Name: Een stap-voor-stap methode voor de Reconstructie van een ABC-transporter in nanodisc lipide deeltjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Leer de reconstructie van de ABC-transporter MalFGK2 in nanodiscs voor membraanproteïne-studies. Deze methode combineert scaffold-eiwitten, lipiden en detergenten voor stabiele, oplosbare deeltjes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institute of Health Research. CSC werd gefinancierd door een postdoctoraal fellowship van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada. FD is een Tier II Canada Research Chair.

<html> Algemeen Reconstitutie Proces De reconstitutie proces begint met het mengen van het membraan scaffold proteïne (MSP) met het gezuiverde MalFGK 2 complex in de aanwezigheid van detergens-gesolubiliseerde fosfolipiden. De stap wordt gevolgd door de langzame verwijdering van het detergens door een adsorberend polystyreen materiaal genaamd Bio-Beads of Amberlite (figuur 1). De auto-assemblageproces komt meest waarschijnlijk door de apolaire interacties tussen de hydrofobe fosfolipiden, de MalFGK 2 complex en het oppervlak van de MSP amfipatische eiwit. Het eindproduct is een schijfvormige deeltjes uit twee moleculen MSP wikkelen rond de MalFGK 2 complex. De deeltjes worden gescheiden van de adducten en aggregaten door ultra-centrifugatie en analytische size-exclusion chromatografie. De deeltjes worden gekenmerkt door natieve gelelektroforese en dynamische lichtverstrooiing spectroscopie. titel &quot;&gt; 1. Voorbereiding van de membraan steiger Protein, MSP <ol><li> De his-gelabeld MSP (versie MSP1D1 1) wordt geproduceerd uit plasmide in E. pMSP1D1 coli BL21 (DE3) geïnduceerd bij OD600 ~ 0,5 met 0,5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside gedurende 3 uur bij 37 ° C. </li><li> De cellen worden geoogst door centrifugatie bij 5000 g gedurende 10 min bij 4 ° C en geresuspendeerd in TSG10 buffer die 100 uM phenylmethanesulfonyl fluoride. </li><li> De cellen worden gelyseerd met een Franse pers (3x) bij 8.000 psi en het onoplosbare materiaal wordt verwijderd door centrifugeren bij 5000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. De oplosbare fractie die het MSP geïsoleerd door ultra-centrifugatie bij 125.000 xg gedurende 45 minuten. </li><li> Het MSP wordt gezuiverd door nikkel-chelerende chromatografie met ~ 1,5 ml Ni Sepharose HP in TSG10 buffer. Verontreinigingen worden weggespoeld met TSG10 buffer die 50 mM imidazool. Het MSP wordt geëlueerd met TSG10 buffer bevattende 600 mMimidazool. Het gezuiverde eiwit wordt gedialyseerd in TSG10 buffer en opgeslagen in -70 ° C bij een eiwitconcentratie van ~ 10-15 mg / ml. </li></ol> 2. Voorbereiding van de MalFGK 2 Complex <ol><li> De MalFGK 2 complex, his-tag aan de C-terminus van MÄLK, uitgedrukt uit plasmide pBAD22-FGK in E. coli BL21 (DE3) en geïnduceerd bij OD 600 ~ 0,5 met 0,2% L-arabinose gedurende 3 uur bij 37 ° C. </li><li> Na cellysis en centrifugeren zoals in stap 1.3, wordt het membraan pellet geresuspendeerd in TSG20 buffer bij een eindconcentratie van 5 mg / ml. Het materiaal wordt opgelost met 1% w / v n-dodecyl-β-maltopyranoside (DDM) gedurende 3 uur bij 4 ° C onder zachtjes schudden. </li><li> Het onoplosbare materiaal wordt verwijderd door ultra-centrifugatie zoals in stap 1.3 en de supernatant met het opgeloste MalFGK 2 complex wordt verzameld en gezuiverd zoals in stap 1.4, zonder dialyse. </li><li> Further zuivering wordt bereikt door gelfiltratiechromatografie in TSGD buffer op een Superdex 200 HR 10/300 kolom met een stroomsnelheid van 0,5 ml / min. </li></ol> 3. Bereiding van Fosfolipiden <ol><li> Een E. coli totale lipide extract opgelost in chloroform wordt gescheiden in 1000 nmol porties in schroefdop microcentrifugebuizen. Het oplosmiddel wordt verdampt onder een zachte stikstofstroom en vervolgens een nacht gedroogd in een vacuüm exsiccator. </li><li> De lipidefilm werd opgelost in TS buffer bij 5 nM eindconcentratie en gevortext krachtig en gesoniceerd. De opgeloste lipiden ziet er iets ondoorzichtige vanwege hun algemene onoplosbaarheid in water TS buffer, maar blijven in suspensie. DDM wordt toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5% (~ 10 mM), waarbij de oplossing helder wordt. </li><li> Het lipidemengsel wordt in een waterbad en pulse gesonificeerd 5 keer ~ 5 sec. Het lipidemengsel wordt opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week. </li></ol> 4. Voorbereiding van Bio-Beads <ol><li> Ongeveer 10-15 ml (droog volume) Bio-Beads is geplaatst in een 50 ml buis. </li><li> De kralen worden achtereenvolgens gewassen met 50 ml 100% methanol, 95% ethanol, milliQ H 2 O en tenslotte TS buffer (tweemaal elk). </li><li> De gewassen korrels werden bewaard bij 4 ° C in ongeveer 10 ml TS buffer. </li></ol> 5. Nanodisc Reconstitutie <ol><li> Het MSP wordt verdund in buffer TSGD de eindconcentratie van ~ 7 mg / ml (~ 0,3 mM). </li><li> ~ 2 nmol gezuiverd MalFGK 2 complex worden gemengd bij een eiwit: MSP: lipide-verhouding van 1:3:60 of 1:3:400 in TSGD buffer. De eindconcentratie is 6 uM MalFGK 2, 18 uM MSP en 360 uM lipiden (1:3:60) of 2,4 mM lipiden (1:3:400). Het eindvolume is 300 pl. De uiteindelijke concentratie DDM 0,08% (~ 1,6 mM). De eindconcentratie van glycerol afhankelijk van de hoeveelheid lipide toegevoegd maar blijft ongeveer 5-10% v / v. </li&gt; <li> ~ 50 pi Bio-Bead suspensie wordt aangebracht op de buis en het mengsel wordt een nacht geïncubeerd op een schommelende tafel bij 4 ° C. </li><li> De kralen worden gesedimenteerd door zwaartekracht en de oplossing wordt gepipetteerd door een smalle punt zoveel Bio-Beads vermijden mogelijk. </li><li> Grote precipitaten worden verwijderd door ultra-centrifugatie bij 100.000 xg gedurende 20 minuten. De schijven worden gezuiverd door gelfiltratiechromatografie zoals in stap 2.4 in TSG10 buffer. Fracties die de schijven worden samengevoegd en een monster opnieuw worden geïnjecteerd op dezelfde gelfiltratiekolom de stabiliteit van het prepareren. </li><li> De gezuiverde schijven kunnen bij -70 ° C gedurende langere tijd. Na ontdooien op ijs, moet de schijven worden onderworpen aan ultra-centrifugeren zoals in stap 5,5 tot verwijdering van potentiële neerslaat. Een aliquot wordt geanalyseerd door gelfiltratiechromatografie opdat significante aggregatie of precipitatie niet tijdens het ontdooienproces. </li></ol> 6. Inheemse Gel Elektroforese <ol><li> 1 uM nanodiscs (-0,2 mg / ml) worden geanalyseerd door natieve PAGE 6, 7 (Tris-HCl pH 8,8, 4-12%) de kwaliteit van de reconstitutie (figuur 3A) te beoordelen. </li><li> De binding van MalE (1 uM) aan de MalFGK 2-complex opgelost in nanodiscs wordt ook beoordeeld via natieve-PAGE (Figuur 3A). </li><li> Na elektroforese wordt de gel gekleurd met Coomassie blauw gedurende 10 minuten, en ontkleurd voor ~ 1 uur. </li></ol> 7. Dynamic Light Scattering (DLS) <ol><li> Nanodiscs worden gezuiverd door gelfiltratiechromatografie zoals in stap 2.4 in TSG10 buffer met een Superdex 200 HR 10/300 kolom met een stroomsnelheid van 0,1 ml / min. Fracties die nanodiscs worden samengevoegd en geconcentreerd tot ~ 10 mg / ml met een Amicon centrifugaal filter. </li><li> Het monster wordt twee keer gefilterd (0,22 urn filter) vóór analyse met behulp DLSeen Dynapro nanostar instrument (Wyatt Technology) in een 1 ul inwendig volume quartz cuvette. Gegevens worden bevestigd met de DYNAMICS software (Wyatt Technology) de diameter en het molecuulgewicht van de deeltjes schatten. </li></ol> 8. ATPase Afmetingen <ol><li> De ATPase-activiteit van MalFGK 2-gereconstitueerde nanodiscs wordt bepaald met een colorimetrische assay 8. </li><li> 1 uM gezuiverd discs en 1 mM ATP gemengd met toenemende hoeveelheden MalE en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 20 minuten. De vrijgave van anorganisch fosfaat wordt gemeten bij 660 nm. </li><li> De hoeveelheid afgegeven fosfaat vergeleken met een standaardcurve gegenereerd met een fosfor standaardoplossing. </li></ol> 9. Representatieve resultaten De nanodiscs worden gezuiverd door gelfiltratiechromatografie (Figuur 2A links). Het chromatogram toont aan dat de meerderheid van de gereconstitueerde dISC (zwarte trace) elueren als een enkele piek, terwijl schijven gemaakt met overmaat lipiden (rood spoor) elueren in het lege volume en als een reeks van brede pieken. De kwaliteit van de nanodiscs wordt verder geanalyseerd door natieve gelelektroforese en dynamische lichtverstrooiing spectroscopie (DLS). Goed opgeloste discs migreren als een scherpe band op de gel dat de gereconstitueerde in aanwezigheid van een overmaat lipiden migreren als uitstrijkje (Figuur 2A rechts). Analyse door DLS blijkt dat de disc populatie homogeen met een gemiddelde diameter van 11,4 nm (Figuur 2B). De gereconstitueerde schijven hebben een schijnbaar molecuulgewicht van 215 kDa op basis van de onderlinge DLS. Monsters gereconstitueerd in aanwezigheid van overmaat lipiden vertoning wijdverspreid radii ongeveer 100 nm, typisch voor niet-homogene monsters. De kwaliteit van de MalFGK 2 complex wordt bepaald door native gel elektroforese en ATPase activiteit doormetingen (figuur 3). De maltosebindingsproteïne MalE bindt met een hoge affiniteit aan de MalFGK 2 transporter 9, 10. Behulp van niet-denaturerende gelelektroforese, is het mogelijk te detecteren een complex tussen mannelijke en MalFGK 2 (Figuur 3A). Het stimuleren van de MÄLK 2 ATPase activiteit van MalE wordt getoond in figuur 3B. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Typisch stroomschema voor de reconstitutie-protocol. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Kwaliteitscontrole van de nanodisc voorbereiding. A. Gelfiltratie-analyse (Superdex 200 HR 10/300 kolom) van de nanodiscs opgelost bij lage lipide-ratio (1/3/60; zwart spoor) of hoge lipide ratio (1/3/400; rode spoor). Natieve gelelektroforese van dezelfde schijf preparaat. Molecular gewicht markers in kDa zijn aangegeven. B. Dynamische lichtverstrooiing analyse van dezelfde disc voorbereiding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3910/3910fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig3.jpg" alt="Figuur 3"/> Figuur 3. Analyse van de MalFGK 2-nanodisc deeltjes. A. Gel shift analyse van MalE geïncubeerd met toenemende hoeveelheden MalFGK 2-nanodisc deeltjes. B. ATPase activiteit van de MalFGK 2-nanodisc deeltjes als functie van MalE concentratie.

<ol><li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li>
<li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li>
<li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li>
<li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li>
<li>Mi, L. -Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li>
<li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li>
<li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li>
<li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li>
<li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li>
<li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li>
<li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li>
<li>Glück, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li>
<li>Wan, C. -P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+%28BBA%29%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li>
<li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li>
<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochromes+P450+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li>
<li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We beschrijven een eenvoudige procedure voor de reconstructie van de maltose transporter in nanodiscs. De transporteur is ATPase actief en de interactie met de oplosbare bindingspartner MalE opnieuw kunnen worden (figuur 3). De succesvolle reconstructie van de vervoerder in nanodiscs opent de weg voor extra biofysische en biochemische analyse. Van bijzonder belang is de systematische analyse zijn de MÄLK ATPase en maltose transport activiteit in wasmiddel, liposoom en nanodiscs. ABC-transporters wijzige...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 50K centrifugaalfilter </td><td> Millipore </td><td> UFC805008 </td><td> Volg de fabrikant protocol voor een juist gebruik </td></tr><tr><td> Bio-Beads SM-2 Adsorbens </td><td> Bio-Rad </td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> E. coli totale lipiden </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 100500C </td><td> Opgelost in chloroform, behandelen als geschikt voor een organisch oplosmiddel </td></tr><tr><td> Ni sepharose hars HP </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfor standaardoplossing </td><td>Sigma-Aldrich </td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20061 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 10/300 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel I. specifieke reagentia. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Samenstelling </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> DDM voorraad </td><td> 10% w / v DDM </td><td> Resuspendeer in milliQ water en bewaar bij -20 ° C </td></tr><tr><td> MalFGK 2 stock </td><td> 1-2 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glycerol 0,03% w / v DDM </td><td> Bewaren bij -70 ° C na zuivering </td></tr><tr><td> MSP voorraad </td><td> 10-15 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glycerol </td><td> Bewaren bij -70 ° C na zuivering in &lt;1 ml aliquots en voorkomen vries / dooi cycli </td></tr><tr><td> Fosfolipide voorraad </td><td> 5 nM E. coli totaal lipiden 0,5% w / v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl </td><td> Bewaar bij 4 ° C gedurende 1 week </td></tr><tr><td> TS buffer </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl </td><td> Bewaar bij 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG10 buffer </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glycerol </td><td> Bewaar bij 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG20 buffer </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 8 100 mM NaCl 20% v / v glycerol </td><td> Bewaar bij 4 ° C </td></tr><tr><td> TSGD buffer </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glycerol 0,03% w / v DDM </td><td> Bewaar bij 4 ° C en voeg DDM vlak voor gebruik </td></tr><tr><td colspan="3"> Tabel II. Solution recepten. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

een stap-voor-stap methode voor de reconstructie van een abc-transporter in nanodisc lipide deeltjes

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

De nanodisc is een schijfvormige deeltje (~ 10 tot 12 nm groot) die val membraaneiwitten in een klein stukje van de fosfolipide dubbellaag. De nanodisc is zeer aantrekkelijk voor het bestuderen membraaneiwitten, met name in de context van ligand-receptor interacties. De methode ontwikkeld door Sligar en collega&#39;s is gebaseerd op de amfipatische eigenschappen van een sterk ontwikkelde a-helix scaffold eiwitten die afkomstig apolipoproteïne A1. De hydrofobe oppervlakken van de scaffold proteïne interactie met de vetacylgroepen zijketens van de lipide dubbellaag terwijl de poolgebieden maken het waterige milieu. Analyses van membraaneiwitten in nanodiscs duidelijk voordelen bieden liposoom omdat de deeltjes klein, homogeen en water oplosbaar. Bovendien kunnen biochemische en biofysische methoden gewoonlijk gereserveerd oplosbare eiwitten worden toegepast en aan beide zijden van het membraan. In deze visuele protocol we een stap-voor-stap reconstitutie van een goed tekensgekarakteriseerd bacteriële ABC transporter, de man-MalFGK 2 complex. De vorming van de schijf een zelf-assemblage proces dat afhangt van hydrofobe interacties die plaatsvinden tijdens de geleidelijke verwijdering van het detergens. We beschrijven de essentiële stappen en we wijzen op het belang van het kiezen van een juiste eiwit-lipide naar verhouding om de vorming van aggregaten en grotere polydisperse liposoom-achtige deeltjes te beperken. Eenvoudige kwaliteitscontroles zoals gelfiltratiechromatografie, native gel elektroforese en dynamische lichtverstrooiing spectroscopie ervoor dat de schijven correct zijn opgelost.

Nanodiscs zijn kleine discoïde deeltjes die membraaneiwitten te nemen in een klein stukje van de fosfolipide dubbellaag. We een visuele protocol dat de stap-voor-stap opname van de MalFGK2 transporter in een schijf toont.

Een stap-voor-stap methode voor de Reconstructie van een ABC-transporter in nanodisc lipide deeltjes

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Het algemene doel van deze procedure is om een A, b, C-transporter, in dit geval de maltose-transporter malf GK twee, te incorporeren in oplosbare membraan-nanodiskdeeltjes. Dit wordt bereikt door eerst het membraansteuneiwit MSP te mengen met de transporter en de juiste hoeveelheid lipiden in detergentmicellen.De tweede stap is het toevoegen van polystyreenbolletjes en het mengsel gedurende de nacht voorzichtig te schudden; het detergent wordt geleidelijk door de bolletjes geabsorbeerd, waardoor de nanodisk-deeltjes kunnen worden gevormd. Vervolgens worden de bolletjes door sedimentatie verwijderd. De laatste stap is het scheiden van de correct gevormde disks van aggregaten en niet-geassembleerde steunproteïnen middels gelfiltratiechromatografie.Ten slotte wordt de kwaliteit van de discs beoordeeld via native gelelektroforese of lichtverstrooiingsspectroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals liposomen, is dat membraanproteïnen en discs volledig oplosbaar zijn in een waterige oplossing. Bovendien zijn de proteïnedomeinen nu van beide zijden toegankelijk.Aangezien er nu geen membraancompartiment meer is, was ik in staat om, door gebruik te maken van membraansteunproteïnen van verschillende lengtes, de verschillende ligandenstaten van membraaneiwitten vast te leggen en te bestuderen. Belangrijker nog is dat deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de membraanproteomica, zoals de identificatie van nieuwe bindingspartners van a, b, C-transporters. In feite reiken de implicaties van deze techniek verder tot in de therapie, omdat het kan bijdragen aan de ontdekking van activatoren of inhibitoren van membraaneiwitten en receptoren.Hoewel deze methode eenvoudig lijkt, moet men voorzichtig zijn bij het kiezen van de juiste eiwit-lipidenverhouding. Over het algemeen hebben mensen die nieuw zijn met deze methode moeite met het berekenen van de juiste molaire verhouding of het uitvoeren van de juiste controle om de kwaliteit van de preparatie te waarborgen. Daarom is een visuele demonstratie van deze methode zeer nuttig voor een nieuwe student om de verschillende stappen en potentiële moeilijkheden te leren.Om hexa-histidine-getagd MSP te kweken in e coli-stam BL 21 DE3 vanuit het plasmide P MSSP 1D1, wordt de eiwitproductie geïnduceerd wanneer de gemeten optische dichtheid bij 600 nanometer ongeveer 0,5 is, gedurende drie uur bij 37 °C. Oogst de cellen door centrifugatie bij 5.000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Resuspendeer het pellet in TSG 10-buffer bevattend 100 µM PMSF. Lyseer de cellen drie keer met een French press bij 8.000 psi. Verwijder het onoplosbare materiaal door centrifugatie bij 5.000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Isoleer vervolgens de oplosbare fractie die de MSP bevat door ultracentrifugatie bij 125.000 ×g gedurende 45 minuten.Zuiver het MSP door middel van nikkelchelaatchromatografie met gebruik van ongeveer 1,5 milliliter nickel seros high performance in TSG 10 buffer. Was de verontreinigingen weg met TSG 10 buffer met 50 millimolaire ILE elute. Elueer het MSP met TSG 10 buffer met 600 millimolaire I midaz na dialyse.Het gezuiverde eiwit in TSG 10 buffer MSP kan worden bewaard bij -70 °C met een eiwitconcentratie van ongeveer 10 tot 15 mg/mL. Het MALF GK 2-complex, met een his-tag aan de C-terminus van MAL K, wordt tot expressie gebracht vanuit plasmide PED 22 FG K, gekweekt in E. coli-stam BL 21 DE 3. De eiwitproductie wordt geïnduceerd wanneer de gemeten optische dichtheid bij 600 nm ongeveer 0,5 is, met 0,2% L-arabinose gedurende drie uur bij 37 °C, gevolgd door cellyse en centrifugatie.Zoals voorheen suspenderen we het membraanpellet in TSG 20-buffer tot een uiteindelijke concentratie van 5 mg/mL. Solubiliseer het materiaal vervolgens met 1% w/v GDM gedurende drie uur bij 4 °C onder zachte schudding. Verwijder het onoplosbare materiaal door ultracentrifugatie, zoals beschreven voor de zuivering van MAL FTK twee.Verzamel vervolgens de supernatant die het gesolubiliseerde mal FTK two complex bevat en zuiver dit opnieuw met nikkelchelaatchromatografie. Zuiver het complex verder door gelfiltratiechromatografie in TSGD-buffer op een SUEx 200, HR ten driehonderd kolom bij een stroomsnelheid van 0,5 milliliters per minuut. Om fosfolipiden voor te bereiden, wordt een totaal lipidenextract van e coli opgelost in chloroform verdeeld in 1000 anomal aliquots in microcentrifugebuisjes met schroefdop; laat het oplosmiddel verdampen onder een zachte stroom stikstof en droog verder uit gedurende de nacht in vacuüm.Droog vervolgens het monster, los de lipidefilm op in TS-buffer met een eindconcentratie van vijf NMO, vortex krachtig en pas daarna vijf keer een puls-sonicatie van ongeveer vijf seconden toe. De opgeloste lipiden zullen er licht opaak uitzien vanwege hun algemene onoplosbaarheid in waterige TS-buffer, maar ze moeten in suspensie blijven. Voeg DDM toe tot een eindconcentratie van 0,5%. Op dit punt zal de oplossing helder worden; plaats het lipidenmengsel in een waterbad en pas vijf keer een puls-sonicatie van ongeveer vijf seconden toe.Het lipidemengsel kan maximaal één week worden bewaard bij vier graden Celsius. Om de bio-beads voor te bereiden, plaatst u ongeveer 10 tot 15 milliliter bio-beads in een buis van 50 milliliter. Was de beads eerst met 50 milliliter 100% methanol.Laat de beads bezinken door zwaartekracht en schenk vervolgens voorzichtig de oplossing af. Herhaal dit proces één keer met methanol, daarna twee keer met 95%Ethanol en milli Q water, en tot slot met TS-buffer. Begin de nanodiscrete constitutie door MSP te verdunnen in TSGD-buffer tot een eindconcentratie van ongeveer zeven milligram per milliliter of 0,3 millimolar.Om een succesvol experiment te waarborgen, is het belangrijk om de juiste verhoudingen van lipiden en proteïnen te kiezen die met elkaar gemengd worden. Meng ongeveer twee M gezuiverd malf GK twee complex in een proteïne-te-MS P-te-lipide verhouding van 1:3:60 in TSGD-buffer voor een eindvolume van 300 µL. Hier wordt ook een monster met een overschot aan lipiden in de verhouding 1:3:400 klaargemaakt als negatieve controle. Voeg 50 µL bio-bead suspensie toe aan de buis en incubeer het mengsel overnacht op een schudtafel bij 4 °C. Laat de beads de volgende dag door zwaartekracht bezinken. Zodra de beads zijn neergeslagen, wordt de oplossing via een smalle tip gepipetteerd om zoveel mogelijk bio-beads te vermijden.Verwijder grote neerslagen door middel van ultracentrifugatie bij 100, 000 GS gedurende 20 minuten. Ga verder met het zuiveren van de schijven via gelfiltratiechromatografie, zoals eerder uitgevoerd in TSG 10-buffer. Injecteer vervolgens een Eloqua op dezelfde gelfiltratiekolom om de stabiliteit van de preparatie te testen.Voeg vervolgens de fracties die de discs bevatten samen. De kwaliteit van de preparatie wordt beoordeeld via native gel-elektroforese. Analyseer één micromolaire nanodiscs om de kwaliteit van de reconstitutie te beoordelen.Beoordeel daarnaast de binding van mal E aan het mal ftk twee-complex dat is gereconstitueerd in nanodiscs. Kleur de gel na elektroforese 10 minuten met kumasi blue en ontkleur deze gedurende ongeveer één uur. Om dynamische lichtverstrooiing of DLS uit te voeren, moeten de nanodiscs eerst worden gezuiverd via gelfiltratiechromatografie zoals voorheen, met gebruik van een SUEx 200 HR ten driehonderd-kolom bij een stroomsnelheid van 0,1 milliliters per minuut.Verzamel de fracties die nanodiscs bevatten en concentreer deze tot ongeveer 10 mg/ml met een AmCon centrifugaalfilter. Filtreer het monster vervolgens twee keer. Voer de analyse uit via DLS met een dynapro nano star-instrument in een kwartsvet met een intern volume van 1 µL.Gebruik de dynamische software om de diameter en het molecuulgewicht van de deeltjes te schatten en bepaal de activiteit van ATPase van mal FTK twee gereconstitueerde nanodiscs met behulp van een cholestrische assay. Meng eerst één micromolar gezuiverde discs en één millimolar ATP met toenemende hoeveelheden mal e. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 37 °C.Meet vervolgens de afgifte van anorganisch fosfaat bij 660 nanometer. Vergelijk de hoeveelheid vrijgekomen fosfaat met een standaardcurve die is gegenereerd met een fosforstandaardoplossing. De nanodiscs worden gezuiverd middels gelfiltratiechromatografie.Het chromatogram laat zien dat de meeste gereconstitueerde discs elueren als één enkele piek, terwijl discs gemaakt met een overschot aan lipiden elueren in het dode volume en als een reeks brede pieken. De kwaliteit van de disc-preparatie wordt verder geanalyseerd met native gelelektroforese; discs die zijn gereconstitueerd met een beperkte hoeveelheid lipiden migreren als een scherpe band op de native gel, terwijl discs die zijn gereconstitueerd in aanwezigheid van een overschot aan lipiden als vegen migreren. Analyse via DLS laat zien dat de disc-populatie homogeen is met een gemiddelde straal van 5,0 nanometers. Op basis van de DLS-benadering hebben de gereconstitueerde discs een schijnbaar molecuulgewicht van 215 kilodaltons. Monsters die zijn gereconstitueerd in aanwezigheid van een overschot aan lipiden vertonen breed verdeelde stralen rond de 100 nanometers, wat typisch is voor niet-homogene monsters.De activiteit van het MAL FTK twee-complex wordt beoordeeld door de snelheid van een TP-hydrolyse te meten en de affiniteit voor interactiepartners zoals het maltose-bindende eiwit, MAL E, het maltose-bindende eiwit. MAL E bindt met een hoge affiniteit aan de MAL FTK twee-transporter met behulp van niet-denaturerende gelelektroforese. Het is mogelijk om een complex tussen MAL E en MAL ftk twee te detecteren; de stimulatie van de MAL KA TPA-activiteit door MAL E wordt hier weergegeven als een functie van de MAL e-concentratie.Het maken van de nanodiscs is relatief eenvoudig, maar kleine afwijkingen van de optimale condities kunnen leiden tot onomkeerbare eiwitaggregatie. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in minder dan twee dagen worden uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de juiste eiwit-lipideverhouding, aangezien een overschot aan lipiden zal leiden tot de productie van grote polydisperse liposoomachtige deeltjes. Het is daarom cruciaal om de kwaliteit van het gereconstitueerde materiaal zorgvuldig te analyseren met technieken anders dan gelfiltratie, zoals lichtverstrooiingsspectroscopie, analytische ultracentrifugatie of, eenvoudiger, native gelelektroforese.Onthoud dat zowel het type fosfolipide dat in de disc wordt opgenomen als het membraansteunprotein kunnen bijdragen aan de efficiëntie van de reconstitutie. Na het bekijken van deze video hopen we dat u een goed inzicht heeft gekregen in hoe u oplosbare en homogene nanodiscs kunt genereren die uw gekozen membraaneiwit bevatten. Veel succes met uw experimenten.

a-step-step-method-for-reconstitution-an-abc-transporter-into

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Procedures voor volledige reconstructie van een prototype voltage-gated kalium kanaal in lipide membranen beschreven. De gereconstitueerde kanalen zijn geschikt voor biochemische assays, elektrische opnamen ligand screening en elektronenmicroscopie kristallografische studies. Deze methoden kunnen hebben algemene toepassingen om de structurele en functionele studies van andere membraaneiwitten.

Reconstructie van een Kv kanaal in Lipid Membranen voor structurele en functionele studies

Veel eiwitten voeren hun functie uit wanneer ze aan membraanoppervlakken zijn gehecht. De binding van extrinsieke eiwitten op nanodisc-membranen kan indirect worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat de karakteristieke stapelvorming (rouleau) van nanodiscs, veroorzaakt door de negatieve kleuring natriumfosfowolframaat, wordt voorkomen door de binding van extrinsiek eiwit.

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Solid-ondersteund, eiwit-vrij, dubbele fosfolipide dubbelgelaagde membranen (DLBM) kunnen worden omgezet in complexe en dynamische lipide nanobuis netwerken en kunnen dienen als 2D onderop modellen van het endoplasmatisch reticulum.

Spontane vorming en omlegging van kunstmatige lipide nanobuis netwerken als een Bottom-Up-Model voor endoplasmatisch Reticulum

Mitochondriale fusie is een belangrijke homeostatische reactie die ten grondslag ligt aan mitochondriale dynamiek. Hier beschreven is een in vitro reconstitution systeem om mitochondriale binnenmembraan fusie die membraan tethering, docking, hemifusion, en porie opening kan oplossen. De veelzijdigheid van deze aanpak bij het verkennen van celmembraansystemen wordt besproken.

Een modelmembraanplatform voor het reconstrueren van mitochondriale membraandynamica

Co-translationele insertie in voorgevormde nanodiscs maakt het mogelijk om celvrije gesynthetiseerde membraaneiwitten te bestuderen in gedefinieerde lipideomgevingen zonder contact met detergentia. Dit protocol beschrijft de voorbereiding van essentiële systeemcomponenten en de kritieke parameters voor het verbeteren van de expressie-efficiëntie en monsterkwaliteit.

Co-translationele insertie van membraaneiwitten in voorgevormde nanodiscs

Dit protocol beschrijft de vorming van ondersteunde lipide bilayers en de toevoeging van cytoskeletale filamenten en motoreiwitten om de dynamiek van gereconstitueerde, membraangebonden cytoskeletale netwerken te bestuderen met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Reconstitutie van membraangebonden minimale actinecorticosterces op ondersteunde lipidebilagen

In dit manuscript demonstreren we de experimentele technieken om het F-actinecytoskelet in te kapselen in gigantische unilamellaire lipideblaasjes (ook wel liposomen genoemd), en de methode om een cortex-biomimicking F-actinelaag te vormen aan de binnenste folder van het liposoommembraan.

In vitro Reconstitutie van het Actin Cytoskelet Inside Giant Unilamellar Vesicles

Hier beschrijven we de productie en karakterisering van bioactieve stoffen die nanoschijven bevatten. Amfotericine B nanoschijven worden als voorbeeld genomen om het protocol stapsgewijs te beschrijven.

Formulering en karakterisering van bioactieve stof die nanoschijven bevat

Dit protocol beschrijft een opstelling voor de kristallisatie van de steroltransporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 wordt gereconstitueerd tot bicelles voor kristallisatie met hangende druppels. Het protocol vereist geen gespecialiseerde materialen of substraten, waardoor het toegankelijk en gemakkelijk aan te passen is in elk laboratorium voor het bepalen van de eiwitstructuur door middel van röntgenkristallografie.

ABCG5/G8-kristallisatie in een lipidenbicelle-omgeving voor röntgenkristallografie

We presenteren een protocol voor het reconstitueren van membraaneiwitten en het inkapselen van enzymen en andere in water oplosbare componenten in lipideblaasjes van submicrometer en micrometer grootte.

Constructie van metabolische netwerken uit evenwicht in blaasjes ter grootte van nano- en micrometer

Deze studie beschrijft de procedure voor het reconstitueren van het membraaneiwit TWIK-gerelateerd zuurgevoelig K+ -kanaal 2 (Task2) in nanodiscs. De succesvolle assemblage werd bevestigd door single-particle cryo-elektronenmicroscopie, die goed gedefinieerde tweedimensionale klassegemiddelden opleverde.

Een techniek voor het stabiliseren van membraaneiwitten in nanodiscs

Leer de reconstructie van de ABC-transporter MalFGK2 in nanodiscs voor membraanproteïne-studies. Deze methode combineert scaffold-eiwitten, lipiden en detergenten voor stabiele, oplosbare deeltjes.

Een stap-voor-stap methode voor de Reconstructie van een ABC-transporter in nanodisc lipide deeltjes

Meer video's verkennen