Retrograde Fluorescerende Labeling Maakt Gerichte Extracellulair Single-unit Opnemen van geïdentificeerde neuronen In vivo
26 juni 2013
Retrograde transport van fluorescente kleurstof labelt een sub-populatie van neuronen op basis van anatomische projectie. Gelabelde axons kunnen visueel worden gericht In vivo, Waardoor extracellulaire opname van geïdentificeerde axonen. Deze techniek vergemakkelijkt opnemen wanneer neuronen niet kunnen worden gelabeld door middel van genetische manipulatie of moeilijk te isoleren met 'blind' In vivo Benaderingen.
Het algemene doel van deze procedure is om de reacties van enkele eenheden in vivo op te nemen van een geïdentificeerde populatie neuronen in een niet-genetisch modelsysteem. Dit wordt bereikt door eerst een craniotomie uit te voeren om het hersengebied van belang bloot te leggen. De tweede stap is om wolfraamdraden te gebruiken om de fluorescerende kleurstof in het gebied te plaatsen waarnaar de doelneuronen projecteren.
Vervolgens wordt de kleurstof retrograde vervoerd, wat resulteert in selectieve markering van de projectieneuronen. De laatste stap is om op te nemen van de gelabelde axon van het individuele projectieneuron. Uiteindelijk worden extracellulaire opnamen van enkele eenheden gebruikt om te laten zien hoe centrale sensorische neuronen in een intact circuit reageren op sensorische stimulatie in evo.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over hoe neurocircuits sub milliseconde verschillen in de timing van synaptische input detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is de mogelijkheid om individuele neuronen of zelfs axonen en niet-genetisch toegankelijke systemen te targeten. Wekelijkse elektrische vissen gebruiken elektrische signalen voor communicatie en navigatie.
Ze onderscheiden signalen van verschillende vissen door gebruik te maken van sub milliseconde verschillen in de timing van synaptische inputs. We vroegen ons af hoe de veronderstelde tijdsvergelijker neuronen in hun elektrosensorische circuit in staat zijn om zulke kleine timingsverschillen te detecteren. Maar deze techniek kan ook worden toegepast op andere systemen zoals visuele en auditieve sensorische paden.
Het is bijzonder moeilijk om vloeistof uit deze cellen te halen vanwege de kleine omvang, dichte mengeling in het omringende weefsel en de presynaptische eindknopen die het grootste deel van de celly bedekken. Intracellulaire kleurstofinjectie tijdens een whole-cell opname. In vitro labelt een enkele cel om gerichte opnames van die axon te begeleiden. Evenzo biedt retrograde transport na extracellulaire kleurstofinjectie een manier om de projectieneuronen in oppervlakkige hersengebieden selectief te labelen.
Dit kan worden gebruikt om visuele begeleiding te bieden voor in vivo opnames van enkele eenheden. Om de D-gecodeerde naald voor te bereiden, slijp eerst een 160 micrometer diameter wolfraamdraad elektrolytisch tot de uiteindelijke naaldtipdiameter van vijf tot 50 micrometer. Becodeer vervolgens de naaldtip de avond voor het experiment met een twee millimolaire oplossing van 10.000 moleculair gewicht dextran geconjugeerd Alexa vloer kleurstof om algemene anesthesie te induceren.
Plaats de vis in tankwater met MS 2 22 oplossing bij 300 milligram per liter om te immobiliseren en elektrisch te verdoven door 100 microliters van flail bij drie milligram per milliliter te injecteren in de dorsale lichaamsspieren. Vul vervolgens de opnamekamer met tankwater en plaats de vis met de buik naar beneden op het platform in het midden van de kamer. Lever vervolgens de beluchte MS 2 22 oplossing bij 100 milligram per liter in een tot twee milliliter per minuut door een pipettip in zijn mond te plaatsen.
Stabiliseer vervolgens de vis met vaste staven en was aan beide zijden van het lichaam. Controleer de gezondheidstoestand van de vis door de continue bloedstroom in de oogvaten en een normale lichaamskleur te controleren. Draai vervolgens het platform langs de verticale as.
Pas een uiteinde van het platform aan zodat een zijde van de dorsale oppervlakte van de kop van de vis boven het water wordt blootgesteld terwijl de rest van het lichaam van de vis ondergedompeld blijft. Plaats een klein stukje Kim-doek op elk niet ondergedompeld deel van de huid om uitdroging te voorkomen. Breng in deze procedure 0,4% lidocaine aan op het blootgestelde oppervlak van de kop met behulp van een Q-tip.
Gebruik vervolgens een scalpelmes om een rechthoekig stuk huidweefsel van ongeveer drie millimeter bij vijf millimeter te snijden voor een vis van 6,2 centimeter. De laterale rand van de rechthoek moet uitlijnen met het centrum van het oog. De voorste rand van de rechthoek moet net achter het oog zijn, en de mediale rand van de rechthoek moet net lateraal zijn ten opzichte van de middenlijn.
Verwijder vervolgens het rechthoekige gebied met behulp van een tang. Snijd een extra 2,5 millimeter vierkant anterieure mely om de schedel bloot te leggen. Maak het blootgestelde oppervlak van de schedel volledig schoon door overtollig weefsel weg te schrapen met het scalpelmes.
Droog vervolgens het oppervlak volledig af met een Kim-doek en geforceerde lucht. Lijm vervolgens een metalen pin op het anterieure mediale blootgestelde schedelgebied met superlijm. Wacht tot de lijm volledig droog is.
Gebruik een tandboor met een 0,5 millimeter diameter balfrezen carbid tip om een rechthoek van ongeveer twee millimeter bij vier millimeter op de schedel te tekenen voor een vis van 6,2 centimeter. Snijd vervolgens de omtrek van de rechthoek met het scalpel en de tang. Schil vervolgens de schedel los.
Om de hersenen bloot te leggen, snijdt u zowel de pigmentdeura mater als de heldere pia mater met behulp van een paar veerscharen of een naald. Verwijder vervolgens de gesneden delen met een paar tang om de anterieure extra laterale kern en de posterieure extra laterale kern bloot te leggen. Plaats nu een manipulator met een D-gecoate naald die eerder werd voorbereid boven het doelgebied dat de axonen van belang bevat.
In ons geval wordt het posterieure extra laterale kern snel de naald ongeveer 25 micrometer in het weefsel ingebracht. Nadat de kleurstof gedurende 15 tot 30 seconden is gediffundeerd, trekt u de naald terug. Herhaal dit met extra verse naalden indien nodig.
Plaats elk stuk op een andere locatie zodat de kleurstof over het doelgebied wordt verdeeld. Spoel vervolgens de overtollige kleurstof uit de holte met de oplossing van Hickman en wacht minimaal twee uur voor kleurstofopname en -transport. Om de axonen van belang te visualiseren, plaatst u de opnamekamer met de vis onder de objectief van een rechtopstaande vaste epifluorescentiemicroscoop.
Wissel de ademhalingsoplossing naar vers tankwater en houd dezelfde stromingssnelheid aan. Plaats vervolgens een uiteinde
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het opnemen van reacties van enkele eenheden van geïdentificeerde neuronen in vivo door gebruik te maken van retrograad transport van fluorescerende kleurstof. Deze techniek maakt selectieve labelen van projectieneuronen mogelijk, wat gerichte extracellulaire opnamen in niet-genetische modelsystemen vergemakkelijkt.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Elektrofysiologie
- Neuronale Circuitry
Achtergrond
- Opnemen van specifieke neuronen is cruciaal voor het begrijpen van neurale circuits.
- Traditionele methoden labelen neuronen in niet-genetische systemen mogelijk niet effectief.
- Fluorescerende kleurstof kan worden gebruikt om neuronen te labelen op basis van hun anatomische projecties.
- Deze aanpak is bijzonder nuttig voor het bestuderen van sensorische neuronen in elektrische vissen.
Doel van de studie
- Om een techniek te ontwikkelen voor in vivo opname van geïdentificeerde neuronen.
- Om te onderzoeken hoe sensorische neuronen op stimuli reageren.
- Om de mogelijkheid te verbeteren om individuele neuronen in complexe weefsels te targeten.
Gebruikte methoden
- Craniotomie om het hersengebied van belang bloot te leggen.
- Injectie van fluorescerende kleurstof in doelgebieden om projectieneuronen te labelen.
- Gebruik van wolfraamdraden voor nauwkeurige kleurstofplaatsing.
- Extracellulaire opname van gelabelde axonen om neuronale reacties te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle labelen van projectieneuronen door gebruik van retrograad transport van kleurstof.
- Mogelijkheid om reacties van enkele eenheden van geïdentificeerde neuronen op te nemen.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de techniek voor het bestuderen van timingverschillen in sensorische circuits.
- Visuele begeleiding geboden voor gerichte opnamen in vivo.
Conclusies
- De methode maakt gerichte opnamen mogelijk van specifieke neuronen in niet-genetische systemen.
- Deze aanpak kan worden toegepast op verschillende sensorische paden, voorbij elektrische vissen.
- Het biedt een aanzienlijk voordeel ten opzichte van traditionele methoden in complexe weefselomgevingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables targeted single-unit recordings from identified neurons in non-genetic model systems, addressing a key challenge in neuroscience research where genetic tools are unavailable. By using retrograde fluorescent labeling based on axonal projections, researchers can pre-visualize and selectively record from specific neuronal populations, improving the reliability and interpretability of electrophysiological data. This capability supports mechanistic de-risking in target validation by linking neuronal identity to function in intact circuits, which is valuable for preclinical neuroscience and translational biomarker discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking neuronal identity to electrophysiological function in vivo.
- Operational Value: Provides a visual cue for targeted recordings, reducing blind sampling and increasing data quality in heterogeneous tissues.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking by confirming that recorded signals originate from anatomically defined projection neurons.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Creates a standardized, reproducible system for preparing labeled neurons for downstream electrophysiological assessment.
- Quantitative Output: Enables measurement of single-unit responses to sensory stimuli, providing actionable data for compound screening.
- Platform Reuse: The retrograde labeling approach can be adapted across brain regions and model systems, supporting scalable use in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Applicable to sensory processing circuits, offering insight into neural mechanisms of stimulus detection and timing discrimination.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling consistent identification of neuronal targets across experimental sessions.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces false positives in target validation by ensuring recordings are obtained from the intended neuronal population.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven interrogation of neural circuits before moving to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing researchers to record from neurons defined by their projection patterns, clarifying functional roles in sensory processing.
- Screening: Generates reproducible, quantifiable electrophysiological readouts that can be used to assess neuronal responses under controlled conditions.
- Analytics: Produces spike timing and duration tuning curves that enable quantitative comparison of neuronal responses across stimuli or conditions.
- Translational Research: Supports continuity from circuit-level discovery to preclinical models by providing a reliable method to identify and re-target specific neurons.
- Enterprise Reuse: The core technique of retrograde dye labeling is adaptable to various brain regions and species, making it a reusable capability across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through anatomically precise targeting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of single-unit recordings via pre-visualization of target neurons.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in early discovery by increasing the likelihood that observed phenotypes are linked to the intended neuronal target.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated neuronal identity and function in intact circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, microsurgery, and in vivo electrophysiology.
- Depends on access to fluorescence microscopy, micromanipulators, and extracellular recording equipment.
- Necessitates standardization of dye injection parameters and transport times across users and labs.
- Must account for variability in axonal projection patterns when applying the method to new model systems or brain regions.
- Practical limitations include dependence on successful retrograde transport, which may vary by tissue health and dye properties.
