Een stap-voor-stap methode voor de Reconstructie van een ABC-transporter in nanodisc lipide deeltjes
31 augustus 2012
Nanodiscs zijn kleine discoïde deeltjes die membraaneiwitten te nemen in een klein stukje van de fosfolipide dubbellaag. We een visuele protocol dat de stap-voor-stap opname van de MalFGK2 transporter in een schijf toont.
Het algemene doel van deze procedure is om een A, b, C-transporter te integreren. In dit geval de maltose-transporter malf GK twee in oplosbare membraan-nano-schijfdeeltjes. Dit wordt bereikt door eerst de membraaneiwitschaal MSP, met de transporter en de juiste hoeveelheid lipiden in detergent mycellen te mengen.
De tweede stap is om polystyreenkralen toe te voegen en de mix gedurende de nacht voorzichtig te laten schudden, het detergent wordt geleidelijk opgenomen in de kralen, waardoor de vorming van de nano-schijfdeeltjes mogelijk wordt. Vervolgens worden de kralen verwijderd door sedimentatie. De laatste stap is om de goed gevormde schijven te scheiden van aggregaten en niet-geassembleerde schaalproteïnen door gelfiltratiechromatografie.
Ten slotte wordt de kwaliteit van de schijven beoordeeld door native gelelektroforese of lichtverstrooiingsspectroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven andere methoden zoals liposomen, is dat membraaneiwitten en schijven perfect oplosbaar zijn in een waterige oplossing. Bovendien zijn de eiwitdomeinen nu toegankelijk vanaf beide kanten.
Aangezien er nu geen membraancompartiment meer is. Door membraaneiwitschalen van verschillende lengte te gebruiken, was ik in staat om de verschillende ligamenttoestanden van membraaneiwitten te vangen en te bestuderen. Het belangrijkste is dat deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van membraanproteomics, zoals de identificatie van nieuwe bindingspartners van a, b, C-transporters. In feite reiken de implicaties van deze techniek verder naar therapie omdat het kan helpen bij de ontdekking van activatoren of remmeren van membraaneiwitten en receptoren.
Hoewel deze methode eenvoudig lijkt, moet er voorzichtig worden omgegaan bij het kiezen van de juiste eiwit-lipideverhouding. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen met het berekenen van de juiste malderverhouding of het doen van de juiste controle die de kwaliteit van de voorbereiding waarborgt. Daarom is een visuele demonstratie van deze methode erg nuttig voor een nieuwe student om de verschillende stappen en potentiële moeilijkheden te leren.
Om te beginnen met gro hexa histidine getagde MSP in e coli-stam BL 21 DE drie van de plasmide P MSSP 1D een geïnduceerde eiwitproductie wanneer de gemeten optische dichtheid bij 600 nanometer ongeveer 0,5 is gedurende drie uur bij 37 graden Celsius, de cellen geoogst door centrifugatie bij 5.000 Gs gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Re-suspendeer het pellet in TSG 10-buffer met 100 micromolair PMSF, de cellen breken met een Franse pers drie keer bij 8.000 PS.I verwijder het onoplosbare materiaal door centrifugatie bij 5.000 Gs gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Vervolgens isoleer de oplosbare fractie die de MSP bevat door ultracentrifugatie bij 125.000 Gs gedurende 45 minuten.
Zuiver de MSP door middel van nikkelchelaatchromatografie met behulp van ongeveer 1,5 milliliter nikkel seros hoge prestaties in TSG 10-buffer. Was de verontreinigingen weg met T SG 10-buffer met 50 millimolair ILE elute. De MSP met TSG 10-buffer met 600 millimolair I midaz na dialyse.
Het gezuiverde eiwit in TSG 10-buffer MSP kan worden bewaard bij min 70 graden Celsius en een eiwitconcentratie van ongeveer 10 tot 15 milligram per milliliter. Het MALF GK twee complex, gehistidinet aan het C-uiteinde van MAL K, wordt tot expressie gebracht vanuit plasmide. PED 22 FG K gekweekt in e coli-stam BL 21 DE drie induceer eiwitproductie wanneer de gemeten optische dichtheid bij 600 nanometer ongeveer 0,5 is met 0,2% L Arab voor drie uur bij 37 graden Celsius na cellyse en centrifugatie.
Zoals eerder, we suspenderen de membraanpellet in TSG 20-buffer tot een eindconcentratie van vijf milligram per milliliter. Vervolgens solubiliseer het materiaal met 1% gewicht per volume GDM gedurende drie uur bij vier graden Celsius met voorzichtig schudden. Verwijder het onoplosbare materiaal door ultracentrifugatie zoals voor zuivering van MAL FTK twee.
Verzamel vervolgens het supernatant dat het gesolubiliseerde mal FTK twee complex bevat en zuiver het opnieuw met nikkelchelaatchromatografie. Zuiver het complex verder door middel van gelfiltratiechromatografie in TSGD-buffer op een SUEx 200, HR ten driehonderd kolom met een stromingssnelheid van 0,5 milliliter per minuut. Om fosfolipiden voor te bereiden, wordt een e coli totaal lipide-extract opgelost in chloroform gescheiden in 1000 anomale aliquots in schroefdopmikrofichebuizen. Het oplosmiddel wordt verdampt onder een zachte stroom stikstof en verder gedroogd over nacht in een vacuüm.
Vervolgens wordt het lipidenfilm opgelost in TS-buffer bij vijf NMO eindconcentratie en krachtig gevormd. De opgeloste lipiden zullen er enigszins ondoorzichtig uitzien vanwege hun algemene onoplosbaarheid in waterige TS-buffer, maar ze moeten in suspensie blijven. Voeg DDM toe tot een eindconcentratie van 0,5%. Op dit punt zal de oplossing helder worden, plaats het lipidenmengsel in een waterbad en pulseer het gedurende vijf seconden vijf keer.
Het lipidenmengsel kan maximaal een week bij vier graden Celsius worden bewaard. Om de bio-kralen voor te bereiden, plaatst u ongeveer 10 tot 15 milliliter bio-kralen in een 50 milliliter buis. Was eerst de kralen met 50 milliliter 100% methanol.
Laat de kralen door zwaartekracht bezinken en giet vervolgens de oplossing voorzichtig af. Herhaal het proces eenmaal voor methanol en vervolgens twee keer voor 95% Ethanol milli Q-water en ten slotte TS-buffer. Begin met nanodiscrete constitutie door MSP te verdunnen in TSGD-buffer tot de eindconcentratie van ongeveer zeven milligram per milliliter of 0,3 millimolair.
Om een succesvol experiment te garanderen, is het belangrijk om de juiste verhoudingen van lipiden en eiwitten te kiezen om samen te mengen. Meng ongeveer twee M gezuiverde malf GK twee complex bij een eiwit tot MS P tot lipideverhouding van een tot drie tot 60 in
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol toont de incorporatie van de MalFGK2 transporter in nanodiscs, wat kleine discoïde deeltjes zijn die bestaan uit een fosfolipide dubbellaag. De methode omvat het mengen van membraan scaffold-eiwitten met de transporter en lipiden, gevolgd door een reeks stappen om de nanodiscs te vormen en te zuiveren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Membraanbiologie
- Eiwitengineering
Achtergrond
- Nanodiscs zijn nuttig voor het bestuderen van membraaneiwitten in een gecontroleerde omgeving.
- De MalFGK2 transporter is betrokken bij maltosettransport door membranen.
- Het begrijpen van transporterincorporatie is cruciaal voor functionele studies.
- Deze methode maakt de creatie van stabiele membraaneiwitcomplexen mogelijk.
Doel van studie
- Om een visueel protocol te ontwikkelen voor het incorporeren van membraaneiwitten in nanodiscs.
- Om het bestuderen van membraaneiwitfunctie in een oplosbare omgeving te vergemakkelijken.
- Om een reproduceerbare methode te bieden voor onderzoekers op dit gebied.
Gebruikte methoden
- Mengen van membraan scaffold-eiwit (MSP), transporter en lipiden in detergent micellen.
- Toevoegen van polystyreenkralen en het mengsel overnacht schudden.
- Verwijderen van detergent door sedimentatie van de kralen.
- Scheiding van gevormde discs van aggregaten met behulp van gelfiltratie chromatografie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle incorporatie van de MalFGK2 transporter in nanodiscs.
- Vorming van stabiele nanodisc deeltjes geschikt voor verdere analyse.
- Effectieve scheiding van goed gevormde discs van niet-geassembleerde eiwitten.
- Visuele representatie van het protocol verbetert de reproduceerbaarheid.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van membraaneiwitten.
- Nanodiscs kunnen worden gebruikt voor verschillende biochemische en biofysische studies.
- De methode kan worden aangepast voor andere membraaneiwitten dan MalFGK2.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Reconstituting membrane proteins into nanodiscs enables soluble, homogeneous systems for studying ligand-receptor interactions and transporter function. This approach supports target validation by providing a near-native lipid environment while allowing biochemical and biophysical analyses from both sides of the membrane. It addresses a key discovery-stage challenge: accessing membrane targets in a format compatible with screening and mechanistic de-risking workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of ABC transporters like MalFGK2 in a lipid bilayer that preserves native conformation and dynamics.
- Operational Value: Facilitates binding partner identification, such as maltose binding protein (MalE), through native gel electrophoresis and activity assays.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by allowing ATP hydrolysis measurements and inhibitor/activator screening in a detergent-free, soluble format.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces homogeneous nanodisc populations suitable for downstream applications like ATPase activity assays and binding studies.
- Reproducibility: Relies on controlled protein-to-lipid ratios and quality control via gel filtration, native PAGE, and DLS to ensure batch consistency.
- Screening Compatibility: Generates water-soluble particles that enable high-throughput screening of compounds targeting membrane proteins from either bilayer face.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Nanodisc-reconstituted transporters maintain functionality, enabling preclinical evaluation of compound effects on transport activity.
- Biomarker Alignment: Supports screening for modulators that could serve as translational biomarkers in diseases involving ABC transporter dysfunction.
- Risk-Adjusted Advancement: Quality-controlled discs reduce false positives by eliminating detergent artifacts and aggregate interference in functional readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing a reproducible platform for assessing membrane protein function before preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via ATPase activity assays and binding partner detection using nanodisc-embedded transporters.
- Screening: Enables assay development for compound screening due to solubility, homogeneity, and accessibility of protein domains.
- Analytics: Delivers quantitative outputs such as phosphate release rates and particle size distribution via DLS for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work by preserving transporter function in a lipid environment conducive to mechanism-of-action studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable workflow for multiple membrane proteins beyond MalFGK2, increasing platform utility across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by preserving native-like conformation and enabling bidirectional access to protein domains.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized reconstitution and orthogonal QC methods (gel filtration, native PAGE, DLS).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in membrane protein screening campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through reliable functional data from soluble, homogeneous preparations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in membrane protein purification, lipid handling, and nanodisc assembly principles.
- Depends on access to ultracentrifugation, gel filtration chromatography, and DLS or native PAGE for quality control.
- Necessitates cross-team standardization of protein-to-lipid ratios to avoid aggregate or liposome-like particle formation.
- Involves adaptation considerations when changing scaffold protein length or lipid composition for different membrane proteins.
- Includes practical limitations such as the irreversible aggregation risk from suboptimal detergent removal or incorrect stoichiometry.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:08
Preparation of the Membrane Scaffold Protein, MSP
3:53
Preparation of the MalFGK2 Complex
5:09
Preparation of Phospholipids
6:07
Preparation of Bio-Beads & Nanodisc Reconstitution
7:59
Nanodisc Analysis: Native Gel Electrophoresis
8:26
Nanodisc Analysis: Dynamic Light Scattering (DLS)
9:11
Nanodisc Analysis: ATPase Measurements
9:47
Results: Activity of the maltose Transporter Reconstituted into Nanodiscs
11:15
Conclusion
