Name: High-throughput synthese van koolhydraten en functionalisering van polyanhydride Nanodeeltjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: Leer de geautomatiseerde synthese van oligosacchariden en functionalisering van polyanhydride nanodeeltjes voor gerichte aflevering aan antigeen-presenterende cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag de US Army Medical Research en Materieel Command bedanken (Grant # W81XWH-10-1-0806) en de National Institutes of Health (Grant # U19 AI091031-01 en Grant # 1R01GM090280) voor financiële steun. BN erkent de Balloun hoogleraar in de chemische en biologische engineering en NLBP erkent de Wilkinson Lectoraat Interdisciplinair Engineering. Wij danken Julia Vela voor haar assistentie bij het uitvoeren van de nanodeeltjes functionalisering experimenten.

1. High-throughput Carbohydrate Synthesis <ol><li> Voorafgaand aan de geautomatiseerde synthese van dimannoside, een adequaat beschermd suiker donor, meestal trichloroacetimidate en acceptor, vooral een alkenyl fluorous alcohol, worden gesynthetiseerd op de bank-top. </li><li> Een programma is geschreven voor de geautomatiseerde synthese van dimannoside. Een schematische weergave van de fundamentele geautomatiseerd proces is in figuur 2. In het programma wordt gewaarborgd dat bij de toevoeging van de promoter, het mengsel van donor en acceptor geroerd ten minste 30 minuten. </li><li> Oplossingen van de synthetische donor, acceptor trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate worden in dichloormethaan. Tolueen en dichloormethaan worden het meest gebruikt voor glycosylering reacties. </li><li> Ook worden de oplossingen van reagentia voor de deprotectie van tijdelijke beschermende groepen in 80% methanol en 100% methanol. </li><li> Voor de start van het programma, dat de bijbehorende typeive luchtvochtigheid in de kamer is 30% of lager in de automatisering kamer. Een hoge luchtvochtigheid is schadelijk voor de glycosylering reacties. </li><li> Zodra het programma is gestart, de robotarm draagt ​​de oplossingen van donor en acceptor in de reactieflacon opeenvolgend. Vervolgens wordt het mengsel 30 minuten geroerd. </li><li> Vervolgens robotarm overdraagt ​​0,2 tot 0,3 equivalenten van trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate in het mengsel gewoonlijk bij kamertemperatuur maar lagere temperaturen als -20 ° C worden bereikt. Het reactiemengsel wordt 30 minuten geroerd. </li><li> Na 30 minuten wordt de reactie gestopt en een kleine hoeveelheid verwijderd om de reactie voortgang. Indien niet volledig kan de reactie worden voortgezet en uiteindelijk vereiste tijd kan worden gewijzigd. </li><li> Zodra de reactie is voltooid, wordt het reactiemengsel naar de fluorous vaste fase extractie (FSPE) patronen met C 8 F 17 gemodificeerde silica gel voor zuivering. </li><li> De karruggen eerst gewassen met 80% methanol-water mengsel (8 ml) ontdoen van de niet-fluorous fractie. </li><li> Vervolgens patronen worden gewassen met 100% methanol in de gewenste fluorous-tag verkrijgen. Als extra zuiveringsstap gewenst kan de machine worden gestopt en het reactieproduct (en) verwijderd zuivering door extra middelen. </li><li> Na de zuivering cyclus, de robotarm verdeelt natriummethoxide in de reactieflacon. De reactie wordt gedurende 2 uur. Indien niet volledig kan de reactie weer voortgezet gedurende een langere periode en tenslotte de gewenste ingestelde tijd kan worden gewijzigd. </li><li> Na de voltooiing van de reactie wordt het produkt gezuiverd door FSPE en vervolgens onderworpen aan oplossing in watervrije tolueen, gevolgd door verdamping restwater te verwijderen. </li><li> Vervolgens wordt de cyclus (stap 6 tot 13) wordt herhaald tot de gewenste ketenlengte wordt verkregen voor de doelmolecule. </li><li> De beschermde product dat wordt verkregen van de automatisering is then verder gezuiverd en volledig gekenmerkt door technieken, zoals kernmagnetische resonantie (NMR) spectroscopie. Volledige verwijdering van de bescherming (het verwijderen van alle resterende beschermende groepen) van de uiteindelijke doelstelling molecuul wordt dan afgerond buiten de automatisering platform in de regel, omdat het meestal gaat het explosieve waterstofgas en palladium. De laatste ontscherming stap werd uitgevoerd op bench-top buiten de automatisering platform. De eerste stap is ozonolyse van de dubbele binding in fluorous tag gevolgd door oxydatie van de verkregen aldehyde een carbonzuur. Het product werd gezuiverd door kolomchromatografie. De laatste stap is ontscherming van benzyl ethergroepen met palladium-gekatalyseerde hydrogenering. Het product werd door celite pad om zich te ontdoen van palladium tot zuiver eindproduct te krijgen. </li></ol> 2. High-throughput Nanodeeltje Oppervlakte functionalisering <ol><li> High-throughput polymeersynthese en nanodeeltjes fabricage wordt uitgevoerd volgens dezelfde protocol en robot ingesteld beschreven door Petersen et al. 19. Het copolymeer systemen voor deeltjes fabricage gebaseerd op sebacinezuur (SA) en 1,6-bis (para-carboxyphenoxy) hexaan (CPH) en 1,8-bis ( para-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) en CPH. Een schematische weergave van de robot gebruikte afzetting inrichting is weergegeven in Figuur 1b. </li><li> Na nanodeeltjes fabricage is de houder met buizen met de nanodeeltjes bibliotheek opnieuw aan de actuator fase. </li><li> Voor bevestiging van koolhydraten naar het oppervlak van polyanhydride deeltjes, wordt een amine-carbonzuur koppelingsreactie 20 bestaande uit twee opeenvolgende reacties uitgevoerd. </li><li> Voor de eerste reactie heeft de injectiespuit in de eerste programmeerbare spuitpomp is gevuld met 10 equivalenten (eq.) (equivalenten molaire carbonzuur concentratie op deeltjesoppervlak) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (EDC) en 10 eq. ethyleendiamine in een waterige oplossing, terwijl de injectiespuit in de tweede programmeerbare spuit pomp geladen met 12 eq. N-hydroxysuccinimide (NHS) in waterige oplossing. </li><li> Met behulp van de LabVIEW programma worden reagens suspensies gestort in het nanodeeltje bibliotheek *. </li><li> Vervolgens wordt elk monster gesoniceerd (30 s bij 40 Hz) en de buishouder wordt losgekoppeld van de robotarm platform. </li><li> Nanodeeltjes suspensies worden gedurende 9 uur ** met constante rotatie bij 4 ° C. </li><li> Na reactietijd is voltooid worden de buizen gecentrifugeerd (12000 g gedurende 5 min) en terug naar de robot station twee wasstappen voeren. </li><li> Voor wassen, een spuit blijft leeg en geladen in de eerste programmeerbare spuitpomp, terwijl de spuit in de tweede spuit pomp is gevuld met koud water. De bovenstaande vloeistof in elke buis wordt teruggetrokken in de lege spuit en de tweede pomp deposito&#39;s koud water. </li><li> Homogenisering van nanodeeltjes suspensie werd uitgevoerd zoals beschreven in stap 2.6. Buizen worden vervolgens gecentrifugeerd (12000 g gedurende 5 min) en een tweede wasstap werd uitgevoerd zoals beschreven in stap 2.9. </li><li> Voor de tweede reactie zijn twee depositie stappen gebruikt. In de eerste depositiestap 12 eq. EDC worden geladen met een pomp en 12 eq. van NHS worden geladen met de tweede pomp. </li><li> De tweede depositie stap omvat 10 eq. een specifieke saccharide de eerste en tweede pompen (bijvoorbeeld, galactose, lactose of di-mannose) *** en een derde pomp met 10 eq. glycolzuur (gebruikt als controle ****). </li><li> Nanodeeltjes suspensies gehomogeniseerd zoals beschreven in stap 2.6 en geïncubeerd 9 uur bij constante rotatie bij 4 ° C. </li><li> Na het tijdstip van de reactie is voltooid, wordt een wasstap uitgevoerd zoals beschreven in stap 2.8, 2.9 en 2.10. </li><li> Het gefunctionaliseerde nanodeeltjes bibliotheek wordt vervolgens geplaatst in een vacuümkamer drogen ten minste 2 uur. </li><li> De gefunctionaliseerde nanodeeltjes zijn dan karakterseerd door röntgen foto-elektron spectroscopie en een hoge doorvoer fenol-zwavelzuur assay het oppervlak samenstelling en concentratie van de saccharide respectievelijk bepalen. Scanning elektron microscopie en dynamische lichtverstrooiing worden gebruikt om de deeltjesgrootte, deeltjesgrootteverdeling en oppervlaktelading bepalen. </li></ol> Opmerkingen: * Deposition volumes variëren met de massa van nanodeeltjes in elke buis. ** Reactietijden voor de eerste en tweede reacties kunnen worden gewijzigd in de laatste saccharide concentratie aan te passen. Elke *** saccharide wordt gestort in reageerbuizen afhankelijk van de gewenste fractie. **** Voor de specifieke reactie in deze studie voor de bevestiging van koolhydraten is glycolzuur als linker controle omdat ontschermde sacchariden al deze molecule covalent, waardoor verdere bevestiging van nanodeeltjes oppervlak. 3. Representatieve resultaten De fully beschermd dimannoside figuur 2 werd gesynthetiseerd volgens automatiseringsplatform. De gesynthetiseerde verbinding werd gekenmerkt met 1H NMR een VXR 400 MHz spectrometer met CDCI3 als oplosmiddel. De NMR spectrum is weergegeven in figuur 3. Met behulp van de hoge verwerkingscapaciteit nanodeeltjes fabricage en funktionalisering van polyanhydride nanodeeltjes hierin beschreven, is de bevestiging van dimannose, lactose en galactose uitgevoerd met succes 10, 11. Met behulp van deze set-up, werden optimale reactie-omstandigheden (dat wil zeggen, reactietemperatuur en tijd) die de gewenste nanodeeltjes functionalisering en morfologie te bereiken. Wanneer de reactie werd uitgevoerd bij 4 ° C in plaats van kamertemperatuur, een vermindering van nanodeeltjes aggregatie waargenomen door SEM (data niet getoond). Tabel 1 toont representatieve resultaten van de karakterisering van gefunctionaliseerde 50:50 CPTEG: CPH nanodeeltjes met een di-mannose oflactose, gesynthetiseerd bij 4 ° C. De gegevens tonen een toename van de gemiddelde diameter nanodeeltjes door functionalisering. Terwijl de niet-gefunctionaliseerde nanodeeltjes een negatieve zeta potentieel van ongeveer. -20 MV, de gefunctionaliseerde deeltjes lieten een positief zeta potentiële waarde, waaruit blijkt succesvol functionalisering van de nanodeeltjes oppervlak. Lactose en di-mannose beide neutrale suikers, maar vrije aminegroepen de ethyleendiamine linker gebruikt om de sacchariden hechten kan verantwoordelijk van de positieve zetapotentiaal. Reactietijd is een andere variabele die zowel de uiteindelijke morfologie van de nanodeeltjes en de mate van de bereikte suiker beslag zou kunnen beïnvloeden. Door de reactietijd kan de uiteindelijke suikergehalte aan de nanodeeltjes oppervlak bestuurd als figuur 4A. Zoals verwacht, de concentratie van dimannose op het oppervlak van 50:50 CPTEG: CPH nanodeeltjes verhoogdde totale reactietijd en bereikte een maximum na 18 uur. Nanodeeltjes gefunctionaliseerd met de 24 uur totale reactietijd werden gebruikt om hun vermogen om CLRs richten op de muis beenmerg afgeleide dendritische cellen (DC&#39;s) te evalueren. Flow cytometrie werd gebruikt om de expressie van twee CL receptoren (zoals CIRE (CD209, DC-SIGN) en mannose receptor (CD206)) na stimulatie met niet-gefunctionaliseerde en lactose en di-mannose gefunctionaliseerde nanodeeltjes (Figuur 4B) te evalueren. Een hogere expressie van beide receptoren, hetgeen een indicatie effectieve targeting werd verkregen wanneer cellen werden gestimuleerd met zowel lactose en di-mannose gefunctionaliseerde nanodeeltjes. Echter, di-mannose-gefunctionaliseerde deeltjes een hogere expressie waarin een specificiteit van deze ligand voor de receptoren die werden bestudeerd. <table border="1"><tbody><tr><td> Nanodeeltje soort </td><td> Gemiddelde deeltjesdiameter (nm) </td><td> Avewoede Particle ζ-Potentieel (mV) </td></tr><tr><td> Niet-gefunctionaliseerd </td><td> 162 ± 43 </td><td> -20 ± 0,6 </td></tr><tr><td> Lactose </td><td> 235 ± 34 </td><td> 26 ± 2,4 </td></tr><tr><td> Di-mannose </td><td> 243 ± 32 </td><td> 30 ± 4,2 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Nanodeeltje karakterisering. Niet-gefunctionaliseerd en gefunctionaliseerde werden gekarakteriseerd door quasi-elastische lichtverstrooiing en zetapotentiaal metingen. Deeltjesgrootte gegevens stellen het gemiddelde ± standaardafwijking (SD) van dynamische lichtverstrooiing gegevens in drie onafhankelijke experimenten. Zeta potentieel gegevens stellen het gemiddelde waarde ± SD van drie onafhankelijke metingen. Verandering in het teken van het zeta potentieel laat zien dat suiker was efficiënt geconjugeerd aan de CPTEG 50:50: CPH nanodeeltjes oppervlak. <img alt="Figuur 1" src<html> = &quot;/ Files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg&quot; /&gt; Figuur 1. (A) Grafische voorstelling van de aanpak met koolhydraat functionalisering van polyanhydride nanodeeltjes en een voorbeeld van de gefunctionaliseerde nanodeeltjes bibliotheken kunnen worden ontworpen met de beschreven high-throughput benadering. (B) Schematische weergave van de geautomatiseerde depositie inrichting gebruikt voor deeltjes functionalisering die bestaat uit (i) drie NO 1000 pompen, (ii) een robot fase geïntegreerd door twee aandrijvingen (Zaber) een beweging in de x-richting en de andere voor beweging in de y-richting, (iii) een tweede fase robot met twee naburige rekken (geschikt voor buizen en cuvetten) bestaande uit drie actuatoren, een voor elke richting (x, y en z). De pompen en in totaal vijf aandrijvingen in serie geschakeld. Aandrijvingen en pompen worden bediend door een computer met behulp van LabVIEW software. Dit schema is niet op schaal.arge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier voor een grotere afbeelding weer te geven. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig2.jpg" /> Figuur 2. Grafische weergave van de geautomatiseerde iteratieve synthese van koolhydraten met behulp van mannose als voorbeeld. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig3.jpg" /> Figuur 3. 1H NMR van het beschermde dimannoside. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig4.jpg" /> Figuur 4. (A) Effect van reactietijd op nanodeeltjes oppervlakteconcentratie van saccharide. In de getoonde gegevens 50:50 CPTEG: werden CPH nanodeeltjes gefunctionaliseerd met dimannose op verschillende reactiesnelheden en de reactie werd uitgevoerd bij 4 ° C. Het gemiddelde en de standaardafwijking van twee onafhankelijke functionalisering experimenten wordt getoond. (B) lactose en di-mannose gefunctionaliseerde nanodeeltjeseffectief doelwit DC-SIGN (CIRE, CD209) en mannose receptor (CD206) op beenmerg-afgeleide dendritische cellen zoals aangetoond door de verhoogde expressie van deze twee markers na stimulatie met gefunctionaliseerde 50:50 CPTEG: CPH nanodeeltjes in vergelijking met de verkregen uitdrukking niet-gefunctionaliseerde deeltjes.

<ol><li>Zepp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+vacine+design-lessons+from+nature%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Principles of vacine design-lessons from nature.</a> Vaccine. 28, C14-C24 (2010).</li>
<li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Lopac, S. K., Phanse, Y., Carrillo-Conde, B., Ramer-Tait, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydride+microparticles+enhance+dendritic+cell+antigen+presentation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation.</a> Acta Biomater. 7, 2857-2864 (2011).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Petersen, L. K., Ramer-Tait, A. E., Broderick, S. R., Kong, C. S., Ulery, B. D., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polymer+chemistry+and+fabrication+method+on+protein+release+and+stability+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+B%22%5BJournal%5D)">Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. 91, 938-947 (2009).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+Consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: Consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Determan, A. S., Lin, V. S. Y., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Controlled Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Chavez-Santoscoy, A., Roychoudhury, R., Ramer-Tait, A. E., Pohl, N. L. B., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+the+immune+response+of+alveolar+macrophages+by+targeting+different+C-type+lectin+receptors+using+%22pathogen-like%22+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tailoring the immune response of alveolar macrophages by targeting different C-type lectin receptors using "pathogen-like" amphiphilic polyanhydride nanoparticles.</a> Biomaterials. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Carrillo-Conde, B., Song, E. -H., Chavez-Santoscoy, A., Phanse, Y., Ramer-Tait, A., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mannose-functionalized+%22pathogen-like%22+polyanhydride+nanoparticles+target+C-type+lectin+receptors+on+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Mannose-functionalized "pathogen-like" polyanhydride nanoparticles target C-type lectin receptors on dendritic cells.</a> Mol. Pharmaceutics. 8, 1877-1886 (2011).</li>
<li>Carrillo-Conde, B., Schiltz, E., Torres, M. P., Yu, J., Phillips, G., Minion, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphipilic+polyanhydrides+for+stabilization+of+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Amphipilic polyanhydrides for stabilization of Yersinia pestis antigens.</a> Acta. Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
<li>Reddy, S. T., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+dendritic+cells+with+biomaterials%3A+developing+the+next+generation+of+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting dendritic cells with biomaterials: developing the next generation of vaccines.</a> Trends Immunol. 27, 573-580 (2006).</li>
<li>Higashi, N., Fujioka, K., Denda-Nagai, K., Hashimoto, S., Nagai, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+C-type+lectin+specific+for+galactose%2FN-acetylgalactosamine+is+an+endocytic+receptor+expressed+on+monocyte-derived+immature+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The macrophage C-type lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is an endocytic receptor expressed on monocyte-derived immature dendritic cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 20686(2002).</li>
<li>Geijtenbeek, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+through+C-type+lectin+receptors%3A+shaping+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Signalling through C-type lectin receptors: shaping immune responses.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 465-479 (2009).</li>
<li>Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+oligosaccharide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Automated oligosaccharide synthesis.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 19-28 (2008).</li>
<li>Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Carbohydrate+Synthesis+as+Platform+to+Address+Fundamental+Aspects+of+Glycobiology-Current+Status+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Carb.+Res%22%5BJournal%5D)">Automated Carbohydrate Synthesis as Platform to Address Fundamental Aspects of Glycobiology-Current Status and Future Challenges.</a> Carb. Res. 343, 1889-1896 (2008).</li>
<li>Jaipuri, F. A., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+solution-phase+automated+iterative+synthesis%3A+fluorous-tag+assisted+solution-phase+synthesis+of+linear+and+branched+mannose+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward solution-phase automated iterative synthesis: fluorous-tag assisted solution-phase synthesis of linear and branched mannose oligomers.</a> Org. Biomol. Chem. 6, 2686-2691 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Chavez-Santoscoy, A., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+synthesis+of+and+high-throughput+protein+release+from+polymer+film+and+nanoparticle+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Combinatorial synthesis of and high-throughput protein release from polymer film and nanoparticle libraries.</a> J. Vis. Exp. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Song, E. -H., Osanya, A. O., Petersen, C. A., Pohl, N. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+multivalent+tuberculosis+and+Leishmania-associated+capping+carbohydrates+reveals+structure-dependent+responses+allowing+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of multivalent tuberculosis and Leishmania-associated capping carbohydrates reveals structure-dependent responses allowing immune evasion.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 11428-11430 (2010).</li>
<li>Hakamori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+glycosylation+in+tumor+and+tumor+associated+carbohydrate+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant glycosylation in tumor and tumor associated carbohydrate antigens.</a> Adv. Cancer Res. 59, 257-331 (1989).</li>
<li>Atherton, T., Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtherton%2C+T+%22Solid-phase+peptide+synthesis%3A+a+practical+approach%22">Solid-phase peptide synthesis: a practical approach</a>. , Oxford Univ Press. Oxford, UK. (1999).</li>
<li>Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+machines%3A+DNA+chemistry+and+the+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis machines: DNA chemistry and the uses.</a> Science. 230, 281-285 (1985).</li>
<li>Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+solid-+phase+synthesis+of+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Automated solid- phase synthesis of oligosaccharides.</a> Science. 291, 1523-1527 (2001).</li>
<li>Ko, K. -S., Park, G., Yu, Y., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+group-based+colorimetric+monitoring+of+fluorous-phase+and+solid-phase+synthesis+of+oligoglucosamines%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protecting group-based colorimetric monitoring of fluorous-phase and solid-phase synthesis of oligoglucosamines.</a> Org. Lett. 10, 5381-5384 (2008).</li>
<li>Pohl, N. L. Automated solution-phase oligosaccharide synthesis and carbohydrate microarrays: development of fluorous-based tools for glycomics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPohl%2C+NL+%22Chemical+Glycobiology%22">Chemical Glycobiology</a>. Chen, X. H. R., Wang, G. P. , American Chemical Society. Washington, DC. 272-287 (2008).</li>
</ol>

NLBP is mede-oprichter en heeft aandelen in de koolhydraat bedrijf LuCella Biosciences, Inc

De werkzaamheid van koolhydraten aangrijpende middelen rechtstreeks nanodeeltjes interacties immuuncellen is eerder aangetoond 10, 11. Eerder onderzoek in laboratoria hebben aangetoond dat specifieke suikers aan polyanhydride nanodeeltjes kunnen verschillende CLRs richten op antigeen presenterende cellen (APC&#39;s), waardoor de activatie van immuuncellen wat belangrijk kan zijn voor verdere T cel activatie 10, 11. Echter, om een ​​optimaal richten op een aantal parameters, zoals de polyanhydride c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Gemotoriseerde XYZ Stage: 3 x T-LSM050A, 50 mm reizen per as </td><td> Zaber Technologies </td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> NE-1000 Single-spuitpomp </td><td> New Era Pump Systems </td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td> Pyrex * Vista * Rimless Herbruikbare Glas Cultuur Tubes </td><td> Corning </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> ASW 1000 </td><td> Chemspeed Technologies </td><td></td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> 776671-35 </td></tr><tr><td> SGE gasdichte Spuiten, Luer Loc </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 509507 </td></tr><tr><td> XL-2000 ultrasoonapparaat </td><td> Qsonica </td><td> Q55 </td></tr><tr><td> Mini-buis rotator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-450-127 </td></tr></tbody></table>

high-throughput synthese van koolhydraten en functionalisering van polyanhydride nanodeeltjes

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinaire aanpak waarbij gebieden zoals materiaal ontwerp, nanotechnologie, chemie, en immunologie moeten worden gebruikt voor het rationeel ontwerpen van vaccins effectief dragers. Nanodeeltjes op basis van platforms kunnen verlengen het voortbestaan ​​van het vaccin antigenen, die zouden kunnen verbeteren vaccin immunogeniciteit 1. Verschillende biologisch afbreekbare polymeren zijn bestudeerd als vaccin bestelwagens 1, in het bijzonder, polyanhydride deeltjes hebben aangetoond dat de mogelijkheid om langdurige afgifte van stabiele eiwit antigenen te geven en antigeen presenterende cellen te activeren en te moduleren immuunreacties 2-12. De moleculaire ontwerp van deze vaccins dragers moet integreren rationele selectie van polymeer eigenschappen en het aanbrengen van geschikte aangrijpende middelen. Hoge-doorvoer geautomatiseerde fabricage van targeting liganden en gefunctionaliseerde deeltjes is een krachtige tool die de mogelijkheid om een ​​breed r studie zal verbeterenange van eigenschappen en zal leiden tot het ontwerp van reproduceerbare vaccin levering apparaten. De toevoeging van targeting liganden kunnen worden herkend door specifieke receptoren op immuuncellen is aangetoond moduleren en op maat immuunresponsen 10,11,13 C-type lectin receptoren (CLRs) zijn patroonherkenning receptoren (PRRS) erkennen dat koolhydraten de oppervlak van pathogenen. Het stimuleren van immuuncellen via CLRs zorgt voor een betere internalisering van antigeen en de daaropvolgende presentatie voor meer T-cel activatie 14,15. Daarom koolhydraatmoleculen een belangrijke rol spelen bij de studie van immuunresponsen, maar het gebruik van deze biomoleculen vaak te lijden van het niet beschikbaar van structureel goed gedefinieerde en pure koolhydraten. Een platform voor het automatiseren op basis van iteratieve oplossing-fase reacties kunnen zorgen voor een snelle en gecontroleerde synthese van deze synthetische moleculen met behulp van uitdagende significant lager bOUWEN blok hoeveelheden dan de traditionele vaste-fase-methoden 16,17. Hierin rapporteren we een protocol voor de geautomatiseerde oplossing-fase synthese van oligosacchariden, zoals mannose-based targeting liganden met fluorous solid-phase extractie voor tussentijdse zuivering. Na de ontwikkeling van geautomatiseerde methoden om het koolhydraat-gebaseerde targeting agent maken we schrijven werkwijzen voor hun bevestiging op het oppervlak van polyanhydride nanodeeltjes toepassing van een automatische robot opstelling die door LabVIEW zoals eerder beschreven 10. Oppervlakte functionalisering met koolhydraten is de effectiviteit aangetoond bij de opsporing van CLRs 10,11 en het verhogen van de doorvoersnelheid van de fabricage methode om opgraven van de complexiteit geassocieerd met een multi-parametrische systeem zal van grote waarde zijn (figuur 1a).

In dit artikel wordt een hoge doorvoer methode voorgesteld voor de synthese van Oligosacchariden en de bevestiging aan het oppervlak van polyanhydride nanodeeltjes voor verder gebruik in voor specifieke receptoren op antigeen-presenterende cellen.

High-throughput synthese van koolhydraten en functionalisering van polyanhydride Nanodeeltjes

Transdisciplinaire benaderingen waarbij vakgebieden zoals materiaalkunde, nanotechnologie, chemie en immunologie betrokken zijn, moeten worden ingezet om rationeel ... te ontwerpen.

In dit videoartikel beschrijven we een nieuw hydro-putprotocol voor de geautomatiseerde synthese van oligosachariden in de vloeistoffase en de functionalisering van poly-anhy-nanodeeltjes. Met deze op koolhydraten gebaseerde targeting-agentia worden eerst koolhydraatmoleculen gesynthetiseerd met behulp van een geautomatiseerd systeem dat gebruikmaakt van synthese in de vloeistoffase in plaats van vaste-fase-synthesizers. Vervolgens worden de oligosacharide-intermediaires gezuiverd via florist, vaste-fase-extractie of FSPE.De geproduceerde koolhydraatmoleculen worden gekarakteriseerd via NMR en vervolgens via carbo-IDE conjugatie gekoppeld aan de polyanhydride nanodeeltjes. Ten slotte worden de koolhydraat-gefunctionaliseerde nanodeeltjes gekarakteriseerd met röntgenfoto-elektronspectroscopie en een hydro-put fenylsulfuurzuur-assay. Uiteindelijk zijn, door gebruik te maken van de hier beschreven hydro-put methodologie, de reactieomstandigheden verkregen om de morfologie van de nanodeeltjes en de koolhydraatdichtheid op het oppervlak van de deeltjes te optimaliseren.Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande methoden, zoals oligosacharide-synthese op een v

high-throughput-synthesis-carbohydrates-functionalization

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Deze methode beschrijft de combinatorische synthese van biologisch afbreekbare polyanhydride film en nanodeeltjes bibliotheken en het high-throughput detectie van proteïneafgifte uit deze bibliotheken.

Combinatoriële Synthese van en high-throughput eiwit Op de markt van Polymer Film en Nanodeeltje bibliotheken

Een efficiënte aanpak voor het bereiden nanovezels ingericht met functionele groepen die specifiek interactie met eiwitten beschreven. De benadering vereist eerst de bereiding van een gefunctionaliseerd polymeer met geschikte functionele groep. De functionele polymeer wordt gefabriceerd in nanovezels door electrospinning. De effectiviteit van de binding van de nanovezels met een eiwitgehalte wordt onderzocht door confocale microscopie.

Procedure voor het vervaardigen van biofunctionele nanovezels

Deze video is een snelle, efficiënte methode om poly (ethyleenglycol) methacrylaat illustreren, waardoor keten polymerisaties en hydrogel synthese. Het zal laten zien hoe je methacrylamide functionaliteiten dezelfde wijze te introduceren in peptiden, detail gemeenschappelijke analytische methoden om functionalisering efficiëntie te beoordelen, suggesties voor het oplossen van problemen en geavanceerde aanpassingen, en tonen typische hydrogel karakterisering technieken.

Microgolven Functionalisering van poly (ethyleenglycol) en On-hars Peptiden voor gebruik in Chain Polymerisaties en Hydrogel Vorming

Een efficiënte, driedelige synthese van RAFT-gebaseerde fluorescerende glycopolymeren, bestaande uit glycomonomeervoorbereiding, copolymerisatie en post-modificatie, wordt gedemonstreerd. Dit protocol kan worden gebruikt om RAFT-gebaseerde statistische glycopolymeren met gewenste structuren te bereiden.

Facile en efficiënte voorbereiding van Tri-component Fluorescent Glycopolymers via-VLOT gecontroleerde polymerisatie

We rapporteren protocollen voor het “polymeriseren” van verschillende soorten polymeer-ingekapselde metaal-nanodeeltjes tot lange ketens van “homo-“ en “co-polymeren”.

Met behulp van polystyreen<em&gt; Block</em&gt; Poly (acrylzuur) -gecoate Metal Nanodeeltjes als monomeren voor hun homo- en co-polymerisatie

We presenteren een geautomatiseerde modulaire methode met hoge doorvoer voor de identificatie en karakterisering van microbiële exopolysachariden op kleine schaal. Deze methode combineert een snelle preselectie om de totale hoeveelheid uitgescheiden polysacchariden te analyseren met een gedetailleerd koolhydraat-vingerafdruk om het snelle screenen van nieuw geïsoleerde bacteriestammen of hele stamcollecties mogelijk te maken.

Geautomatiseerde Modular High Throughput exopolysaccharide Screening Platform Samen met Highly Sensitive Koolhydraten Fingerprint Analysis

Syntheseschema's om zeer stabiele haarvormige nanodeeltjes op basis van houtvezels en functionele biopolymeren op basis van cellulose zijn gedetailleerd beschreven.

Sterk Stabiel, Functioneel Hairy Nanodeeltjes en Biopolymeren uit houtvezels: Towards Sustainable Nanotechnologie

We presenteren een protocol voor de synthese van RGD-gefunctionaliseerde hydrogels als apparaten voor cel- en geneesmiddelafgifte. De procedure omvat koper gekatalyseerde alkyn-azide cycloadditie (CuAAC) tussen alkyn-gemodificeerde polyacrylzuur (PAA) en een RGD-azide-derivaat. De hydrogels worden gevormd met behulp van microgolf-geassisteerde polycondensatie en hun fysisch-chemische eigenschappen worden onderzocht.

De synthese van RGD-gefunctionaliseerde Hydrogels als een instrument voor therapeutische toepassingen

Een modulaire benadering van de synthese van N- glycanen voor bevestiging aan een aluminium oxide-gecoate glazen schuif (ACG dia) als een microarray glycan heeft ontwikkeld en het gebruik ervan voor de profilering van een HIV in grote lijnen neutraliserende antilichamen aangetoond.

Chemo-enzymatische synthese van N- glycanen voor Array ontwikkeling en HIV antilichaam profilering

Dit protocol demonstreert het gebruik van de auto-CHO software voor hiërarchische en programmeerbare One-pot synthese van oligosacchariden. Het beschrijft ook de algemene procedure voor RRV-bepalings experimenten en eenpotglycosylatie van SSEA-4.

Hiërarchische en programmeerbare One-pot oligosaccharide synthese

Eiwitten en aminebevattende liganden kunnen covalent worden gekoppeld aan polysacchariden die worden geactiveerd door het cyanylation-reagens, 1-cyano-4-dimethylaminopyridinetetrafluoroboraat (CDAP), om covalent eiwit (ligand)-polysaccharideconjugaten te vormen. Dit artikel beschrijft een verbeterd protocol voor het uitvoeren van gecontroleerde CDAP-activering bij 0 °C en variërende pH en het uitvoeren van daaropvolgende conjugatie van de geactiveerde polysacchariden.

Activering en conjugatie van oplosbare polysacchariden met behulp van 1-cyano-4-dimethylaminopyridinetetrafluorboraat (CDAP)

Leer de geautomatiseerde synthese van oligosacchariden en functionalisering van polyanhydride nanodeeltjes voor gerichte aflevering aan antigeen-presenterende cellen.

High-throughput synthese van koolhydraten en functionalisering van polyanhydride Nanodeeltjes

Meer video's verkennen