Retrograde Fluorescerende Labeling Maakt Gerichte Extracellulair Single-unit Opnemen van geïdentificeerde neuronen

Het algemene doel van deze procedure is om de in vivo responsen van individuele eenheden vast te leggen van een geïdentificeerde populatie neuronen in een niet-genetisch modelsysteem. Dit wordt bereikt door eerst een craniotomie uit te voeren om de hersenregio van belang bloot te leggen. De tweede stap is het gebruik van wolfraamdraden om de fluorescerende kleurstof te plaatsen in de regio waarnaar de doelnuronen projecteren.

Vervolgens wordt de kleurstof retrograad getransporteerd, wat resulteert in een selectieve markering van de projectieneuronen. De laatste stap is het registreren van het gemarkeerde axon van het individuele projectieneuron. Uiteindelijk worden extracellulaire single-unit registraties gebruikt om aan te tonen hoe centrale sensorische neuronen in een intact circuit reageren op de sensorische stimulatie in evo.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over hoe neurale circuits submilliseconde verschillen in de timing van synaptische inputs detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is de mogelijkheid om individuele neuronen of zelfs axonen en niet-genetisch toegankelijke systemen te targeten. Zwakke elektrische vissen gebruiken elektrische signalen voor communicatie en navigatie.

Zij onderscheiden signalen van verschillende vissen met behulp van sub-milliseconde verschillen in de timing van synaptische input. Wij hebben onderzocht hoe de veronderstelde tijdvergelijkingsneuronen in hun electrosensorische circuit in staat zijn om zulke kleine tijdsverschillen te detecteren. Deze techniek kan echter ook worden toegepast op andere systemen, zoals visuele en auditieve sensorische banen.

Het is bijzonder moeilijk om deze cellen te isoleren vanwege de geringe omvang, de dichte verstrengeling met het omringende weefsel en de presynaptische terminals die het grootste deel van het cellichaam bedekken. Intracellulaire injectie van kleurstof tijdens een whole-cell registratie in vitro labelt een enkele cel om gerichte registraties vanuit dat axon mogelijk te maken. Op soortgelijke wijze biedt retrograd transport na extracellulaire injectie van kleurstof een methode om projectieneuronen in oppervlakkige hersengebieden selectief te labelen.

Dit kan worden gebruikt om visuele begeleiding te bieden bij in vivo single-unit registraties. Om de D-gecodeerde naald voor te bereiden, wordt eerst een tungsteendraad met een diameter van 160 micrometer electrolytisch verscherpt tot een uiteindelijke naaldtipdiameter van vijf tot 50 micrometer. Codeer vervolgens, in de nacht voor het experiment, de naaldtip met een twee millimolaire oplossing van 10.000 moleculair gewicht dextran geconjugeerde Alexa Fluor-kleurstof om algemene anesthesie op te wekken.

Plaats de vis in tankwater met MS 2 22-oplossing van 300 mg/L. Immobiliseer en schakel de vis elektrisch uit door 100 µL flail van 3 mg/mL in de dorsale lichaamsmusculatuur te injecteren. Vul vervolgens de registratiekamer met tankwater en plaats de vis met de ventrale zijde naar beneden op het platform in het midden van de kamer. Dien daarna de beluchte MS 2 22-oplossing van 100 mg/L toe met een snelheid van 1 tot 2 mL per minuut door een pipetpunt in de bek te plaatsen.

Stabiliseer vervolgens de vis met vaste staven en was aan beide zijden van het lichaam. Controleer de gezondheidstoestand van de vis door de continue bloedstroom in de oogvaten en een normale lichaamskleur te controleren. Draai vervolgens het platform langs de verticale as.

Stel één uiteinde van het platform zo in dat één zijde van het dorsale oppervlak van de kop van de vis boven het water uitsteekt, terwijl de rest van het lichaam van de vis ondergedompeld blijft. Plaats een klein stukje Kim wipe op elk niet-ondergedompeld deel van de huid om uitdroging te voorkomen. Breng in deze procedure 0,4% lidocaïne aan op het blootgestelde oppervlak van de kop met behulp van een wattenstaafje.

Gebruik vervolgens een scalpellames om een rechthoekig stukje huidweefsel van ongeveer drie millimeter bij vijf millimeter uit te snijden voor een vis van 6,2 centimeter. De laterale zijde van de rechthoek moet worden uitgelijnd met het midden van het oog. De anterieure zijde van de rechthoek moet zich net posterior van het oog bevinden, en de mediale zijde van de rechthoek moet zich net lateraal van de middellijn bevinden.

Verwijder vervolgens het rechthoekige stukje met een pincet. Snijd een extra vierkant van 2,5 millimeter anterieur om de schedel bloot te leggen. Maak het blootgelegde oppervlak van de schedel volledig schoon door alle overtollige weefsels met het scalpellamesje weg te schrapen.

Droog vervolgens het oppervlak volledig af met een Kim wipe en geforceerde lucht. Lijm daarna een metalen pin met secondelijm vast aan het anteromediale blootgelegde schedelgebied. Wacht tot de lijm volledig is uitgehard.

Gebruik een tandartsboor met een carbide kogelfrees van 0,5 millimeter diameter om een rechthoek van ongeveer twee millimeter bij vier millimeter op de schedel van een vis van 6,2 centimeter te tekenen. Snijd daarna de omtrek van de rechthoek door met de scalpel en pincet. Pel vervolgens de schedel weg.

Om de hersenen bloot te leggen, snijdt u zowel de gepigmenteerde dura mater als de heldere pia mater door met een veerschaartje of een naald. Verwijder vervolgens de weggesneden delen met een pincet om de nucleus extra lateralis anterior en de nucleus extra lateralis posterior bloot te leggen. Positioneer nu een manipulator met de eerder voorbereide D-gecoate naald boven het doelgebied dat de axonen van belang bevat.

In ons geval wordt de naald voor de posterieure extralaterale nucleus snel ongeveer 25 micrometer in het weefsel ingebracht. Nadat de kleurstof gedurende 15 tot 30 seconden heeft gediffundeerd, wordt de naald teruggetrokken. Herhaal dit indien nodig met extra nieuwe naalden.

Plaats elke druppel op een andere locatie, zodat de kleurstof over het gehele doelgebied wordt verspreid. Spoel vervolgens de overtollige kleurstof uit de holte met Hickman's ringer-oplossing en wacht ten minste twee uur voor de opname en het transport van de kleurstof. Om de axonen van belang te visualiseren, plaatst u de opnamekamer met de vis onder het objectief van een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop met vaste tafel.

Vervang de respiratieoplossing door vers aquariumwater en behoud dezelfde stroomsnelheid. Plaats vervolgens één uiteinde van het aardingsdraad in de blootgelegde hersenholte en verbind het andere uiteinde met de aarde van de registratiekop. Plaats daarna een paar registratie-elektroden naast de basis van de staart.

Sluit vervolgens de elektroden aan op een differentiële versterker en een registratieapparaat. Om de opdracht voor de elektrische orgaanontlading (electric organ discharge command of EODC) te monitoren, dient u een geschaalde schets te maken van het hersengebied bij lage vergroting, inclusief de belangrijkste bloedvaten als oriëntatiepunten om de exacte locatie van de gelabelde axonen te identificeren. Bekijk ter bevestiging eerst het gehele weefsel met helderveldverlichting voor de oriëntatie van de D-plaatsing.

Bekijk het vervolgens onder fluorescentie-illuminatie. De posterieure extralaterale nucleus moet diffuse labeling vertonen. Zoek daarna, onder hoge vergroting, de anterieure extralaterale nucleus op met de bloedvaten als oriëntatiepunten.

Verlicht het monster met fluorescent licht terwijl u zoekt naar een gelabeld axon nabij het oppervlak, gebruikmakend van een borosilicaat capillair glas met een buiten diameter van 1 millimeter, een binnen diameter van 0,58 millimeter en een filament. Trek een registratie-elektrode met een smalle schacht van vijf millimeter lang en een tipdiameter van ongeveer 1 tot 2,4 µm.

Vul de elektrode met gefilterde hickman's ringer-oplossing. De uiteindelijke tipweerstand moet liggen in het bereik van 16 tot 155 mega ohm. Plaats de elektrode in een elektrodehouders met een drukaansluiting.

Sluit het aan op de headstage die op een manipulator is gemonteerd. Sluit vervolgens de headstage aan op een versterker. Een analoog-digitaal acquisitieapparaat, hier niet afgebeeld, verbindt de versterker met de computer.

Breng daarna een positieve druk van 30 millibar aan op de elektrodelijn. Beweeg de elektrode langzaam vanaf het weefseloppervlak in de richting van het axon. Wanneer de elektrode zich dicht bij het axon bevindt, moet de positieve druk een lichte maar waarneembare beweging van het axon veroorzaken terwijl de elektrode zich naast het axon bevindt.

Registreer de activiteit tijdens de presentatie van de teststimuli. Hoewel een elektrisch artefact de juiste registratie en stimulatie bevestigt, mogen er geen actiepotentialen optreden. Neem de uitwaartse druk op de elektrode weg en herhaal de stimulatie en registratie.

Pas vervolgens een lichte zuigkracht toe waardoor het axon in de elektrode wordt getrokken. Herhaal de stimulatie en registratie opnieuw. Nu zouden er actiepotentialen zichtbaar moeten zijn als reactie op de stimulaties.

Zodra de actiepotentialen zichtbaar zijn, wordt de druklijn gesloten. Wanneer alle gewenste opnames zijn voltooid, wordt het tankwater teruggeschakeld naar de respiratie-oplossing met MS 222 in een concentratie van 100 mg/L om ervoor te zorgen dat de vis volledig is geanestheseerd. Er mag gedurende ten minste 10 minuten geen EODC worden gedetecteerd voordat de vis wordt geëuthanaseerd.

Hier zijn vijf voorbeeldsporen die de actiepotentialen tonen die zijn opgewekt door een monofasische contralaterale positieve transversale vierkantpulse-stimulus van 0,1 milliseconde en zes millivolt per centimeter, en hier is een rasterplot die de spike-tijden toont gedurende 20 herhalingen van een opnamevenster van 75 milliseconden voor dezelfde unit die op tijdstip nul werd gestimuleerd met stimuli van zes millivolt per centimeter. Het bereik van de duur is rechts vermeld. Hier wordt een tuningcurve voor stimulusduur getoond die de responsen kwantificeert als spikes per stimulusherhaling.

Zodra de techniek onder de knie is, kunnen de chirurgie en de injectie van de kleurstof in één uur worden voltooid als dit correct wordt uitgevoerd, en kunnen de opnames twee tot drie uur na de injectie van de kleurstof worden gestart. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de gezondheid van het proefdier na de ingreep zorgvuldig te bewaken. Andere methoden, zoals twee-fotonen成像, kunnen worden toegepast om opnames te maken van neuronen in nog diepere hersenstructuren.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u responsen van individuele eenheden moet labelen en registreren vanuit een geïdentificeerde populatie neuronen.