Name: Isolatie en Cultuur van Rat Embryonale neurale cellen: een Quick-protocol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Leer een snelle methode voor het isoleren en kweken van embryonale ratneuronen in serumvrije omstandigheden. Dit protocol levert zuivere neuronale culturen voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Jonna Ellis voor de redactionele ondersteuning. Het beschreven project werd ondersteund door Award Aantal R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) van het National Institute of Mental Health. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Institute of Mental Health en de National Institutes of Health.

1. Poly-D-Lysine (PDL): Voorbereiding <ol><li> Voeg 5 ml steriele DDH 2 O tot 5 mg van het PDL om een voorraad oplossing van 1 mg / ml te verkrijgen. </li><li> Meng voorraadoplossing door pipetteren meerdere malen. </li><li> Onmiddellijk gebruiken of op te slaan Poly-D-Lysine oplossing bij 2-8 ° C. </li></ol> 2. Poly-D-Lysine (PDL): Coating Plastic Cel Cultuur Dishes <ol><li> Verdun de PDL voorraadoplossing met steriel DDH 2 O de uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml. </li><li> Pipetteer genoeg oplossing in een 60 mm schaal tot cultuur oppervlakte (3 ml voor een 60 mm schotel) te dekken. </li><li> Rock voorzichtig om zelfs coating van de cultuur oppervlak te verkrijgen. </li><li> Incubeer beklede platen bij kamertemperatuur (RT) overnacht. </li><li> De volgende dag, meestal de dag van de dissectie, verwijder de poly-D-Lysine oplossing door aspiratie en was korte tijd met 3 ml steriele DDH 2 O. Herhaal deze stap. Na de tweede wasbeurt, volledig te verwijderen water door aspiratie. </li><li>Platen kunnen worden bewaard bij 4 ° C tot drie weken. </li></ol> 3. Poly-D-Lysine (PDL) en laminine: Voorbereiding en coaten van glas zijn twee-kamer-Dia <ol><li> Mix PDL (1 mg / ml) en laminine (1 mg / ml) voorraadoplossingen in steriele DDH 2 O de eindconcentratie van 10 en 5 ug / ml. </li><li> Pipetteer voldoende oplossing in putjes van een glas met twee kamers dia de cultuur oppervlak (1 ml voor elke wel van een 2 en glas twee kamers dia) omvat. </li><li> Rock voorzichtig om zelfs coating van de cultuur oppervlak te verkrijgen. </li><li> Incubeer gecoate platen nacht bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> De volgende dag, verwijder de Poly-D-Lysine-Laminine coating oplossing via aspiratie en tweemaal kort wassen met 1 ml steriele DDH 2 O. Na de tweede wasbeurt, volledig te verwijderen water door aspiratie. </li><li> Kamer dia&#39;s kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal drie weken. </li></ol> Opmerking: Alle glazen kamer dia kan worden bekleed following dit protocol. We maken vaak gebruik van de twee-kamer-dia&#39;s, omdat elke dia zorgt voor de controle-test experimentele setting (bijvoorbeeld onbehandeld versus behandeld, ongetransfecteerde versus getransfecteerd). 4. Neuronale Dissection en Cultuur <ol><li> Verwarm de volgende reagentia in een 37 ° C waterbad <ul type="disc"><li> TrypLE Express op de oorspronkelijke 100 ml fles. </li><li> Neurobasal/B27 compleet medium (zie tabel I). Opgewarmd Het volume is afhankelijk van het aantal gerechten te zijn verguld (bijv. 30 ml voor tien 60 mm vergulde schotels). </li></ul></li><li> Voeg 3 ml koud Hibernate E-oplossing met vier 60 mm cultuur gerechten en 13 ml van een 15 ml BD Falcon hoge helderheid polypropyleen conische buis. </li><li> Voeg 25-30 ml koud dissectie medium (zie tabel II, Dr Olimpia Meucci, persoonlijke communicatie) aan elk van de drie 100 mm cultuur gerechten. Deze platen, die een grote hoeveelheid medium, worden gebruikt om de embryo onmiddellijk nadat deverwijdering uit het vruchtwater zakken (stap 4.7 en 4.8). </li><li> Euthanaseren een E17 getimede zwangere ratten door CO 2 in overeenstemming met de GGD-beleid inzake humane zorg en het gebruik van proefdieren en onder een institutioneel goedgekeurd verzorging van dieren en gebruiken protocol. </li><li> Spuit onderbuik met 70% EtOH en snijd mediaal door de huid en de spieren met een schaar het blootstellen van de baarmoeder en embryo&#39;s. </li><li> Verwijder alle foetussen en leg ze in een steriele 100-mm schotel met een overmaat aan koude dissectie medium (25-30 ml, zie stap 4.3). </li><li> Snijd embryo&#39;s met een kleine schaar van vruchtzak en plaats ze in de tweede 100-mm schaaltje met koud dissectie medium. </li><li> Was de embryo&#39;s bij kamertemperatuur door voorzichtig kantelen van de 100-mm schotel voor 5-10 seconden. Dan dragen de gespoelde embryo&#39;s naar de derde 100 mm schotel met het ontleden van medium. Twee wasbeurten in overmaat medium zijn meestal voldoende om alle sporen van bloed te verwijderen. Indien negessary, een keer wassen met een verse 100 mm schotel met 25-30 ml koud dissectie medium. </li><li> Met behulp van een stereomicroscoop en gebogen pincet, pak elke rat embryo van de hersenen door het uittrekken van de huid en schedel. Plaats hele brein in een van de 60-mm gerechten (meestal met niet meer dan 5 hersenen per gerecht) met koud Hibernate E. Bewaar deze platen op ijs. </li><li> Neem een ​​gerecht per keer en, onder een stereomicroscoop, scheiden de hemisferen en isoleren van de cerebrale cortex het verwijderen van de middenhersenen en de hersenvliezen. </li><li> Optioneel: cut hersenen langs de middellijn, uitpakken hippocampus, en onder de procedure om hippocampale neuronen te isoleren volgen. </li><li> Verzamel alle ontleed cortex in een 15-ml helder conische buis met daarin 13 ml koud Hibernate E. Laat de cerebrale cortex op ijs totdat alle dissecties zijn voltooid. Door hun kleine afmetingen kan ontleed hippocampus worden verzameld in een 1,5 ml Eppendorf buis in plaats van een 15-ml-buis. Desgewenst bij deze stap cortices ofhippocampus kan in een cryotube flacon 1 ml Hibernate E + 2% B27 + gentamicine (50 ug / ml) + fungizon (250 ng / ml) in een verhouding van 2-4 of 2-4 corticaal hippocampus per flacon. Hersenweefsel kan worden bewaard bij 4 ° C in het donker tot een week (later tijden niet niet getest). Wanneer nodig, gebruik maken van fijne tang om het hersenweefsel over te dragen aan een 15 ml buis met Hibernate E en volg de onderstaande protocol om neuronen te isoleren. </li><li> Breng de buis tot een weefselkweek kap. Laat de cortex om zich te vestigen op de bodem van de buis en dan voorzichtig de bovenstaande vloeistof. </li><li> Voeg 13 ml verse Hibernate E naar de 15 ml conische buisje, corticaal op de bodem van de buis en verwijder de supernatant. Herhaal deze stap nog 2 keer, en na de laatste wasbeurt, verwijder zorgvuldig alle media. </li><li> Enzymatisch verteren cerebrale cortex door het toevoegen van 1-2 ml (afhankelijk van het aantal cortex, gebruiken minder voor de hippocampus isolatie) van warme TrypLE Express. Sluit de dop van de buis met Parafilm en zweven de buis in een 37 ° C waterbad gedurende 10 minuten. </li><li> Spuit de buis met 70% ethanol voor het openen van de kap en voeg 10 ml van Hibernate E. Laat de cortex om zich te vestigen op de bodem van de buis en de supernatant te verwijderen. Herhaal deze stap drie keer uit te spoelen TrypLE Express. In de laatste stap, verwijder zorgvuldig alle media. </li><li> Voorzichtig fijnstampen (4-5 keer) de cortex in 2 ml Neurobasal/B27 volledig medium met behulp van een brand-gepolijst glas Pasteur (ongeveer 1 mm in diameter). Wees voorzichtig om luchtbellen te vermijden. </li><li> Herhaal andere 4-5 keer met een steriele glazen pasteurpipet kleinere diameter (een pipet over 1/2-3/4 mm diameter). Gebruik een pasteurpipet kleiner dan deze of vernietigen van de cellen. </li><li> Laat de resterende stukjes weefsel (over het algemeen zeer weinig of zelfs geen) om zich te vestigen. </li><li> Breng de bovenste single-celsuspensie om een ​​nieuwe 15-ml-buis, met achterlating van vestigde stukjes weefsel. Bontther verwatering van de celsuspensie maximaal 10-12 ml met Neurobasal/B27 volledig medium. </li><li> Mengen en verdund cellen geteld door 10 pi celsuspensie 490 pi 50x tellen oplossing (zie tabel III) in 1,5 ml eppendorfbuisje. </li><li> Plaat cellen PDL-gecoate platen in de dichtheid van 5,0 x 10 4 / cm 2. Als nucleofectie wordt uitgevoerd, raden uitplaten de cellen bij een hogere concentratie (8-10 x 10 4 / cm 2). </li><li> Normaal gesproken hebben we ontleden 9-10 foetussen per experiment, aangezien ongeveer 13 x 10 6 neuronen zijn afgeleid van elke E17 foetus. Als er meer embryo&#39;s nodig zijn, ervoor te zorgen dat de hele procedure niet meer dan twee uur duren. </li><li> Desgewenst 24 uur na isolatie kan 10 uM van cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) toegevoegd aan elke schotel, zodat gliacellen verhinderd kan worden. Toch is deze stap niet nodig, aangezien Neurobasal/B27 medium remt gliale proliferatie, Volgens de aanbevelingen van de fabrikant (Invitrogen / Gibco). </li><li> Neuronen kan worden gebruikt voor proeven na 4-5 dagen in vitro, hoewel Dit ligt op de gewenste differentiatiestadium. Wij hebben gekweekte neuronen tot 4 weken zonder een significante afname in overleving (figuur 1). </li><li> Voor uitgebreide kweken, vervang dan het kweken van medium elke week met vers bereide Neurobasal/B27 volledig medium. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Neuronen gekweekt op glazen kamer dia&#39;s worden onderworpen aan immunocytochemie. Figuur 1 toont een typisch beeld van een corticale neuron vastgesteld na vijf dagen kweken en immunolabeled met anti-MAP-2 antilichaam neuronale processen vertonen. Figuur 2 toont een representatief beeld van een rat hippocampal neuron na 3 weken in cultuur. De neuronale morfologie van een volledig gedifferentieerde cel wordt gemarkeerd door MAP-2 immunolabeling (MAP-2 neuronale marker, muis monoklonaal antilichaam kloon AP-20, Gene Tex, Irvine, CA), na een standaard procedure, zoals eerder beschreven 1. De beelden werden zichtbaar gemaakt met de Nikon Eclipse E400 rechtop fluorescentiemicroscoop uitgerust met EXI aqua camera (Qimaging), gemotoriseerde Z-as, en SlideBook5 aankoop / deconvolutie software (Intelligent Imaging Innovations, Inc, Denver, CO). Een reeks van drie-dimensionale beelden van elk beeld werd deconvoluted een tweedimensionaal beeld en opgelost door aanpassing van de signaal afgesneden tot nabij maximale intensiteit aan oplossing te verhogen. Figuur 3 toont zuiverheid van neuronale kweken. Eiwit lysaten werden verkregen van DIV7 rat neuronale culturen (CTX) en van een geval van menselijke glioblastoom (GBM). Zoals verwacht, de neuronale lysaat is sterk positief voor de neuronale eiwitten MAP-2 en negatief voor de astrocytaire marker GFAP, terwijl de GBM eiwit lysaat negatief is fof MAP-2 en positief voor GFAP. Hoewel in ons protocol hebben we gebruik gemaakt van Hibernate E voor enkele jaren als ontleden en spoelen medium, onlangs hebben we verkend van een extra en zeer praktisch gebruik van om hersenweefsel te behouden voor verder gebruik. Figuur 4 illustreert een dag in vitro 5 (DIV5) cultuur van de rat corticale neuronen geïsoleerd van cortex bewaard op 4 ° C gedurende een week in de sluimerstand E + B27 na hun oorspronkelijke dissectie van de embryo&#39;s. Neuronen uitgeplaat op een glazen twee kamers dia bekleed met PDL en laminine zoals eerder beschreven. De verworven beeld werd deconvoluted met SlideBook5 verwerving / deconvolutie software zoals hierboven beschreven (figuur 2). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig1.jpg" /> Figuur 1. Representatief beeld van een corticaal neuron nucleofected met pmaxGFP (Amaxa, Lonza, Walkersville, MD) en immunolabeled met MAP-2 Antilichaam, in het rood. Originele vergroting 100x. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig2.jpg" /> Figuur 2. Representatief beeld toont MAP-2 immunokleuring, in rood, van de hippocampus neuronen na 3 weken in de cultuur. DAPI vlekken, in de kleuren blauw, toont cellulaire kernen. Originele vergroting 40x. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig3.jpg" /> Figuur 3. Western blot toont zuiverheid van neuronale celkweken. 30 ug rat neuronale en menselijke GBM eiwit lysaten werden gescheiden door elektroforese en onderworpen aan Western blot analyse volgens standaard procedures 1. Anti-MAP-2 was een konijn polyklonaal van Cell Signaling (Danvers, MA), anti-GFAP antilichaam was een muize-monoclonaal van Chemicon (Millipore, Billerica, MA) en muizen monoclonale anti-GRB2-antilichaam van BD Transduction Laboratories ( Sparks, MD). GRB2 werd gebruikt als een laad controle. </p&gt; <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig4.jpg" /> Figuur 4. Representatieve beelden dagen in vitro 5 (DIV5) rat corticale neuronen verkregen corticaal links in de slaapstand E + B27 bij 4 ° C gedurende een week na de dissectie. A) fase contrast van neuronen gekweekt op een glazen twee kamers schuif. Originele vergroting 20X. B) Immunofluorescentie die expressie van MAP-2 in neuronale processen, in het groen, de cultuur was negatief voor de astrocytaire marker GFAP. DAPI vlekken, in de kleuren blauw, geeft aan cellulaire kernen. Originele vergroting 40x.

<ol><li>Aprea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin-mediated+binding+of+human+immunodeficiency+virus-1+Tat+to+the+cytoskeleton+causes+proteasomal-dependent+degradation+of+microtubule-associated+protein+2+and+neuronal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage.</a> J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).</li>
<li>Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+rat+post-natal+and+fetal+brainstem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).</li>
<li>Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+serum-free+culture+of+late+fetal+and+early+postnatal+rat+brainstem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).</li>
<li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+B27%2Fneurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum%2C+substantia+nigra%2C+septum%2C+cerebral+cortex%2C+cerebellum%2C+and+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. , The MIT Press. Cambridge. (1998).</li>
<li>Eletto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+SNAP25+expression+by+HIV-1+Tat+involves+the+activity+of+mir-128a%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a.</a> J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).</li>
<li>Gualco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-IR-dependent+expression+of+Survivin+is+required+for+T-antigen-mediated+protection+from+apoptosis+and+proliferation+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors.</a> Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).</li>
<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+differentiation+of+adult+neuronal+progenitor+cells+transplanted+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).</li>
<li>Keyser, D. O., Pellmar, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+in+the+hippocampus%3A+critical+role+for+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells.</a> Glia. 10, 237-243 (1994).</li>
<li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 (1997).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De werkwijze van ontleding en cultuur rat hippocampale en corticale neuronen beschreven kan uitvoeren experimenten met nagenoeg zuiver neuronale kweken gekweekt in een chemisch gedefinieerd medium (figuur 3). Hoewel protocollen voor het kweken van nagenoeg zuivere neuronen in serum-vrij medium zijn eerder beschreven 2,3,4 er belangrijke wijzigingen in onze methode. Anders dan de traditionele protocollen (dat wil zeggen Banker et al..) 5, hebben we vervangen door trypsine met TrypLE...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Concentratie </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> 98% </td></tr><tr><td> B27 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 0,5 mM </td></tr></tbody></table> Tabel I. Neurobasal/B27 volledig medium. <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Concentratie </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 16 mM </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 22 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 160 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 2 </td><td> 0,22 mM </td></tr><tr><td> Gentamicine </td><td> 50 ug / ml </td></tr&gt; <tr><td> Fungizone </td><td> 250 ng / ml </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7,4 </td></tr><tr><td> Osmolariteit </td><td> 320-330 mOsm </td></tr></tbody></table> Tabel II. Dissection medium. <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volume (il) </td></tr><tr><td> Neurobasal/B27 complete medium </td><td> 240 </td></tr><tr><td> Trypanblauw Stain 0,4% </td><td> 250 </td></tr><tr><td> Totaal </td><td> 490 </td></tr></tbody></table> Tabel III. 50x tellen oplossing. <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Cat. aantal </td></tr><tr><td> Hibernate E </td><td> Brainbits </td><td> 767171 </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Gentamicinesulfaat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td></tr><tr><td> Glutamax 200 mM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> TrypLE Express w / o fenolrood </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 12604 </td></tr><tr><td> Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C6645 </td></tr><tr><td> Poly-D-lysine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminine 1 mg / ml </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> Trypanblauw Stain 0,4% </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15250 </td></tr></tbody></table&gt; Tabel IV. Specifieke reagentia. <table border="1"><tbody><tr><td> Uitrusting </td><td> Vennootschap </td><td> Cat. aantal </td></tr><tr><td> Stereo Microscoop </td><td> Olympus </td><td> SZ61 </td></tr><tr><td> Grote tang </td><td> FST </td><td> 11022-14 </td></tr><tr><td> Fijne punt tang </td><td> Moria </td><td> MC40B </td></tr><tr><td> Micro fijne punt tang </td><td> Moria </td><td> MC31 </td></tr><tr><td> Haarscherpe schaar </td><td> Roboz </td><td> RS-6820 </td></tr><tr><td> Micro ontleden schaar </td><td> FST </td><td> 91460-11 </td></tr><tr><td> Micro ontleden Gebogen schaar </td><td> FST </td><td> 14067-11 </td></tr><tr><td> Glas 2-kamer dia&#39;s </td><td> Lab-Tek </td><td> 154461 </td></tr><tr><td> 60 mm schaaltjes </td&gt; <td> BD Falcon </td><td> 353002 </td></tr><tr><td> 100 mm schaaltjes </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 15 ml buizen </td><td> BD Falcon </td><td> 352099 </td></tr><tr><td> 1,5 ml cryo-tube flacon </td><td> Nunc </td><td> 375353 </td></tr></tbody></table> Tabel V. specifieke apparatuur.

isolatie en cultuur van rat embryonale neurale cellen: een quick-protocol

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We zijn het beschrijven van een snelle methode om zich te distantiëren en cultuur hippocampus of corticale neuronen van E15-17 rat embryo&#39;s. De procedure kan met succes worden toegepast voor de isolatie van muizen en menselijke primaire neuronen en neurale progenitoren. Los neuronen worden bijgehouden in serum-vrij medium tot enkele weken. Deze culturen gebruikt worden voor nucleofectie, immunocytochemie, nucleïnezuren bereiding en elektrofysiologie. Oudere neuronale kweken ook worden getransfecteerd met een goede rendement van lentivirale transductie en minder efficiënt, met calciumfosfaat of lipide-gebaseerde methoden zoals lipofectamine.

We beschrijven een snelle methode voor het isoleren en cultuur hippocampus en corticale neuronen van knaagdieren embryo&#39;s. Dit protocol stelt ons in staat uit te voeren experimenten waarbij bijna zuivere neuronale culturen zijn vereist.

Isolatie en Cultuur van Rat Embryonale neurale cellen: een Quick-protocol

Wij beschrijven een snelle methode om hippocampale of corticale neuronen uit rattenembryo's van E15-17 te dissociëren en te cultiveren. De procedure kan worden toegepast ...

Het algemene doel van deze procedure is om corticale of hippocampale neuronen te isoleren en te kweken onder serumvrije condities. Dit wordt bereikt door eerst de rattenembryo's te dissekeren om de cortices of hippocampi te verkrijgen. De tweede stap is het incuberen van het hersenweefsel met TrypLE Express voor een milde enzymatische digestie.Vervolgens worden de weefsels gespoeld met Hibernate E en mechanisch getritureerd in volledig kweekmedium. Om een suspensie van enkele cellen te verkrijgen, is de laatste stap het tellen en uitplaten van de gedissocieerde neuronen op met poly-D-lysine gecoate schaaltjes of op met poly-D-lysine en laminine gecoate glazen objectglazen. Uiteindelijk maakt deze methode de isolatie en kweek van neuronen mogelijk onder serumvrije omstandigheden en zonder gliale ondersteuning.Neuronale culturen kunnen worden gebruikt voor immunochemie, de preparatie van nucleïnezuren en elektrofysiologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat we trypsine hebben vervangen door een milder enzym. We hebben het mechanisch bewerken van het weefsel vóór de enzymatische digestie weggelaten, evenals de behandeling met DNase.

isolation-and-culture-of-rat-embryonic-neural-cells-a-quick-protocol

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een alternatieve manier van isoleren van muis embryonale motorneuronen van het ruggenmerg wordt beschreven. De methode houdt rekening met het feit dat de lectine kan binden aan de lage affiniteit zenuw groeifactor receptor p75NTR. Deze lectine-based preplating kan een zuivering vergelijkbaar met die met een specifiek antilichaam tegen de p75NTR.

Lectine-based Isolatie en cultuur van de muis embryonale motoneuronen

Isolatie van embryonale neurale lijst van de neurale buis vergemakkelijkt het gebruik...

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

This video presents a method for isolating neural stem/progenitor cells from the periventricular tissue of the spinal cord in adult rats. The technique includes incubating the tissue fragments in a solution containing proteolytic enzymes to disrupt the extracellular matrix and release the cells. Subsequently, the released cells are plated in a medium containing specific growth factors that enhance neural stem/progenitor proliferation and promote aggregation into three-dimensional neurospheres.

Isolation of Neural Stem Progenitor Cells from the Spinal Cord Periventricular Region of an Adult Rat

The video demonstrates the process of isolating and culturing dopamine neurons from the midbrain of mouse embryos. The isolated ventral midbrain floors are dissociated using enzymes. The resulting dopamine neurons are harvested and transferred into micro-islands inside multi-well plates. The cells are incubated with a dopamine neuron medium to maintain the cells at a high density inside the micro-islands.

Isolation and Culture of Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

Een protocol om een co-cultuursysteem te genereren dat bestaat uit neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), primaire corticale neuronen en astrocyten wordt beschreven. Dit co-cultuursysteem maakt detectie mogelijk van de vorming van synaptische contacten en circuits tussen nieuwe, iPSC-afgeleide neuronen en reeds bestaande corticale neuronen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen.

Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

Het volwassen zoogdierspinaalmerg bevat neurale stam-/voorlopercellen (NSPC's) die kunnen worden geïsoleerd en uitgebreid in cultuur. Dit protocol beschrijft het oogsten, isoleren, kweken en passeren van NSPC's die zijn gegenereerd uit de periventriculaire regio van het volwassen ruggenmerg van de rat en van menselijke orgaantransplantatiedonoren.

Isolatie van neurale stamcellen / stamcellen uit de periventriculaire regio van de volwassen rat en Human Spinal Cord

We wijzigen en implementeren van een eerder gepubliceerd protocol beschrijft de snelle, reproduceerbare en efficiënte differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) in prikkelende corticale neuronen 12. Specifiek onze modificatie maakt regeling van neuronale celdichtheid en gebruik op micro-electrode arrays elektrofysiologische eigenschappen op netwerkniveau meten.

Rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Hier presenteren we een protocol voor Ca2 + imaging in zenuwcellen en gliacellen, waarmee de dissectie van Ca2 + signalen bij subcellular resolutie. Dit proces is van toepassing op alle celtypes waarmee de expressie van genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren.

Dissectie van lokale Ca2 + signalen in gekweekte cellen door membraan-gerichte Ca2 + indicatoren

Dit artikel beschrijft de isolatie en het kweken van embryonale rat sympathische neuronen van de superieure cervicale ganglia. Het biedt ook gedetailleerde protocollen voor immunocytochemische kleuring en voor de voorbereiding van neuronale extracten voor massaspectrometrische analyse.

Culturing Rat Sympathische Neuronen van Embryonale Superior Cervicale Ganglia voor morfologische en proteomische analyse

Hier presenteren we een eenvoudige aanpak met behulp van specifieke cultuurmedia die de oprichting van neuron- en astrocytenverrijkte culturen, of neuron-glia culturen uit de embryonale cortex, met hoge opbrengst en reproduceerbaarheid mogelijk maakt.

Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie

Leer een snelle methode voor het isoleren en kweken van embryonale ratneuronen in serumvrije omstandigheden. Dit protocol levert zuivere neuronale culturen voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Isolatie en Cultuur van Rat Embryonale neurale cellen: een Quick-protocol

Meer video's verkennen