ten minste 40 cellen geanalyseerd.

De geladen peptiden zijn aangegeven in het inzetje. ICAM one verwijst naar cellen op dubbellagen die 100 moleculen per vierkante micrometer Alexa 6 4 7-geconjugeerd His-getagd ICAM one bevatten, zoals getoond in de figuur. Zap 70-afhankelijke signalering vindt plaats in TCR-microclusters en alleen als reactie op agonist-liganden, zoals te zien is in deze video, opgenomen met 10 seconden per frame.

TCR-signalering als reactie op agonist-peptiden wordt in stand gehouden door de continue vorming van TCR-microclusters in de periferie van het contactgebied die ZAP 70 rekruteren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u primaire T-cellen kunt transfecteren met behulp van een maxa-nucleaire affectietechnologie en hoe u de rekrutering van GFPT-signaleringsmoleculen naar TCR-microclusters correct kunt in beeld brengen met turf-microscopie. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in zeven uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zeer voorzichtig om te gaan met uw primaire cellen. Hoe gezonder de cellen in elke stap van het experiment zijn, hoe hoger de transfectie-efficiëntie zal zijn en hoe meer cellen u zult vastleggen in uw beeldvorming. T-cellen zijn zeer motiel en als gevolg hiervan zorgt sequentiële beeldvorming van het TCR- en GFP-kanaal ervoor dat de twee beelden niet perfect uitlijnen vanwege de beweging van TCR-microclusters en cellen.

Om dit probleem op te lossen, hebben we de dual channel simultaneous acquisition turf microscope ontwikkeld.