Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes
28 mei 2012
We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit rapport beschrijven we de belangrijkste experimentele procedures waar een specifieke DNAzyme probe aangeduid "RFD-EC1" wordt gebruikt voor de detectie van het model bacterie, Escherichia coli (E. coli).
Het algemene doel van het volgende experiment is om snel de aanwezigheid van specifieke bacteriën zoals e coli te detecteren met behulp van nieuwe griepgenische, DNA, Zyme sondes. Eerst worden complete genische DNA. Zyme sondes gegenereerd door ligatie. Bacteriën worden vervolgens gekweekt om het aantal doelmoleculen te verrijken en het verkregen extracellulaire mengsel wordt bereid uit het supernatant.
Het ruwe extracellulaire mengsel wordt vervolgens gecombineerd met de DNA zyme sonde. De interactie tussen de DNA Zyme sonde en doelmoleculen resulteert in splitsing van de sonde, die vervolgens fluorescent is. Een fluorimeter ziet de interactie tussen de sonde en het doelwit als een toename in relatieve fluorescentie. De resultaten worden vervolgens geverifieerd met behulp van analyse door denaturerende polyacrylamide-gelelektroforese.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van PCR of antilichaamgebaseerde methoden is dat de procedure eenvoudiger en gemakkelijker uit te voeren is. Hoewel deze methode is ontwikkeld met het modelbacterie e coli, kan deze worden toegepast op de detectie van alle andere door voedsel overgedragen of nosocomiale bacteriële ziekteverwekkers. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat ze mogelijk niet gewend zijn aan het hanteren van synthetische DNA-sondes en bacteriën. Het demonstreren van de procedure is Sergio Aguire, een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium en Monso Ali, een postdoctoraal fellow. Voor dit protocol.
R-F-D-E-C een is de afgebeelde DNA Zyme. Het bestaat uit de katalytische sequentie EC een onderstreept in zwart en de substraatsequentie FS een onderstreept in groen. Binnen het substraat zit een RNA-koppeling aangegeven door de blauwe r, geflankeerd door een Fluor-gelabelde DT aangegeven door de F en een QUENCHER-gelabelde DT aangegeven door de wachtrij RF SS een is een door elkaar gehaalde versie van RFD EEC een waarbij de katalytische sequentie EEC een gedeeltelijk door elkaar wordt geschoven in SS een, maar de FS een-portie ongewijzigd blijft. RF DEC een en RF SS een worden gemaakt door template-gemedieerde enzymatische ligatie van de oligonucleotide FS een met oligonucleotide EC een of SS een in aanwezigheid van LT een als ligatietemplate om ruwe extracellulaire mengsels of CEM's voor te bereiden die als doelwit voor R-F-D-E-C een zullen worden gebruikt. Begin met het doseren van twee milliliter LB in steriele 14 milliliter kweekbuisjes met behulp van een pistepistool.
Gebruik vervolgens een steriele pipettetip om een enkele kolonie van e coli van een augerplaat te plukken en in een kweekbuisje met lb te laten vallen. Plaats de buisjes in een incubator ingesteld op 37 graden Celsius en schud gedurende 14 uur bij 250 RPM na de incubatie. Om een re-inoculatiecultuur van 1% te genereren, doseer twee milliliter verse LB in 14 milliliter kweekbuisjes en voeg 20 microliter van de bacteriecultuur van de vorige stap toe.
Incubeer de buisjes bij 37 graden Celsius met schudbewegingen bij 250 RPM tot elke bacterieoplossing een OD 600 van ongeveer een bereikt. Breng één milliliter van elke cultuur over naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuisje en pellet de cellen door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 11.000 G. Na het centrifugeren brengt u de heldere supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis.
Bewaar het supernatant bij min 20 graden Celsius. Als het niet onmiddellijk wordt gebruikt om te bepalen of een fluorescerend signaal wordt gegenereerd bij interactie van de DNA-enzymen met het ruwe cellulaire extract, worden de monsters geanalyseerd door spectrofotometrie. Schakel de fluorescente spectrofotometer in en stel de gegevensverwervingsparameters in met excitatie bij 488 nanometer en emissie bij 520 nanometer.
Stel het apparaat ook in om om de minuut gedurende één uur metingen te doen. Was drie kwartskristallen cuvettes eerst met gedestilleerd gedeïoniseerd water en vervolgens met 100% ethanol. Droog de cuvettes door er met stikstofgas overheen te blazen.
Label de cuvettes als C een voor controle een, C twee voor controle twee en T voor test. Breng vervolgens 24 microliter gedestilleerd gedeïoniseerd water over naar C een en 24 microliter van het bereide e coli ruwe extracellulaire mengsel naar C twee en T. Voeg 25 microliter van twee X RB toe aan elk Q vet en plaats ze in de fluorescente spectrofotometer. Begin met het verzamelen van fluorescentiegegevens na vijf minuten, voeg één microliter van vijf micromolar RFS S een toe aan C twee en één microliter van vijf micromolar RFD eec een aan T en C een, waarbij wordt gezorgd dat de fluorescentiemetingen niet worden onderbroken. Meng elke oplossing door te pipetteren en laat de reactie gedurende de resterende verwervingsperiode doorgaan.
Sla de gegevens op in Excel-bestandsindeling. Breng vervolgens de gegevens over naar een personal computer en gebruik Excel om een grafisch beeld te maken. Dezelfde reactiemengsels die voor analyse door Spectra zijn gebruikt.
Fotometrie kan worden gebruikt voor analyse door gelelektroforese. Na één uur verwerving. Verwijder de cuvettes uit de spectrofotometer en breng de oplossingen over naar nieuwe microcentrifugebuisjes.
Demp de reacties door vijf microliter van drie molaire natriumacetaat en 125 microliter van 100% ethanol toe te voegen. Meng elke oplossing door te vortexen en plaats de buisjes gedurende één uur in de min 20 graden Celsius vriezer na de incubatie centrifuge. Centrifugeer de reactiemengsels bij 11.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius en verwijder voorzichtig het supernatant door te pipetteren.
Droog de pellets gedurende 10 minuten met een DNA concentrator. Voeg 20 microliter gel-laadbuffer toe en vortex kort. Draai kort door met een tafelcentrifuge.
Laad vervolgens 10 microliter van de reactiemonsters per putje van 10% Dage gel na de run. Verwijder de glazen platen en was ze grondig met kraanwater. Veeg de platen schoon met een Kim wipe om eventuele gelresten te verwijderen.
Scan de gelplaat op fluorescentie met behulp van een typhoon scanner. Analyseer de resulterende afbeeldingen met beeldkwantificeringssoftware om de gevoeligheid van het systeem te beoordelen. Seriaal verdunde culturen worden gedur
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe methode voor het detecteren van bacteriën, specifiek Escherichia coli, met behulp van fluorogene DNAzyme-sondes. Deze benadering vereenvoudigt de detectie van bacteriën door de aanwezigheid van bacteriën om te zetten in een meetbaar fluorescentiesignaal.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Biotechnologie
- Fluorescentie-assays
Achtergrond
- Fluorogene DNAzyme-probes kunnen reacties katalyseren die leiden tot fluorescentie.
- Traditionele methoden voor de detectie van bacteriën kunnen complex en tijdrovend zijn.
- Deze studie heeft tot doel het detectieproces te stroomlijnen.
- Extracellulaire mengsels van bacteriën worden gebruikt als targets voor detectie.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een eenvoudige mix-and-read assay voor de detectie van bacteriën.
- Het gebruiken van een specifieke DNAzyme-probe, RFD-EC1, voor de detectie van E. coli.
- Het aantonen van de effectiviteit van deze methode in vergelijking met traditionele technieken.
Gebruikte methoden
- Genereren van DNAzyme-sondes via ligatie.
- Kweken van bacteriën om ruwe extracellulaire mengsels voor te bereiden.
- Fluorescentiemetingen met behulp van een fluorimeter.
- Verificatie van de resultaten via gelelektroforese.
Belangrijkste resultaten
- De DNAzyme-probe splitste het substraat succesvol in de aanwezigheid van E. coli.
- De fluorescentie-intensiteit correleerde met de aanwezigheid van bacteriën.
- De methode bleek eenvoudiger dan PCR en antilichaamgebaseerde technieken.
- De resultaten waren reproduceerbaar en verifieerbaar via gelelektroforese.
Conclusies
- Deze nieuwe assay biedt een snelle en efficiënte methode voor bacteriële detectie.
- De techniek kan worden aangepast voor andere voedselgerelateerde of nosocomiale pathogenen.
- Toekomstige toepassingen kunnen de voedselveiligheid en klinische diagnostiek verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Snelle, specifieke detectie van bacteriële pathogenen is een kritiek omslagpunt in zowel de pijplijnen voor voedselveiligheid als voor de beheersing van ziekenhuisinfecties. Fluorogene assays op basis van DNAzymen bieden een gestroomlijnde mix-and-read-oplossing die de tekortkomingen op het gebied van operationele eenvoud, sensitiviteit en specificiteit aanpakt die traditionele PCR- en antilichaamgebaseerde methoden achterlaten. Deze mogelijkheid maakt eerdere, zekerdere interventies en risicobeperking mogelijk binnen biopharma- en diagnostiekportefeuilles.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe detectie van de aanwezigheid van pathogenen mogelijk via extracellulaire moleculaire signalen.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door een hoge specificiteit voor doelbacteriën te bieden.
- Faciliteert snelle go/no-go-beslissingen bij de ontwikkeling van biosensoren en diagnostische instrumenten.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde, kwantitatieve fluorescentie-gebaseerde assays voor voor downstream screening-workflows.
- Levert reproduceerbare, schaalbare detectieplatforms die aanpasbaar zijn aan meerdere bacteriële targets.
- Maakt standaardisatie van assay-condities mogelijk voor vergelijkbaarheid tussen laboratoria.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door extracellulaire signalen van pathogenen te detecteren.
- Biedt continuïteit van biosensorvalidatie in de ontdekkingsfase tot preklinische diagnostische evaluatie.
- Vermindert het risico op fout-positieven en fout-negatieven in vroege stadia van pathogenendetectiestudies.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze op DNAzyme gebaseerde detectiemethode integreert zich op het grensvlak van vroege ontdekking en assay-ontwikkeling, ter ondersteuning van zowel lead-identificatie als translationeel onderzoek voor pathogeendiagnostiek.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetesten voor de aanwezigheid van pathogenen mogelijk met behulp van extracellulaire moleculaire signalen.
- Screening: Levert kwantitatieve fluorescentie-outputs voor snelle evaluatie met een hoge doorvoer.
- Analytica: Levert heldere, meetbare resultaten en ondersteunt statistische vergelijking van assay-condities.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen ontdekking en preklinische validatie voor de ontwikkeling van diagnostische instrumenten.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Biedt een modulair platform dat aanpasbaar is aan diverse bacteriële targets en biosensing-behoeften.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de detectie van pathogenen.
- Operationele waarde: Vereenvoudigt workflows, verbetert de reproduceerbaarheid en ondersteunt een snelle doorlooptijd.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van de besluitvorming en vermindert biologische risico's in een laat stadium bij de ontwikkeling van diagnostica.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van biosensor- en diagnostische kandidaten mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van synthetische DNA-sondes en de opzet van fluorescentie-assays.
- Toegang tot standaardinfrastructuur voor fluorescentiespectrofotometrie en gelelektroforese is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor de reproduceerbaarheid van assays en de vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpasbaar aan verschillende bacteriële modellen mits de juiste sonde wordt geselecteerd en gevalideerd.
- Afhankelijk van adequate training voor nieuwe gebruikers die niet bekend zijn met DNAzyme-gebaseerde detectie.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
2:02
Construction of RFD-EC1 and RFSS1 by Template Mediated Enzymatic Ligation
4:38
Detection using Fluorescence Spectrophotometer
6:28
Detection by Gel Electrophoresis
8:04
Single Cell Detection
9:55
Experimental Validation using E. coli Crude Extracellular Mixtures
12:42
Conclusion
