High-throughput synthese van koolhydraten en functionalisering van polyanhydride Nanodeeltjes
July 6th, 2012
In dit artikel wordt een hoge doorvoer methode voorgesteld voor de synthese van Oligosacchariden en de bevestiging aan het oppervlak van polyanhydride nanodeeltjes voor verder gebruik in voor specifieke receptoren op antigeen-presenterende cellen.
In dit videoartikel beschrijven we een nieuw hydro-put-protocol voor de geautomatiseerde oplossingsfase-synthese van oligosachariden en de functionering van poly-anhy-nanodeeltjes. Met deze op koolhydraten gebaseerde targeting-agentia worden eerst koolhydraatmoleculen gesynthetiseerd met behulp van een geautomatiseerd systeem dat gebruikmaakt van oplossingsfase-synthese in plaats van vaste fase-syntheses. Vervolgens worden de oligosacharide-tussenproducten gezuiverd door florist, vaste fase-extractie of FSPE.
De geproduceerde koolhydraatmoleculen worden gekenmerkt door NMR en vervolgens worden ze aan de poly-anhydride-nanodeeltjes gekoppeld door carbo-IDE-conjugatie. Ten slotte worden koolhydraat-gefunctionaliseerde nanodeeltjes gekenmerkt door röntgenfoto-elektronenspectroscopie en een hydro-putt fenylsulfonzuur-assay. Uiteindelijk zijn, door gebruik te maken van de hier beschreven hydro-put-methodologie, de reactieomstandigheden verkregen om de morfologie van de nanodeeltjes en de dichtheid van koolhydraten op het oppervlak van de deeltjes te optimaliseren.
Het belangrijkste voordeel van deze methode boven de bestaande methoden zoals vaste fase-oligosacharidesynthese, is dat in deze methode we een substantieel lagere hoeveelheid bouwstenen gebruiken. In deze methode gebruiken we meestal twee tot drie equivalenten in plaats van 10 tot 20 equivalenten. We kregen het idee voor deze methode toen we de effectiviteit van oppervlakte-effecten, de functionalisering van poly-hydro-nanodeeltjes, demonstreerden met behulp van koolhydraten om ceep-receptoren op anti-denting-cellen te targeten. We wilden vervolgens een hoogdoorvoersysteem ontwerpen dat ons in staat stelt om de meerdere parameters te screenen die betrokken zijn bij de fabricage en toepassing van deze nieuwe dragers.
Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat de ontwikkeling van geautomatiseerde platformen voor de hoogdoorvoersynthese van oligosachariden en hun bevestiging aan polymeerdeeltjes een nieuw onderzoeksgebied is zonder veel documentatie. Voorafgaand aan de geautomatiseerde synthese van diano-zuur. Een geschikt beschermde suikerdonor, meestal tri-chlooraceetamide en een aanvaarder, voornamelijk in Alcon, fluorous alcohol, wordt gesynthetiseerd op de werktafel en bereid in chloormethaan, evenals trimethylsilo, trifluormethaansulfonaat in chloormethaan, 80% methanol en 100% methanol. Zorg ervoor dat de relatieve luchtvochtigheid in de kamer 30% of lager is in de automatiseringskamer.
Hoge luchtvochtigheid is nadelig voor glycosyleringsreacties. De volgende stappen worden uitgevoerd met behulp van een automatiseringsplatform. De eerste glycosylering wordt uitgevoerd met de donor en de florist-alcohol.
Eenmaal voltooid, wordt het resulterende florist-tag-suikermolecuul gezuiverd door FSPE. De tijdelijke beschermende groep wordt vervolgens verwijderd door natrium, methoxide en methanol, en opnieuw wordt het product gezuiverd door FSPE. Daarna wordt de florist-tag-suiker gebruikt als acceptor en gekoppeld aan dezelfde donor om het disaccharide te verkrijgen, het disaccharide wordt gezuiverd door FSPE om te beginnen.
Plaats reagentia, inclusief de donor-acceptor-promotor, 80% methanolwater, 100% methanol, natriummethoxide in het robotplatform en start het programma. De robotarm zal de donor en vervolgens de acceptor uit de flesjes halen en ze overbrengen naar een reactieflesje. Vervolgens worden de mengsels van donor en acceptor gedurende 30 minuten geroerd.
Na 30 minuten. De robotarm brengt katalytisch trimethylsilo, trifluor, methaansulfonaat in het mengsel. De oplossing wordt vervolgens nog eens 30 minuten geroerd. Nadat het roeren voltooid is, pauzeert het programma.
Verwijder een aliquot van 10 microliter om te controleren of de reactie voltooid is door middel van dunne-laagchromatografie. Als de reactie voltooid is, zal het acceptormolecuul niet zichtbaar zijn. Als de reactie niet voltooid is, is het acceptor op de TLC nog zichtbaar.
Als dit het geval is, stopt u het programma, reset u de timing voor glycosylering op ongeveer 30 minuten en voegt u een overmaat van de promotor trimethylsilo, trifluor, methaansulfonaat toe. Wanneer de reactie voltooid is, gaat u verder met de volgende stap. Zodra de reactie voltooid is, brengt de robot het reactiemengsel over naar FSPE-cartridges met C negen F 17 gemodificeerd silicagel voor zuivering.
Vervolgens worden de cartridges gewassen met acht milliliter 80% methanol, gevolgd door acht milliliter 100% methanol. Om de niet-floris-fractie te elimineren, wordt de flow-through verzameld in een flesje om het gewenste florist-getagde product te verkrijgen. Als aanvullende zuivering vereist is, pauzeert u de robot en verwijdert u de geschikte reactieproducten.
Afhankelijk van de structuur kunnen donoren extreem onreactief zijn en zal een deel van de florist-acceptormolecule zelfs na het toevoegen van voldoende promotor overblijven. Als dit het geval is, zal FSPE niet efficiënt genoeg zijn voor zuivering en kan aanvullende zuivering via silicagel-kolomchromatografie worden uitgevoerd na zuivering. De robotarm doseert natriummethoxide in het reactieflesje. De reactie wordt vervolgens twee uur geroerd in het robotplatform, indien niet voltooid zoals bepaald door TLC, verlengt u de incubatietijd met ongeveer een uur.
Na voltooiing van de reactie wordt het product gezuiverd door FSPE zoals eerder. Vervolgens verwijdert u het reactieproduct van de robot en onderwerpt u het op de werktafel aan oplossing in anhydreus tolueen, gevolgd door verdamping om resterend water te verwijderen. Zodra een monster droog is, plaatst u het terug in de robot, hetzelfde cyclus inclusief glycosylering, zuivering door FSPE.
Diepe bescherming van de tijdelijke beschermende groep gevolgd door glycosylering wordt herhaald totdat de gewenste ketenlengte is verkregen voor het doelmolecuul. Om het beschermde product te deprotecteren dat verkregen is uit automatisering, verwijdert u de fles van de robot. De laatste stappen van de procedure maken gebruik van explosief waterstofgas en moeten buiten het automatiseringsplatform worden uitgevoerd. Op de werktafel vindt oz-lys van de dubbele band in de florist-tag plaats en word
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuw hydro put protocol voor de geautomatiseerde synthese van oligosacchariden en hun functionalisering op polyanhydride nanodeeltjes. De methode verbetert de targetingcapaciteiten voor specifieke receptoren op antigeen presenterende cellen.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Nanotechnologie
Achtergrond
- Oligosacchariden spelen een cruciale rol in celinteracties.
- Polyanhydride nanodeeltjes zijn veelbelovend voor geneesmiddelafgifte.
- Geautomatiseerde synthesemethoden kunnen de efficiëntie verbeteren.
- Karakteriseringstechnieken zijn essentieel voor het valideren van de synthese.
Doel van het onderzoek
- Om een hoge doorvoermethode voor oligosaccharide synthese te ontwikkelen.
- Om nanodeeltjes te functionaliseren voor gerichte afgifte.
- Om reactiecondities te optimaliseren voor de morfologie van nanodeeltjes.
Gebruikte methoden
- Geautomatiseerde oplossingsfase synthese van oligosacchariden.
- Zuivering met behulp van florist solid phase extraction (FSPE).
- Karakterisering door NMR spectroscopie.
- Hechting van oligosacchariden aan nanodeeltjes via carbo IDE conjugatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle synthese en zuivering van koolhydraatmoleculen.
- Karakterisering van gefunctionaliseerde nanodeeltjes bevestigde succesvolle hechting.
- Geoptimaliseerde omstandigheden voor koolhydraatdichtheid op nanodeeltjeoppervlakken.
Conclusies
- De hydro put methodologie is effectief voor oligosaccharide synthese.
- Gefunctionaliseerde nanodeeltjes kunnen het targeting van antigeen presenterende cellen verbeteren.
- Deze aanpak kan geneesmiddelafgiftesystemen in de neurowetenschappen bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput synthesis of carbohydrate-based targeting ligands and their attachment to polyanhydride nanoparticles, supporting the rational design of vaccine carriers with enhanced immunogenicity. By reducing building block requirements and automating synthesis and functionalization, it accelerates screening of multi-parametric systems for immunomodulatory effects. The approach addresses the scarcity of structurally defined carbohydrates, facilitating reproducible production of ligand-decorated nanoparticles for immune cell targeting studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of carbohydrate-receptor interactions, such as mannose-based ligands with C-type lectin receptors on dendritic cells.
- Operational Value: Automated solution-phase synthesis uses 2-3 equivalents of building blocks versus 10-20 in solid-phase methods, conserving scarce resources.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by allowing systematic variation of sugar density and reaction time to correlate with receptor engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces purified oligosaccharide intermediates characterized by NMR, ensuring defined chemical structures for reproducible bioactivity.
- Operational Value: Integrates fluorous solid-phase extraction (FSPE) for intermediate purification, enabling automation-compatible workflows with minimal manual intervention.
- Scalability: Robotic platform operated by LabVIEW allows deposition of reagents into nanoparticle libraries for parallel functionalization screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Carbohydrate-functionalized nanoparticles demonstrate increased expression of DC-SIGN and mannose receptor on mouse bone marrow-derived dendritic cells, indicating receptor-specific targeting.
- Preclinical Continuity: Enables optimization of nanoparticle morphology and ligand density, critical parameters for in vivo immunogenicity and antigen presentation.
- Risk Mitigation: Functionalization via carbodiimide conjugation allows controlled attachment of ligands, reducing batch variability in vaccine carrier prototypes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early carbohydrate synthesis with nanoparticle functionalization, supporting progression from target validation to preclinical evaluation of immunomodulatory delivery systems.
- Discovery Biology: Automated oligosaccharide synthesis supports hypothesis testing of carbohydrate-mediated immune modulation through precise ligand generation.
- Screening: FSPE purification and robotic deposition enable standardized, quantitative production of functionalized nanoparticle libraries for receptor binding assays.
- Analytics: NMR and XPS characterization provide structural and surface composition data to correlate ligand presentation with biological activity.
- Translational Research: Optimization of reaction time (e.g., 18 hours for maximal sugar attachment) informs dose-response relationships for cellular uptake and receptor engagement.
- Enterprise Reuse: Automated platform can be repurposed for diverse oligosaccharide targets and nanoparticle chemistries, supporting sustained use across discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in structure-activity relationships through defined carbohydrate ligands and controlled surface density on nanoparticles.
- Operational Value: Standardization via automated synthesis and purification reduces lot-to-lot variability in vaccine carrier prototypes.
- Strategic Value: Enables rapid screening of multi-parametric systems (ligand type, density, reaction conditions) to prioritize candidates with optimal immunomodulatory profiles.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted advancement decisions supported by reproducible generation of targeting ligands that enhance antigen-presenting cell activation.
Implementation Considerations
- Expertise in carbohydrate chemistry, automation programming (LabVIEW), and nanoparticle surface chemistry is required.
- Instrumentation includes robotic synthesis platform, FSPE cartridges, NMR spectrometer, and XPS or DLS for nanoparticle characterization.
- Cross-team standardization necessitates shared protocols for glycosylation timing, purification thresholds, and functionalization conditions.
- Adaptation across model systems requires validation of ligand stability and receptor binding in relevant immune cell types.
- Practical limitations include sensitivity to humidity (<30% RH) during glycosylation and potential need for orthogonal purification if FSPE is inefficient for certain donors.
