Microfluïdische Mixers voor het bestuderen van eiwitten vouwen

Het algemene doel van deze procedure is om twee oplossingen snel te mengen om een biochemische reactie op een microseconde-tijdschaal te starten. Dit wordt bereikt door eerst een microfluïdische menger te vervaardigen. De tweede stap is het hechten van een chip aan een dekglas om de kanalen af te dichten.

Vervolgens wordt de chip gemonteerd op een manifold die de oplossingreservoirs bevat. De laatste stap is het afbeelden van de gemengde oplossing met behulp van confocale fluorescentiemicroscopie. Uiteindelijk wordt de biochemische reactie op een microsecondenschaal vastgelegd door de afstand langs het uitgangskanaal om te zetten in tijd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals stop-flow mixing, is dat de menging niet wordt beperkt door turbulentie en in enkele microseconden plaatsvindt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van eiwitvouwing, zoals wanneer er een hydrofobe collaps optreedt? Ling Woo, een postdoc in mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren om te beginnen met de fabricage van microfluïdische mengchips.

Reinig eerst vier inch FU silica-wafers met een verse piranha-oplossing, zoals beschreven in het schriftelijke protocol dat bij deze video is gevoegd. Gebruik vervolgens een oven voor chemische dampafzetting onder lage druk (LPCVD) om een polysiliciumlaag aan te brengen met een dikte van ongeveer één micron per beoogde 10 micron diepte van de uiteindelijke microfluïdische kanalen. Na verdere behandeling van de wafers zoals beschreven in de tekst, breng via spin-coating een 900 nanometer dikke laag Z 52 14 fotolak aan op de wafers en voer vervolgens een soft bake uit op 90 graden Celsius direct op een hotplate gedurende één minuut of in een oven op 110 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Na het uitlijnen van een fotomasker wordt een hard vacuümcontact gemaakt door de fotolak eerst enkele seconden bloot te stellen aan UV-licht. Ontwikkel vervolgens het patroon in de fotolak zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Inspecteer de structuren op de wafer met een microscoop en voer een hard-bake uit op 115 °C direct op een warmteplaat gedurende twee minuten.

Voer vervolgens een DCU uit op de wafers met een Asher of zuurstofplasma gedurende 2,5 minuten bij een RF-vermogen van 100 watt. Ets met een deep reactive ion etcher de polysilicalaag volledig weg tot aan het onderliggende gesmolten silica. Verwijder de resterende fotolak en behandel de wafer zoals beschreven in de tekst.

Meet de etsdiepte om er zeker van te zijn dat deze volledig door de poly-coating gaat. Ets met een oxide-compatibele deep reactive ion etcher gefuseerd silica tot een diepte van ongeveer 10 microns per micron dikte van de poly-coating. Reinig de wafer met de matrix Asher gedurende vier minuten bij een RF-vermogen van 100 watts, en strip het polysilicium met een xenon difluoride etcher; breng voorafgaand aan het boren van gaten in de wafer een nieuwe spin-coat laag photoresist van één micron aan om de kanalen tijdens verdere handling te beschermen.

Monteer vervolgens de wafer met de actieve zijde naar beneden op een opofferingsglasplaat met behulp van Aqua Bond 55. Zorg ervoor dat de bonding vrij blijft van luchtbellen; gebruik hiervoor een computergestuurde diamantboorkop met micro 90 reinigingsoplossing. Dit voorkomt dat kleine glasfragmenten aan de kanalen hechten, wat anders tot verstopping van de chip tijdens het gebruik zou leiden.

Boor vervolgens ingangs- en uitgangsgaten in elke chip. Spoel de wafer met gedeïoniseerd water door middel van een spuit om water in elk gat te injecteren. Week de wafer daarna een uur in zeepsop nadat de fotoresist is verwijderd.

Pas resist en bonder toe zoals beschreven in de tekst. Spoel de wafer af met gedeïoniseerd water en warm zeepsop. Spoel elk gat opnieuw uit met een injectiespuit, waarbij de geëtste structuren worden vermeden nadat er stikstof over de wafer is geleid.

Ga verder met drogen in een vacuümoven ingesteld op 120 °C. Inspecteer de gaten om er zeker van te zijn dat ze vrij zijn van gruis en herhaal de reinigingsstappen indien nodig. De volgende stappen moeten in de cleanroom worden uitgevoerd.

Meet de diepte van de kanalen met een optische of mechanische oppervlakteprofilometer. Reinig de wafer evenals een dekglas van gesmolten kwarts in een cleanroom, zoals beschreven in de tekst. Droog de wafer grondig met stikstofgas gedurende ten minste vijf minuten.

Plaats de wafer vervolgens met de actieve zijde naar boven op een stapel van drie tot vier cleanroom-doekjes, die op een hard, vlak oppervlak liggen, zoals een klein glasplaatje. Herhaal dit met het dekglas. Pak het dekglas bij de rand vast en keer het om zodat de gepolijste zijde naar beneden boven de wafer wordt gehouden.

Lijn de platte randen zorgvuldig uit, laat het dekglas op de wafer zakken en laat het rusten; verschuif het enkel horizontaal om de uitlijning aan te passen. Druk met één vinger op het centrum van de wafer. Er zou een bondingfront zichtbaar moeten worden dat zich naar buiten toe verspreidt.

Breng indien nodig extra druk aan op andere posities rond de wafer om het bondingsfront te laten vorderen. Nadat de verzegelde wafers in een hogetemperatuuroven zijn geplaatst die is geprogrammeerd met het in de tekst vermelde temperatuurprofiel, wordt de wafer met een wafer-zaag in afzonderlijke chips gezaagd. Het manifold voor het vasthouden van de mengchip en de oplossingen kan worden gemaakt van kunststof zoals Lexan of plexiglas, of van aluminium.

Voor de temperatuurregeling wordt de chip met kleine o-ringen op het verdeelstuk bevestigd en op zijn plaats gehouden met een borgring die een vrij optisch zicht op het centrum van de chip mogelijk maakt. De o-ringgroeven moeten ondieper zijn dan gebruikelijk om een goede aansluiting te garanderen zonder te veel druk op de chip uit te oefenen. Zodra de chip is gemonteerd, worden de oplossingen toegevoegd aan de centrale en zijdelingse reservoirs, waarbij er zorgvuldig wordt toegezien op het verwijderen van eventuele luchtbellen die onderin de putjes vastzitten.

Plaats het verdeelstuk op een omgekeerde microscoop en bestudeer het menggebied via het oculair of de camera-uitgang. Een gloeilampzaklamp die bovenop het verdeelstuk wordt geplaatst, levert voldoende licht. Gebruik een kleurstof of een oplossing met een hoge brekingsindex in het centrale kanaal om de straal te kunnen zien.

Omdat de volumes in deze menger zo klein zijn, kan de stroming worden geregeld met luchtdruk die boven de oplossingsputjes wordt uitgeoefend. Om de straal te visualiseren, begint u met de druk in het zijkanaal op nul pounds per square inch en verhoogt u deze langzaam tot de druk gelijk is aan die van het middenkanaal. Als een zijkanaal verstopt is, zal de straal tegen een van de wanden van het uitlaatkanaal worden geduwd.

Als er een zichtbare verstopping optreedt, kan deze worden verholpen door met een spuit druk of vacuüm aan te leggen op het uitlaatkanaal. Indien de chip is verstopt met proteïne of ander organisch materiaal, kan deze worden gereinigd door deze een nacht te weken in piranha-oplossing. Leid een gecoate laserstraal in een microscoop van onderzoekskwaliteit met behulp van een dichroïsche spiegel, deze bevindt zich dan binnenin of net buiten de microscoop.

Lijn de laser zo uit dat de focus in het oculair of de camera enigszins nabij het menggebied zichtbaar is. Fluorescentie van het eiwit in de menger wordt opgevangen door het objectief, door de dichroïsche spiegel gestuurd en door een lens op een pinhole gefocust, waarna het beeld wordt geregistreerd op een fotonteller. Scan de chip met een piëzo-elektrische scanner in x- en y-richting om het menggebied in beeld te brengen.

Kies een positie op de straal en scan in X- en Y-richting om de focus in het verticale centrum van het kanaal te vinden. De scherptediepte van de microscoop is veel kleiner dan de kanaaldiepte, en de stroomsnelheid is uniform in het kanaal, behalve binnen één micron van de wanden. Daarom wordt de temporele resolutie van de waargenomen fluorescentie primair bepaald door de grootte van de confocale spot.

Scan horizontaal binnen het uitgangskanaal in stappen van 100 micron langs de jet, waarbij ongeveer één milliseconde per positie wordt geobserveerd. Verplaats de microscooptafel met 80 tot 90 micron langs de jet om latere tijdstippen vast te leggen. Alternatief kan het licht worden gedetecteerd door een spectrograaf en CCD na de dichroïsche spiegel, met gebruik van een lens om het licht op de ingangsspleet te focussen.

Omdat de gegevensverzameling trager is dan bij de fotonenteller, wordt de straal doorgaans eerst afgebeeld met de fotonenteller, waarna punten langs de straal met de spectrograaf worden gemeten. Gegevens van de fotonenteller worden geanalyseerd door drie tot vijf pixels rond de straal op elke positie op te tellen om een grafiek van intensiteit versus afstand te maken. De tijd wordt berekend uit de afstand met behulp van een berekende snelheid op basis van de toegepaste drukken.

Analyse als laatste stap de gegevens van de spectrograaf met een van de in de tekst beschreven methoden. Hier wordt een contourplot getoond van de intensiteit in het menggebied, gemeten door de fotonteller. De achtergrond in het uitgangskanaal buiten de jet moet dicht bij de ruisvloer van de detector liggen en wordt doorgaans niet afgetrokken.

Een hogere achtergrond kan wijzen op een slechte uitlijning of erop dat het eiwit aan de wanden van het kanaal kleeft. Omgekeerd wijst een jet die er geknikt of scheef uitziet, vooral nabij de mengregio, op een slechte etsing van de nozzles. Er wordt een tijdopgelost spectrum getoond van het eiwit ACell coenzyme a binding protein of A CBP gelabeld met Alexa 488 en Alexa 647.

De groene en rode rechthoeken tonen de golflengten die respectievelijk als donor- en acceptorkanalen zijn aangewezen. Bij deze gegevens is de achtergrond afgetrokken om de donkerstroom en het lasersignaal te verwijgen. Het achtergrondsignaal werd gemeten bij een druk in het centrale kanaal van nul pounds per square inch.

De mengtijd kan worden bepaald door een snelle reactie te meten die veel sneller verloopt dan het mengen, zoals het doven van tryptofaanfluorescentie door kaliumjodide. Omdat de jet kleiner is dan de optische resolutie van de microscoop, is er een grote daling in intensiteit in het menggebied. Naarmate de jet zich vormt, kan deze instrumentrespons worden verwijderd door een controlemeting uit te voeren waarbij de oplossingscondities niet veranderen.

De verhouding tussen meng- en niet-mengexperimenten van N-Acetyltryptofaanamide-fluorescentie wordt in deze figuur weergegeven. De lijn toont de voorspelde concentratie kaliumjodide op basis van console multiphysics-modellering en simulaties. De mengtijd, gemeten als de tijd die nodig is voor een afname van de concentratie met 80%, bedraagt acht microseconden.

Deze grafiek toont de veranderingen in FRET van het eiwit A CBP na verdunning van het denaturatiemiddel van zes molar naar 0,06 molar. Voor deze gegevens is geen controle-experiment nodig. Aangezien de FRET al een ratio is en de instrumentrespons reeds is verwijderd, vertegenwoordigt de snelle sprong nabij T gelijk aan nul een snelle verandering in het FRET-signaal binnen de mengtijd.

Na deze ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van eiwitvouwing om de vroegste stappen in de vorming van de eiwitstructuur te onderzoeken.