Name: Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 10 s
Description: Leer TIRF-microscopie voor real-time beeldvorming van T-celreceptorsignalering met GFP-gelabelde ZAP-70 in muizen-T-cellen. Deze methode maakt simultane detectie van signaalcomplexen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd ondersteund door de afdeling Intramuraal Onderzoek van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten, National Institutes of Health. Wij zijn dankbaar dat Johannes Huppa en Mark Davis voor het aanbieden van ons met de scFv van H57 gebruikt in deze studies. RV wil Keir Neumann bedanken voor nuttige discussie tijdens de ontwikkeling van deze techniek.

<ol><li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+cell+receptor%3A+critical+role+of+the+membrane+environment+in+receptor+assembly+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The T cell receptor: critical role of the membrane environment in receptor assembly and function.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 101-125 (2005).</li>
<li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S.T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">S.T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 591-619 (2009).</li>
<li>Bezbradica, J. S., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cytokine+and+heterologous+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of cytokine and heterologous receptor signaling pathways.</a> Nat. Immunol. 10, 333-339 (2009).</li>
<li>Fraser, I. D., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+the+network%3A+signaling+cross-talk+in+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Navigating the network: signaling cross-talk in hematopoietic cells.</a> Nat. Immunol. 10, 327-331 (2009).</li>
<li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Curr. Protoc. Immunol. Chapter 18, 13-13 (2007).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li>
<li>Yokosuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat. Immunol. 6, 1253-1262 (2005).</li>
<li>Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li>
<li>Tolar, P., Pierce, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conformation-induced+oligomerization+model+for+B+cell+receptor+microclustering+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A conformation-induced oligomerization model for B cell receptor microclustering and signaling.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 340, 155-169 (2010).</li>
<li>Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+skeleton+controls+diffusion+dynamics+and+signaling+through+the+B+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The membrane skeleton controls diffusion dynamics and signaling through the B cell receptor.</a> Immunity. 32, 187-199 (2010).</li>
<li>Treanor, B., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insight+into+lymphocyte+activation+through+quantitative+imaging+and+theoretical+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insight into lymphocyte activation through quantitative imaging and theoretical modelling.</a> Curr. Opin. Immunol. 19, 476-483 (2007).</li>
<li>Sylvain, N. R., Nguyen, K., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vav1-mediated+scaffolding+interactions+stabilize+SLP-76+microclusters+and+contribute+to+antigen-dependent+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Vav1-mediated scaffolding interactions stabilize SLP-76 microclusters and contribute to antigen-dependent T cell responses.</a> Sci. Signal. 4, ra14-ra14 (2011).</li>
<li>Purbhoo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+subsynaptic+vesicles+and+surface+microclusters+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Dynamics of subsynaptic vesicles and surface microclusters at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 3, ra36-ra36 (2010).</li>
<li>Lasserre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezrin+tunes+T-cell+activation+by+controlling+Dlg1+and+microtubule+positioning+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">Ezrin tunes T-cell activation by controlling Dlg1 and microtubule positioning at the immunological synapse.</a> EMBO. J. 29, 2301-2314 (2010).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7%3A+Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).</li>
<li>Williamson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+clusters+of+the+adaptor+Lat+do+not+participate+in+early+T+cell+signaling+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pre-existing clusters of the adaptor Lat do not participate in early T cell signaling events.</a> Nat. Immunol. 12, 655-662 (2011).</li>
</ol>

Alle dieren die in deze experimenten werden aangehouden in een specifieke pathogeen-vrije omgeving, en de experimenten werden goedgekeurd door de National Institutes of Health Animal Care en gebruik Comite.

We beschrijven hier een systeem om te studeren signalering van antigeen-specifieke primaire muis T cellen met behulp van TIRFM en glas ondersteund lipidendubbellagen als kunstmatige APC&#39;s. De techniek is gebaseerd op succes expressie GFP gemerkte eiwitten in deze cellen. Transfecteren T-cellen is altijd een uitdagende taak. Gewoonlijk worden elektroporatie of gentherapie met behulp van retrovirussen of lentivirussen gebruikt. Een techniek is superieur over elkaar, elk hun beperkingen en voordelen. We merken dat elektroporatie heeft de volgende voordelen: 1) Het is niet nodig dat de cellen actief delen als dient retrovirussen maar lentivirussen, en 2) de expressie kan geregeld door variëren van de tijd de cellen geïncubeerd voor beeldvorming worden. Het grootste nadeel is dat we vinden het erg moeilijk om eiwitten die groot zijn in omvang in primaire cellen uit te drukken. Wij hebben voorgesteld een methode die ons zeer goede levensvatbaarheid van de cellen na elektroporatie. Hierdoor is toepassing zullenle te gebruiken om siRNA gemedieerde silencing bereiken. We hebben ook hier beschrijven een aangepaste twee-kanaals gelijktijdige overname TIRF microscoop die chromatisch wordt gecorrigeerd en vereist geen aparte lijn voor verschillende golflengten. Deze mogelijkheden, maar zijn in de handel verkrijgbaar. Ons systeem is gebaseerd op principes van TIRF microscopie gepubliceerd door experts in het veld en is goedkoper dan commerciële alternatieven. Een mogelijke kritiek op ons ontwerp is dat we in dezelfde hoek van inval gebruiken voor de verschillende golflengten. Dit zou resulteren in een andere TIRF indringdiepte voor verschillende golflengten. Wij denken dat deze effecten klein zijn, omdat de vluchtige golf is een exponentieel afvallende veld en de diepte van de TIRF veld is een lineaire functie van de golflengte. Fluoroforen nabij het glas wordt ervaren geen verschil in intensiteit laser tussen de twee golflengtes. Voor fluoroforen bij penetration diepte zal de intensiteit verschil 1,3 maal voor de twee golflengtes 488 en 640 nm en 1,15 maal voor de twee golflengtes 488 en 561 nm. Hetzelfde systeem kan worden gebruikt in combinatie met superresolutie technieken gebruik TIRF verlichting maken. We hebben ook beschreven een twee camera systeem dat op maat wordt gemaakt. Net als de TIRF dat vergelijkbaar inrichtingen zijn ook commercieel verkrijgbaar. Ons systeem biedt flexibiliteit voor de filters en koudlichtspiegel te veranderen, zodat het gebruik ervan met verschillende combinaties van golflengten. Het nadeel van ons systeem is de mate van rotatie nodig is om de twee afbeeldingen uit te lijnen. Dit probleem kan worden opgelost door gebruik te maken camera stands die piëzo worden gedreven en bieden rotatie-graden van de aanpassing. We hebben ook met succes een systeem met twee camera deze microscoop, waarbij de camera zijn verschillend en verschillende afmetingen pixel. Een dergelijk systeem zou nuttig zijn als men die nodig zijn gevoeligheid in een kanaal en een grote dynamische bereik in een andere, die beide zelden in dezelfde camera. We gebruikten de Photometrics HQ-2 camera op 2x2 binning geeft ons een effectieve pixelgrootte van 12,9 micrometer met de Photometrics Quant-EM camera die een pixelgrootte van 16 micrometer heeft. Een 180 mm brandpuntsafstand buis lens werd gebruikt voor de Quant-EM en 145 mm brandpuntsafstand buis lens werd gebruikt voor de HQ-2 camera. De HQ-2 werd gecontroleerd met behulp van Metamorph software en de Quant-EM werd gecontroleerd via micro-manager software op een aparte computer in externe trigger-modus. De externe trigger zijn verstrekt aan de Quant-EM camera met een digitale uitgang van de Measurement Computing DAC bord, dat werd uitgevoerd als een extra sluiter in de configure verlichting instellingen van Metamorph. De verhouding van de brandpuntsafstand van de buis lenzen overeenkomt de verhouding van de effektieve pixelgroottes. Een representatieve uitlijning in figuur 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector Kit voor Mouse T-cellen </td><td> Lonza Inc </td><td> VPA-1006 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink HiPure Plasmide Midiprep Kit </td><td> Life Technologies </td><td> K2100-05 </td><td> Voor endotoxinevrij DNA preps </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector Device </td><td> Lonza Inc </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Recombinant Muriene IL-2 </td><td> Peprotech Inc </td><td> 212-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent Microspheres 0.20μm </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 24050-5 </td><td></td></tr><tr><td> Lab-Tek II 8-goed chambered dekglaasje </td><td> Thermo Scientific, Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr></tbody></table>

een tirf microscopie techniek voor real-time, gelijktijdige beeldvorming van de tcr en de bijbehorende signaaleiwitten

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling geïnitieerd door de T cel receptor (TCR) wanneer het wordt aangegrepen door antigeen peptide fragmenten gebonden door Major Histocompatibility Complex (pMHC) eiwitten op het oppervlak van antigeen presenterende cellen (APC&#39;s). De TCR complex bestaat uit het ligandbindende TCRαβ heterodimeer dat geassocieerde niet-covalent met CD3 dimeren (de εδ en εγ heterodimeren en ζζ homodimeer) 1. Bij inschakeling van de receptor, de CD3 ζ ketens gefosforyleerd door het Src familie kinase, Lck. Dit leidt tot de indienstneming van de Syk familie kinase, Zap70, die vervolgens wordt gefosforyleerd en geactiveerd door Lck. Daarna Zap70 fosforyleert de adapter eiwitten LAT en SLP76, inleiding van de vorming van het proximale signaleringscomplex met een groot aantal verschillende signaalmoleculen 2. De vorming van dit complex uiteindelijk resulteert in een calcium en Ras-afhankelijke transcription factor activering en de daaruit opening van een complexe reeks genexpressie&#39;s die tot T celdifferentiatie 2. TCR signalen (en de daaruit voortvloeiende toestand van differentiatie) worden gemoduleerd door tal van andere factoren, waaronder antigeen potentie en samenspraak met co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine en cytokine receptoren 3-4. Het bestuderen van de ruimtelijke en temporele organisatie van de proximale signaleringscomplex onder verschillende omstandigheden stimulatie is daarom de sleutel tot het begrijpen van de TCR signaleringsroute evenals de regulering door de andere signaalwegen. Een zeer nuttig modelsysteem om te studeren signalering op initiatief van de TCR op de plasmamembraan in T-cellen is het glas-ondersteunde lipidendubbellagen, zoals eerder beschreven 5-6. Ze kunnen worden gebruikt om antigene pMHC complexen, adhesie en co-stimulerende moleculen presenteren aan T-cellen-die als kunstmatige APC&#39;s. Door de beeldvorming van de T-cellen de interactie met delipide dubbellaag met totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM) kunnen we de excitatie beperken tot minder dan 100 nm van de ruimte tussen het glas en het celoppervlak 7-8. Dit laat ons toe om de afbeelding in de eerste plaats de signalering gebeurtenissen die zich op het plasmamembraan. Als we geïnteresseerd zijn in de beeldvorming de werving van signalering eiwitten aan het TCR complex, beschrijven we een twee-camera TIRF imaging-systeem, waarbij de TCR, gelabeld met TL-Fab-(fragment antigen binding) fragmenten van de H57 antilichaam (gezuiverd van hybridoma H57-597 , ATCC, ATCC Aantal: kan HB-218), die specifiek is voor TCRβ, en signalering eiwitten, gecodeerd met GFP, gelijktijdig en in real time worden afgebeeld. Deze strategie is noodzakelijk vanwege de zeer dynamische karakter van zowel de T-cellen en de signalering gebeurtenissen die zich voordoen bij de TCR. Deze beeldvormende modaliteit heeft het mogelijk gemaakt onderzoekers het beeld enkele liganden 9-11, alsmede de aanwerving van signaalmoleculen aan geactiveerde receptoren enis een uitstekend systeem om biochemie studeren in-situ 12-16.

De compartimentering van eiwitten, hetzij binnen het plasma membraan of in de intracellulaire locaties is een regulerend mechanisme die sterk kunnen beïnvloeden signalering resultaten, vandaar dat te begrijpen signalering is het van belang het bestuderen van de ruimtelijke en temporele gedrag van de betrokken eiwitten. We beschrijven hier een TIRF microscopie gebaseerde systeem om signaaltransductie in T-cellen te bestuderen, maar is breed toepasbaar.

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

Signalering wordt geïnitieerd via de T-celreceptor (TCR) wanneer deze wordt geactiveerd door antigene peptidefragmenten die gebonden zijn aan het Major Histocompatibility Complex ...

Deze video beschrijft een procedure voor het volgen van T-celreceptor-signaleringsevenementen met behulp van simultane acquisitie via twee kanalen. Total internal reflection fluorescence microscopy of TIRF-microscopie. Eerst worden T-cellen getransfecteerd met een plasmide dat GFP-getagd ZAP 70 codeert. Er wordt een op glas ondersteunde lipide dubbellaag voorbereid, waarin lipide-verankerde peptide-MHC-complexen, adhesiemoleculen en co-stimulerende moleculen zijn opgenomen.De ZAP 70-getransfecteerde T-cellen worden aan de dubbellaag toegevoegd wanneer de T-celreceptoren worden gebonden door peptide-MHC-complexen. De met de T-celreceptor geassocieerde CD3-ketens worden gefosforyleerd door de SARC-familiekinase LCK, waarna de kinase zap 70 vanuit het cytoplasma wordt gerekruteerd. De T-celreceptor wordt vervolgens fluorescent gelabeld en er wordt beeldvorming uitgevoerd waarbij de cellen zijn ondergedompeld in een medium met een lagere brekingsindex dan het dekglas en worden belicht door een laserstraal onder een hoek die totale interne reflectie ondergaat.Dit genereert een evanescente golf op de grensvlak tussen glas en water, die exponentieel afneemt in het medium, waardoor een penetratiediepte van 100 tot 200 nanometer mogelijk is. Hierdoor worden alleen fluoroforen in het plasmamembraan of zeer dicht daarbij geëxciteerd. Analyse van de resulterende beelden onthult dat signalering plaatsvindt in microclusters van de T-celreceptor.Het belangrijkste voordeel van TIRF-microscopie of conventionele confocale microscopie is dat men een betere resolutie verkrijgt, waardoor signaleringsclusters of signaleringscomplexen, zoals TCR-microclusters, gemakkelijk gevisualiseerd kunnen worden. Travis Crites en Chen, beide postdocs in mijn lab, zullen demonstreren hoe primaire muis-T-cellen getransfecteerd kunnen worden met behulp van de maxi nucleofection-technologie en vervolgens hoe deze afgebeeld kunnen worden met total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF-M), gestimuleerd door een glazen ondersteunde lipide bilaag die antigeen bevat.Deze methode is uitgebreid gebruikt om signalering in diverse immuuncellen te bestuderen, waaronder T-cellen, B-cellen, natural killer-cellen en mestcellen. De methode is breed toepasbaar en kan worden gebruikt om de meeste receptorgstystemen in zoogdiercellen te bestuderen, vooral wanneer signalering in clusters plaatsvindt. Personen die nieuw zijn met deze methode kunnen in het begin moeite hebben, aangezien T-cellen zeer moeilijk te transfecteren zijn.Daarnaast is een nauwkeurige coördinatie vereist zodat de levensvatbaarheid van de T-cellen en de transfectie-efficiëntie, de bilar-kwaliteit en de uitlijning van de microscoop aan de eisen voldoen. De eerste stap van deze procedure is het transfecteren van ofwel naïeve of in vitro geactiveerde primaire T-cellen met expressieplasmiden en coderende signaalmoleculen getagd met GFP, met behulp van een AM maxa mouse T-cell nucleo effector kit. Alle T-cellen die in deze studie zijn gebruikt, drukten de A-N-D-T-C-R uit die het MCC-peptide herkent, aangetroffen op het MHC-molecuul IE van K. De hier getoonde transfectieprocedure wordt uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant.Er worden echter enkele tips gegeven om de levensvatbaarheid van de T-cellen na transfectie te bevorderen. Zowel de levensvatbaarheid als de transfectie-efficiëntie zijn hoger in in vitro geactiveerde T-cellen dan in naïeve cellen; daarom maakt dit protocol gebruik van in vitro geactiveerde T-cellen bij aanvang. Bereid voor elke transfectie twee milliliter aangevuld T-celmedium voor door 1,9 milliliter van het in de kit meegeleverde medium, 20 µL component A, 20 µL component B en 100 µL foetaal runderserum te combineren in een buisje van twee milliliter.Breng twee milliliters medium over naar elke well van een 12-well plaat. Plaats de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 °C gedurende ten minste een uur om het medium te laten equilibreren; resuspensie van getransfecteerde cellen in medium dat koud is of geen pH van 7,2 heeft, zal leiden tot celdood. Combineer voor het bereiden van het transfectiemengsel 82 microliters muizen T-cel nucleo effector-oplossing met 18 microliters supplement twee en vijf micrograms endotoxine-vrij plasmid DNA bij een concentratie van niet minder dan 0,5 micrograms per microliter en meng dit grondig door te tikken.Breng vijf tot 10 miljoen cellen over naar een centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 75 ×g op kamertemperatuur. Gebruik een vacuümaspirator om zoveel mogelijk van het supernatant te verwijderen om het celpellet in het transfectiemengsel te resuspenderen en aspireer het celpellet voorzichtig en langzaam drie tot vier keer totdat er geen grote celklonters meer aanwezig zijn. Breng de suspensie met een pipet zorgvuldig over naar een gecertificeerde amaxa vete, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.Selecteer het nucleaire effectorprogramma X 0 0 1 op het nucleo-effectorapparaat. Plaats de vete in de Q-vetehouder en druk op de knop om het geselecteerde programma toe te passen. Breng vervolgens de vete en het vooraf geëquilibreerde cultuurmedium direct over naar de zuurkast.Voeg met de meegeleverde plastic pipet ongeveer 500 microliters van het vooraf geëquilibreerde medium toe aan de vete. Voeg vervolgens de celsuspensie druppel voor druppel toe aan het medium in de plaat.Incubeer de cellen gedurende vier uur bij 37 °C om een lage expressie van de GFP-getagde eiwitten mogelijk te maken en het ontstaan van artefacten door overexpressie te minimaliseren. In dit onderdeel wordt een methode beschreven voor het uitlijnen van de microscoop voor gelijktijdige beeldvorming via twee kanalen, voordat alle componenten van de microscoop worden ingeschakeld. Start de computer en de software op.Controleer vervolgens of alle hardwarecomponenten door de software worden herkend. Aangezien de software zonder foutmeldingen start, zijn alle componenten gedetecteerd. Verdun één µL van de subresolutie.Voeg de fluorescerende multi-fluorescente microsferen toe aan twee milliliters PBS om als colokalisatiestandaard te gebruiken. Voeg vervolgens 0,25 milliliters van de microsfeersuspensie toe aan elke well van een Lab Tech acht-well chambered cover glass-systeem. Plaats het chamber slide-systeem op het platform boven de objectief.Breng vervolgens de kralenabsorptie op het glas in focus in het live-voorbeeld. Het linkerpaneel is het kanaal waarin GFP-getransfecteerde cellen zichtbaar zullen zijn. Het rechterpaneel toont gelabelde TCR tijdens live-cell imaging-experimenten.Pas met de Y-uitlijning van de XY, Z-vezelkoppeling de positie van de laserstraal aan, zodat de straal uit het objectief komt en op het plafond wordt geprojecteerd. Het is belangrijk om dit te doen wanneer het objectief zich in de positie bevindt waarin het glasvlak in focus is. Als de straal op het plafond diffuus is, is de straal niet gecollimeerd.Stel de Z-micrometer in om een volledige collatietest te verkrijgen voor elk van de laserlijnen die in het experiment worden gebruikt. Stel vervolgens met een laservermogensmeter het laservermogen in op 20 tot 30 micro watts voor elk kanaal. T-cellen zijn extreem gevoelig voor laserstraling en de belichting is beperkt tot een gecombineerd totaal van 50 micro watts.Stel vervolgens de hoek voor de turf in. Draai aan de Y-uitlijningsmicrometer van de vezellaunch om de bundel weg van het plafond te bewegen totdat de hoek ten opzichte van de optische as van de objectieven 90 graden benadert.Zodra de kritieke hoek voor totale interne reflectie is bereikt, zal het laserlicht het objectief niet meer verlaten. Om te beoordelen of de turf-uitlijning is bereikt, focust u boven en onder het vlak van het dekglas. Merk hierbij op dat wanneer de kralen die aan het oppervlak zijn geadsorbeerd uit focus raken, veel kralen in de oplossing kunnen worden gezien zweven. Om een goede turf-uitlijning te bereiken, is het noodzakelijk om de hoek van de bundel ten opzichte van het objectief te vergroten.Naarmate de hoek van de bundel wordt vergroot, beginnen de kraaltjes die nabij het oppervlak zweven te verdwijnen en neemt de intensiteit van de kraaltjes die aan de interface zijn geadsorbeerd toe. Wanneer de kraaltjes die aan de interface zijn geadsorbeerd nu uit focus worden gebracht, blijven er geen zwevende kraaltjes in de oplossing zichtbaar. Op dit punt is de opstelling correct uitgelijnd, aangezien alleen de kraaltjes die aan het dekglas zijn geadsorbeerd in focus kunnen zijn.Richt vervolgens de rode en groene fluorescentiekanalen ten opzichte van elkaar uit door op de beads te focussen en de positie van identificeerbare kenmerken in de beelden van beide kanalen te vergelijken. Gebruik de X- en Y-micrometerschroeven op één camerastatief om de relatieve positie van de beads zo dicht mogelijk bij elkaar te brengen. Let hierbij op de heldere bead in het linkeronderkwadrant van beide beelden om de ruimtelijke uitlijning tussen de twee kanalen te waarborgen.Deze eigenschap wordt in beide afbeeldingen in dezelfde relatieve positie gebracht. Leg de afbeelding van beide kanalen vast en sla deze op. Deze afbeeldingen zullen worden gebruikt als colocalisatiestandaard om de twee kanalen uit te lijnen.Een voorbeeld van deze uitlijning is hier te zien vóór de uitlijning. Een van de kanalen is gedraaid ten opzichte van het andere, zoals getoond in deze afbeelding waarin beelden van de subresolutie-beads uit de twee kanalen over elkaar heen zijn gelegd. Na de aanpassingen zijn de beelden uitgelijnd, zoals hier weergegeven.De kwaliteit van de uitlijning kan verder worden gecontroleerd door beelden van GFP-getransfecteerde levende cellen te vergelijken. Let op hoe het Laila-podium van de twee kanalen perfect zijn uitgelijnd nadat de twee beelden zijn uitgelijnd met behulp van de kalibratie die is vastgesteld met de fluorescerende microbeads.Zodra de microscoop is ingesteld, worden stroomkamers voorbereid die glasondersteunde lipide dubbellagen bevatten waarin antigenen worden gepresenteerd, en wordt turf M uitgevoerd om eerst TRANSFECTED T-cellen te visualiseren die interageren met het substraat. Volg het door Ana en Dustin beschreven protocol om een stroomkamer te assembleren met planaire lipide dubbellagen gevormd op een glazen dekglas met NI NTA-lipiden, het adhesiemolecuul ICAM 1 en peptide-MHC-complexen. MCC-geladen IEFK worden in de dubbellaag ingebouwd via histidinetags.Het co-stimulerende molecuul CD 80 wordt geïncorporeerd. Plaats de flowcel met behulp van een GPI-anker op de tafel van de microscoop en stabiliseer deze door de kamer met een spanningsstang aan een adapterplaat op de microscooptafel te bevestigen om deze te immobiliseren. Bevestig vervolgens het door de fabrikant geleverde verwarmingselement aan de flowcel om de temperatuur ervan te regelen.Plaats het objectief op een dubbellaag en stel het vlak van de dubbellaag scherp om het objectief te kunnen verwarmen; schakel de verwarmingsapparaten van de flowcel en het objectief in om de temperatuur van de kamer naar 37 °C te brengen. Na vier uur incubatie worden de getransecteerde T-cellen overgebracht naar een buis van 15 ml en gecentrifugeerd bij een snelheid van 80 ×g. Resuspendeer de cellen in 300 µL H-B-S-B-S-A-buffer. Voeg vervolgens H 57 FAB of H 57 single-chain variabele fragment toe om de TCR te labelen tot een uiteindelijke concentratie van 10 µg/mL voor FAB of 20 µg/mL voor het single-chain variabele fragment.Overbreng de cellen naar een fax-buis van vijf milliliter. Injecteer vervolgens de cellen met een slip-tip spuit van één milliliter via een drievatenkraan in de flowkamer. Stel de beeldvormingscondities zo in dat de dual-channel live-acquisitie een live-voorbeeld van de TCR- en GFP-kanalen toont en zoek een veld met getransfecteerde cellen.Vanwege intensiteitsverschillen tussen de TCR en GFP moet de schaling van de beelden mogelijk in realtime worden aangepast, zodat cellen in beide kanalen kunnen worden gevisualiseerd. Bevestig, zoals hier het geval is, de turf-illuminatie door het glasvlak scherp te stellen om eventuele laterale membraankleuring te detecteren. Als de laterale membranen niet scherp worden gesteld, is de turf-uitlijning correct.In deze live preview is de laterale membraankleuring zichtbaar, zowel in het vlak van het dekglas als wanneer het dekglas uit focus wordt gebracht om de microscoop in een goede turf-uitlijning te brengen. De hoek van de laser ten opzichte van het objectief wordt vergroot en het laterale membraan raakt uit focus. Begin met het vastleggen van individuele beelden en time-lapse-sequenties met een interval van 10 seconden.Gedurende vijf minuten werden de cellen geïncubeerd op door glas ondersteunde INTA-bilagen die bestonden uit zes moleculen per vierkante micrometer peptide geladen hist-getagd IEFK, 100 moleculen per vierkante micrometer Alexa 647-geconjugeerde hist-getagde ICAM-1 en 100 moleculen per vierkante micrometer GPI-verankerde CD80. Dual-channel simultane acquisitie TIRF-microscopie werd uitgevoerd in de continue aanwezigheid van Alexa 546-geconjugeerde H57 FAB-fragmenten.Om de TCR te kleuren, werden de cellen tot één uur na het eerste contact met de dubbellaag afgebeeld. Het aantal ZAP 70-clusters per cel werd geanalyseerd met behulp van geautomatiseerde software voor het tellen van clusters. In elk geval werden ten minste 40 cellen geanalyseerd.De geladen peptiden worden aangegeven in het inzetsel. ICAM one verwijst naar cellen op bilaayen die 100 moleculen per vierkante micrometer Alexa 6 4 7 geconjugeerd His-tagged ICAM one bevatten, zoals getoond in de figuur. Zap 70-afhankelijke signalering vindt plaats in TCR-microclusters en uitsluitend als reactie op agonisten-liganden, zoals te zien is in deze video, opgenomen met 10 seconden per frame.TCR-signalering in reactie op agonistische peptiden wordt in stand gehouden door de continue generatie van TCR-microclusters in de periferie van het contactgebied die ZAP 70 rekruteren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe primaire T-cellen getransfecteerd kunnen worden met behulp van maxa nucleaire affectietechnologie en hoe de rekrutering van GFPT-signaleringsmoleculen naar TCR-microclusters correct kan worden afgebeeld met turf-microscopie. Zodra deze techniek beheerst is, kan deze in zeven uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zeer voorzichtig om te gaan met de primaire cellen. Hoe gezonder de cellen in elke stap van het experiment zijn, hoe hoger de transfectie-efficiëntie zal zijn en hoe meer cellen u zult vastleggen in uw beeldvorming. T-cellen zijn zeer beweeglijk en als gevolg hiervan zorgt sequentiële beeldvorming van het TCR- en GFP-kanaal ervoor dat de twee beelden niet perfect uitlijnen door de beweging van TCR-microclusters en cellen.Om dit probleem op te lossen, hebben we de dual channel simultaneous acquisition turf microscope ontwikkeld.

a-tirf-microscopy-technique-for-real-time-simultaneous-imaging-tcr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie is een krachtige aanpak van de structuren te observeren in de buurt van het celoppervlak bij hoge contrast en temporele resolutie. We laten zien hoe TIRF kan worden gebruikt om eiwitten dynamiek te studeren aan de cortex van de celwand-ingesloten bacteriën en schimmels cellen.

Visualisatie van Cortex Organisatie en Dynamiek in Micro-organismen, met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

This video describes TIRF, a total internal reflection microscopy-based technique to visualize actin and microtubule polymerization dynamics. The method allows the high-resolution imaging of actin and microtubule coupling dynamics in real-time, which is essential for understanding cellular crosstalks.

TIRF Microscopy to Visualize Actin and Microtubule Coupling Dynamics

Source: Daniele, F., et. al TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the imaging of human neuroblastoma cells using a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope to visualize fluorophore-tagged synaptic vesicles. The cells are first focused in epifluorescence mode. Adjustments are then made to achieve total internal reflection,...

Cell Imaging Using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

We beschrijven een live-cell imaging methode die inzicht geeft in eiwitdynamica tijdens de T-cel activatie proces. We tonen de totale gebruiksduur van de T-cel verspreiding assay, confocale microscopie en beeldanalyse te geven kwantitatieve resultaten volgen signalering complexvorming in T-cel activatie.

Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Clathrine-gemedieerde endocytose, een snel en zeer dynamisch proces, internaliseert veel eiwitten, inclusief signaalreceptoren. Het hier beschreven protocol visualiseert direct de kinetiek van individuele endocytische gebeurtenissen. Dit is essentieel om te begrijpen hoe kernleden van de endocytische machinerie met elkaar coördineren en hoe eiwitlading dit proces beïnvloedt.

Visualiseren Clathrine-gemedieerde endocytose van G-proteïne gekoppelde receptoren bij Single-event resolutie via TIRF Microscopie

Dit manuscript beschrijft hoe (enkele molecuul) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-gebaseerde assays uit te voeren om de bindingsdynamiek tussen T-cel antigeen receptor (TCR) en antigeen peptide-geladen MHC-moleculen te meten zoals ze optreden binnen de immunologische synaps van een T-cel in contact met een gefunctionaliseerde planaire ondersteunde lipide bilayer.

Het meten van TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Met een FRET-gebaseerde Microscopie Assay

Labelen van de extracellulaire domein van een membraaneiwit met een pH-gevoelige fluorofoor, superecliptic pHluorin (SEP), maakt lokalisatie, expressie en mensenhandel worden bepaald. Imaging september-gemerkte eiwitten met totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) maakt de kwantificering van eiwitniveaus in de perifere ER en plasmamembraan.

Gebruik makend van pHluorin-gelabeld receptoren Monitor subcellulaire lokalisatie en handel

Hier wordt een op TIRF-microscopie gebaseerde in vitro reconstitutietest gepresenteerd om tegelijkertijd de dynamiek van twee microtubulipopulaties te kwantificeren en te vergelijken. Er wordt een methode beschreven om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere microtubule-geassocieerde eiwitten op verknoopte microtubulibundels en enkele microtubuli te bekijken.

Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie

We presenteren een protocol voor het implementeren van interferentie-reflectiemicroscopie en totaal-interne-reflectie-fluorescentiemicroscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en fluorescerend gelabelde microtubuli-geassocieerde eiwitten.

Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Dit protocol is een gids voor het visualiseren van dynamische actine en microtubuli met behulp van een in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopie assay.

Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Leer TIRF-microscopie voor real-time beeldvorming van T-celreceptorsignalering met GFP-gelabelde ZAP-70 in muizen-T-cellen. Deze methode maakt simultane detectie van signaalcomplexen mogelijk.

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

Meer video's verkennen