Name: Microfluïdische Mixers voor het bestuderen van eiwitten vouwen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Leer hoe je een microfluïdische mixer fabriceert voor snelle biochemische reacties op microseconden-schaal. Deze methode maakt spectroscopische detectie van eiwitvouwingsdynamica mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt ondersteund door National Science Foundation glasvezelnet (NSF EF-0623664) en IDBR (NSF DBI-0754570). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiële steun van National Science Foundation glasvezelnet Grant 0623664 beheerd door het Centrum voor Biofotonica, een NSF Wetenschap en Technologie Centrum, beheerd door de Universiteit van California, Davis, onder samenwerkingsovereenkomst PHY 0120999. Het onderzoek van Lisa Lapidus, Ph.D. wordt gedeeltelijk ondersteund door een Career Award op het Wetenschappelijk Interface van de Burroughs Welcome Fonds.

1. Fabricage van Microfluïdische mengen Chips Figuur 3 toont de basis fabricagestappen. <ol><li> Maak 4 inch (100 mm) fused silica wafers met verse Piranha-oplossing (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2): i) Verwarm het zwavelzuur tot 130 ° C en giet er dan de peroxide. Merk op dat de ruwheid en de vlakheid van het kwartsglas wafers die een belangrijke rol voor de uiteindelijke hechting stap. ii) Dompel de wafers ten minste 30 minuten. iii) Spoel gedurende 5 minuten met water en droog. Breng een polysilicium (poly) coating ~ 1 pm dikke per elke bestemd 10 pm diepte van de uiteindelijke microfluïdische kanalen, met een lage druk chemische dampafzetting (LPCVD) oven. </li><li> Maak de wafels en het masker met behulp van de Piranha-protocol in stap 1.1. Reinig het masker op dezelfde manier en spoel na met aceton, methanol en isopropanol en onmiddellijk föhnen. Dehydrateer de wafels op een hete plaat bij 150 ° C gedurende ca. 10 minuten (een aluminium folie tent weg te houden deeltjes) of 120 ° C oven gedurende ten minste 120 min (s nachts bij voorkeur). Om fotolak de grip te verbeteren, direct bloot te leggen van de warme wafels te HMDS damp gedurende 5 minuten. Spin laag de wafers met een ~ 900 nm dikke laag fotoresist AZ5214 en zachte bak bij 90 ° C rechtstreeks op een kookplaat voor 1 minuut in een oven bij 110 ° C gedurende 30 min (figuur 3, stap 1). </li><li> Breng het masker en het is een harde en vacuüm contact. Bloot te stellen aan UV-licht een aantal seconden (totale energie: ~ 103 mJ / cm 2) (figuur 3, stap 2). Ontwikkelen met AZ400K ontwikkelaar, verdund 4:01 met DI-water voor ~ 50 seconden (tot fotolak volledig is ontwikkeld), terwijl voorzichtig roeren. Afspoelen met water gedurende 2 minuten. Inspecteer functies met microscoop (figuur 3, stap 3). Als functies worden slecht opgelost, strip de fotolak en opnieuw te beginnen van 1,2. Hard bak 115 ° C direct op een kookplaat voor 2minuten. </li><li> Descum wafels met Asher of O 2 plasma voor 2,5 minuten bij 100 W RF-vermogen. Met behulp van een diepe reactief ion etser (DRIE), etsen de polysilicium laag helemaal door naar de fused silica hieronder. Strip de resterende fotolak met PRS2000 weerstand stripper bij 75 ° C gedurende 10 minuten. Spoel en droog. Meet de ets diepte om ervoor te zorgen het is helemaal door de poly coating (figuur 3, stap 4). </li><li> Met een oxide kan DRIE zoals een ULVAC NLD-6000 etser etch kwartsglas met een diepte van ca. 10 pm per micron dikte van de poly coating (figuur 3, stap 5). Deze poly coating afstand gedragen tijdens het etsen, zodat het kan moet worden nagegaan de integriteit van de bekleding tijdens het etsen. Als opzettelijk monotone gebieden van het waferoppervlak geworden ontdaan van de beschermende coating poly tijdens het etsen is het oppervlak waarschijnlijk worden putjes en niet meer geschikt voor het verlijmenin de laatste fase van de productie. In dit geval wafer waarschijnlijk niet meer mogelijk. Reinigen met de Matrix Asher gedurende 4 minuten, 100 W RF-vermogen. Strip de polysilicium met een XeF 2 etser (figuur 3, stap 6). Het kan noodzakelijk stap 1.4 en deze stap een aantal malen te herhalen om alle fotolak en poly coatings te verwijderen. </li><li> Spin laag wafers een nieuwe ~ 1 pm laag fotolak de kanalen beschermen tijdens latere hantering. Boor-en uitgang gaten in elke chip met behulp van een computergestuurde diamantgereedschap boor of handmatig met een zandstraler (figuur 3, stap 7). Bij gebruik van een boor, monteer de wafer (functie-kant naar beneden) op een offer glazen plaat met behulp van Aqua Bond 55, de zorg om de bonder vrij van luchtbellen. Koel de boor met micro-90 reinigingsoplossing. Dit houdt kleine glasscherven hechten aan de kanalen die vervolgens de chip verstoppen tijdens gebruik. </li><li> Spoel de wafer met DI-water met behulp van een spuit te w injecterenater in elk gat. Geniet in een sopje voor een uur. Verwijder fotoresist en Aqua Bond PRS 2000 60 ° C gedurende enkele uren tot schoon is. Spoel wafer met DI-water en warm water en zeep. Weer Spoel elk gat met een spuit, het vermijden van geëtst functies. Droog wafer met stikstof en in een vacuümoven gezet tot 120 ° C. Inspecteer de gaten te zorgen dat ze vrij zijn van grind en het reinigen van de stappen als nodig te herhalen. Meet de diepte van de kanalen met een optische of mechanische oppervlak profiler (figuur 3, stap 8). </li><li> Schoon wafels en een gelijk aantal van 170 micrometer dik fused silica deksel glazen met 1) Piranha-oplossing (1-2 uur volgens de procedure in 1.1), 2) RCA 2 (5:01:01 DI: HCl: H 2 0 2 ) oplossing gedurende 10 minuten bij 75 C, 3) RCA een oplossing (05:01:01 DI: NH4OH: H 2 0 2) voor 22 minuten bij 75C). Spoelen met DI-water gedurende 5 minuten tussen elke oplossing. </li><li> Plaats een wafer functies kant naar boven op de top vaneen stapel van 3-4 cleanroom doekjes bovenop een harde ondergrond, zoals een ruit. Droog de wafer grondig met stikstofgas tenminste 5 minuten. Herhaal dit met deksel glas. Neem dekking van glas door de rand en keer zodanig dat de gepolijste kant naar beneden gehouden over de wafer en lijn de platte randen. Voorzichtig laten vallen van de dekking van glas op de wafer en laat het bezinken. Verschuiven horizontaal slechts aanpassing te passen. Druk met een vinger op het midden van de wafer. Men moet zien een hechting voor naar buiten beginnen te stralen. Indien nodig, extra druk op andere plaatsen rondom de wafer aan de bonding voorzijde (figuur 3, stap 9) te bevorderen. </li><li> Plaats de verzegelde wafers in een hoge temperatuur oven, ingesteld met het opvoeren van kamer temp tot 800 ° C gedurende 3 uur, daarna 800 tot 1100 ° C boven de andere 1,2 uur. Houden op 1100 ° C gedurende 2 uur, en opvoeren tot kamertemperatuur gedurende nog eens 1,5 uur. </li><li> Dice met een wafer blokjes zag in iNDIVIDUELE chips (figuur 3, stap 10). </li><li> Het protocol wordt de fabricage van kanalen in het zeer ongebruikelijk kwartsglas substraat die nodig is voor UV detectie. Dit protocol kan worden aangepast voor een siliciumsubstraat die slechts een etsstap nodig 2. Een glas (maar niet gesmolten silica) dekglas kunnen worden gebonden aan de wafer met anodische binding. </li></ol> 2. Montage en laden Chips <ol><li> Het spruitstuk de menging chip en oplossingen houden kan worden gemaakt van kunststof, zoals Lexan of plexiglas, of aluminium temperatuurregeling (zie figuur 4). Bij gebruik van aluminium, moet de oplossing reservoirs worden bedekt met parylene de ontbinding van aluminium te voorkomen door het zout-oplossingen in de reservoirs. De temperatuur van het gehele spruitstuk en-chip kan worden bediend met thermo-elektrische inrichtingen aangebracht aan de zijkanten en een elektronische besturing. </li><li> De chip is gekoppeld aan de manivoudige door kleine o-ringen en op zijn plaats gehouden met een vasthoudring die duidelijk optische het centrum van de chip toelaat. De o-ring groeven zou moeten zijn ondieper dan de standaard om een ​​goede dekking te garanderen zonder toepassing van te veel druk op de chip, dat wil zeggen dat een 002 o-ring zijn 0.025 &quot;diep. Zodra de chip is gemonteerd, oplossingen toe te voegen aan het centrum en aan de zijkant reservoirs , zorg om luchtbelletjes gevangen op de bodem van de putten vrij. </li><li> Omdat de hoeveelheid in deze menger zo klein zijn, kan de stroom worden met luchtdruk aangebracht boven de oplossing putjes. Figuur 4 toont de Manifold gekoppeld aan de bovenzijde van de chip verdeelstuk door O-ringen. De druk spruitstuk is aangesloten op de computer-gestuurde druk transducers die kunnen handhaven druk van ~ 2-80 PSI. De chip is ontworpen dat even druk op het midden en zijgeleiders a ~ 100-voudige verhouding in het lineaire debiet produceren. Bij 20 PSI de lineaire stroomsnelheid in de uitgang kanaal ~ 1 m/ S. </li><li> Plaats spruitstuk op een omgekeerde microscoop te onderzoeken en te mengen regio met het oculair of camera-uitgang. Een gloeilamp zaklamp boven op het spruitstuk voldoende zorgen voor licht. Gebruik een kleurstof of een hoge brekingsindex oplossing (dwz 6 M guanidine hydrochloride) in het centrum kanaal te bekijken van de jet. </li><li> Bij gelijke druk op het centrum en aan de zijkant kanalen, zal de jet moeilijk te zien zijn op het oog dus met de zijkant kanaal druk op 0 PSI starten en langzaam op gelijke druk. Als een zijkanaal verstopt zal de straal worden gedrukt tegen een van de wanden van de uitgangskanaal. Als zichtbaar klomp weergegeven kan worden verdreven door druk of vacuum naar de uitgang kanaal met een injectiespuit. </li><li> Indien eiwit of ander organisch materiaal verstopt de chip kan worden gereinigd door onderdompelen in Pirhana oplossing overnacht. </li></ol> 3. Data Collection Figuur 5 toont de basis-optisch instrument lay-out.<ol><li> Breng een gecollimeerde laserstraal in een onderzoek-grade microscoop met behulp van een dichroïsche spiegel binnen of net buiten de microscoop. Lijn de laser, zodat de aandacht te zien in het oculair en camera enigszins bij het mengen gebied. </li><li> Fluorescentie van het eiwit in de menger door het objectief en die via de dichroïsche spiegel, gefocusseerd door een lens met een pinhole en afgebeeld op een fotonen. Scan de chip met behulp van een piëzo-elektrisch scanner in x en y om het imago van de regio mengen (typische stap grootte is 2 micrometer). Kies een positie op de straal scan x en z de focus vinden in het midden van het kanaal vertikaal. De scherptediepte van de microscoop is veel kleiner dan het kanaal diepte en het debiet uniform in het kanaal behalve binnen 1 pm van de wanden. Daarom de temporele resolutie van de waargenomen fluorescentie wordt hoofdzakelijk bepaald door de grootte van de confocale plaats. </li><li> Scan horizontaal binnen de afslag (typische stap size is 0,2 um in over de jet, 2 micrometer langs de jet) in 100 micrometer stappen langs de jet, met inachtneming van voor ~ 1 ms per positie (zie figuur 6). Verplaats de microscoop podium met 80-90 micrometer langs de jet naar latere tijden vast te leggen. </li><li> Als alternatief kan het licht worden gedetecteerd door een spectrograaf en CCD na de dichroïsche spiegel met behulp van een lens om het licht op de ingangsspleet scherp te stellen. Omdat het verzamelen van gegevens is langzamer dan voor de foton teller (1 seconde per positie), wordt meestal de waterstraal EERSTE afgebeeld met het foton teller en zijn de punten langs de straal worden gemeten met de spectrograaf (zie figuur 7). </li><li> Gegevens van het foton teller wordt geanalyseerd door het optellen van 3-5 pixels rond de jet op elke positie op een perceel van intensiteit vs afstand te creëren. Wordt berekend op afstand met een snelheid berekend op de toegepaste drukken (zie figuur 8). </li><li> Gegevens uit de spectrograaf kan worden geanalyseerd op een aantal manieren. Voor FRET, Channels aangeduid als &quot;donor&quot; en &quot;acceptor&quot; elk kunnen worden opgeteld en de nabijheid verhouding E = I A / (I D I + D) berekend (zie figuur 9). Als alternatief kan een waarde ontleding uitgevoerd om te zien onafhankelijk spectrale componenten versus tijd, zoals verschuiving tryptofaan emissiespectrum een ​​eiwit plooien. </li><li> Afstand in de uitgangskanaal kan worden omgezet in met de constante stroomsnelheid bepalen van de toegepaste druk van de zijgeleiders. In de eerste 2 pm van het uitgangskanaal, het debiet van de jet-eiwit versnelt ~ 100x en de tijden dat gebied worden berekend met eindige elementen analyse van de stroomlijnen (om het malen uitgezet in figuur 8). Deze versnelling levert een offset van ~ 1-2 ps na de snelheid constant wordt en kan meestal worden genegeerd in het meten van kinetiek veel trager dan mengen. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Figuur 6 toont een contourdiagram van de intensiteit in het gebied mengen gemeten door de fotonen. De achtergrond in de uitgang kanaal buitenkant van de jet moet dicht bij de ruisvloer van de detector te zijn en is meestal niet worden afgetrokken. Een hogere achtergrond kan aangeven slechte aanpassing of het eiwit vast aan de wand van het kanaal. Een straalvliegtuig dat ziet er geknikt of krom, vooral in de buurt het mengen regio, wijst op een slechte etsen van de sproeiers. Figuur 7 toont de tijd opgeloste spectra van het eiwit acyl-enzym A-bindend eiwit (ACBP) gemerkt met Alexa 488 en Alexa 647. Deze gegevens zijn achtergrond afgetrokken van de donkere lading en laser-signaal te verwijderen. De achtergrond signaal werd genomen met het centrale kanaal druk op 0 PSI. De mengtijd kan gemeten worden door een snelle reactie die veel sneller dan mengen zoals Trp fluorescentie quenching by KI of instorten van enkelstrengs DNA, voorzien FRET kleurstoffen, door toevoeging van NaCl. Omdat de jet kleiner is dan de optische resolutie van de microscoop, is er een grote intensiteit daling in de menginrichting regio de straal vormen. Dit instrument reactie kan worden verwijderd door een controlemeting waarin geen oplossing omstandigheden veranderen. Figuur 8 toont de verhouding van het mengen (in 400 mM KI) en niet-mengen experimenten N-acetyl tryptofaan amide fluorescentie. De lijn geeft de voorspelde concentratie van KI van COMSOL simulaties. De mengtijd, gemeten als de tijd dat de concentratie 80% verminderen, is 8 ps. Aangezien de gegevens worden verzameld in 100 micrometer stappen langs de 500 pm lang afslag kanaal, moeten de gegevens worden geplakt samengesteld uit meerdere weergaven. Er zijn af en toe kleine offsets in signaal tussen deze opvattingen, waarschijnlijk het gevolg van kleine veranderingen in de focus als de chip wordt bewogen door de microscoop podium. Door de fase 80 tot 90um per-view, kunnen deze offsets worden geëlimineerd door het onderzoeken van overlappende data. Typisch worden verzameld ten minste twee stromen en de gegevens worden gecombineerd met elk signaal wijzigingen te bevestigen zijn vanwege werkelijke spectroscopische veranderingen in het eiwit, in plaats van optische effecten of stroom. Figuur 9 toont de FRET veranderingen in het eiwit ACBP na verdunning denatureringsmiddel van 6 M tot 0,06 M. Deze lijst heeft geen behoefte aan een controle-experiment omdat de FRET is al een verhouding en het instrument reactie is al verwijderd. De snelle sprong in de buurt van T = 0 staat voor een snelle verandering in FRET signaal binnen de mengtijd. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3976/3976fig1.jpg" /> Figuur 1. Lay-out van het mengen regio gemeten met behulp van elektronenmicroscopie. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3976/3976fig2.jpg" /> Figuur 2. Schematische voorstelling van hydrodynamische mengen met het vouwen van eiwitten te bestuderen. Het eiwit,opgelost in hoge denatureringsmiddel om het te ontvouwen, naar beneden stroomt het centrum kanaal naar de meng-regio waar het voldoet aan buffer stromen ~ 100 keer sneller. Laminaire stroming dwingt het eiwit stroom in een smalle straal van waaruit denatureringsmiddel moleculen kunnen zich snel verspreiden. Omdat de straal naar beneden stroomt de afrit kanaal, kan het eiwit worden waargenomen met een hoge ruimtelijke en tijdsresolutie met behulp van een confocale microscoop. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3976/3976fig3.jpg" /> Figuur 3. Kwartsglas fabricage. 1) Het proces begint met een gepolijst 500 urn dikke fused silica substraat (a) met een laag polysilicium (poly) afgezet op de bovenste en onderste oppervlakken (b) en spin-coating een laag fotolak (c). 2) Een masker (e) wordt gebracht int<html> o hard contact met de wafel en de fotolak wordt blootgesteld aan UV-licht (d). 3) De wafel wordt geplaatst in een ontwikkelaar bad en het patroon wordt geopenbaard in de fotolak. 4) De wafel wordt in een DRIE en de eigenschappen worden geëtst in de bovenste poly coating. De fotolak wordt dan verwijderd. 5) De poly fungeert dan als masker bij de wafer wordt in een oxide etser en de eigenschappen worden geëtst 10-40 pm in het kwartsglas substraat. 6) De poly coating wordt verwijderd in een XeF 2 etser. 7) de wafer wordt gebonden aan een offer glazen plaat met een warmte-geactiveerde afdichtmiddel (g) valt omlaag en een diamantboor (f) abrasief boren doorgaande gaten van de achterzijde. 8) Een oppervlak profiler (h) dan direct meet de geëtst functie diepte. 9) A 170 urn dikke gesmolten silica dekglaasje wafer is direct gebonden aan het bovenoppervlak van de plak. 10) De wafer wordt in blokjes gesneden in individuele microfluïdische chips. 3976/3976fig4.jpg &quot;/&gt; Figuur 4. De mixer spruitstuk. De microfluïdische-chip is bevestigd aan de oplossing spruitstuk met een aluminium voorpaneel en vier o-ringen onder de ~ 200 pi reservoirs. Een groot gat wordt bewerkt door het midden van het spruitstuk direct boven het mengen gebied van de aangebrachte microfluïdische-chip, de overtollige UV licht om te ontsnappen zonder terugstrooiing, remmen een auto-fluorescentie van het spruitstuk zelf en waarbij directe belichting van de chip op het oog of camera voor de uitlijning. De lucht spruitstuk afdichtingen elk van de reservoirs, zodat de luchtdruk in elk kan worden via een uitwendige overdruk schakelkast. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3976/3976fig5.jpg" /> Figuur 5. Schematische voorstelling van optische confocale microscoop. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/3976/3976fig6.jpg" /> Figuur 6. Contour plot van tryptofaanfluorescentie in de microfluïdische mixer. Het mengen gebied ligt in ~ 90 pm op de y-as. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/3976/3976fig7.jpg" /> Figuur 7. Tijdsafhankelijke tl-spectra verzameld binnen de mixer. De groene en rode rechthoeken geven de golflengtes die als donor en acceptor kanalen, respectievelijk. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/3976/3976fig8.jpg" /> Figuur 8. Mengtijd gemeten met behulp van fluorescentie quenching van tryptofaan door kaliumjodide (punten en rechts-as) en berekend door de eindige elementen analyse (lijn-en linker as). <img alt="Figuur 9" src="/files/ftp_upload/3976/3976fig9.jpg" /> Figuur 9. FRET veranderingen gemeten tijdens het plooien van het eiwit ACBP. De snelle stijging in de buurt van t = 0 staat voor een burst fase binnen de mengtijd en de langzamere stijging is een geleidelijke accumulatieAN structuur als het eiwit plooien. De data werd op twee verschillende snelheden en bedekt, waardoor verschillende dichtheden van metingen op verschillende tijdstippen.

<ol><li>Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics+and+mechanisms+in+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics and mechanisms in protein folding.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).</li>
<li>Hertzog, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtomole+mixer+for+microsecond+kinetic+studies+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding.</a> Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).</li>
<li>Hertzog, D. E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+microfluidic+mixer+for+studying+protein+folding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of a microfluidic mixer for studying protein folding kinetics.</a> Analytical Chemistry. 78, 4299-4306 (2006).</li>
<li>Yao, S., Bakajin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+Mixing+Time+and+Mixing+Uniformity+in+Devices+Designed+for+Studies+of+Protein+Folding+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics.</a> Analytical Chemistry. 79, 5753-5759 (2007).</li>
<li>Lapidus, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Hydrophobic+Collapse+and+Early+Folding+Steps+Observed+in+a+Microfluidic+Mixer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein Hydrophobic Collapse and Early Folding Steps Observed in a Microfluidic Mixer.</a> Biophysical Journal. 93, 218-224 (2007).</li>
<li>Bilsel, O., Kayatekin, C., Wallace, L. A., Matthews, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchannel+solution+mixer+for+studying+microsecond+protein+folding+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">A microchannel solution mixer for studying microsecond protein folding reactions.</a> Review of Scientific Instruments. 76, (2005).</li>
<li>Chan, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submillisecond+protein+folding+kinetics+studied+by+ultrarapid+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing.</a> PNAS. 94, 1779-1784 (1997).</li>
<li>Shastry, M. C. R., Luck, S. D., Roder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous-flow+capillary+mixing+method+to+monitor+reactions+on+the+microsecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A continuous-flow capillary mixing method to monitor reactions on the microsecond time scale.</a> Biophysical Journal. 74, 2714-2721 (1998).</li>
<li>Pollack, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compactness+of+the+denatured+state+of+a+fast-folding+protein+measured+by+submillisecond+small-angle+x-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle x-ray scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10115-10117 (1999).</li>
<li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+cytochrome+c+initiated+by+submillisecond+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing.</a> Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).</li>
<li>Knight, J. B., Vishwanath, A., Brody, J. P., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+focusing+on+a+silicon+chip%3A+Mixing+nanoliters+in+microseconds%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds.</a> Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).</li>
<li>DeCamp, S. J., Naganathan, A. N., Waldauer, S. A., Bakajin, O., Lapidus, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Observation+of+Downhill+Folding+of+lambda-Repressor+in+a+Microfluidic+Mixer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer.</a> Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).</li>
<li>Waldauer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruggedness+in+the+folding+landscape+of+protein+L%5BTitle%5D)+AND+%22Hfsp+Journal%22%5BJournal%5D)">Ruggedness in the folding landscape of protein L.</a> Hfsp Journal. 2, 388-395 (2008).</li>
<li>Shastry, M. C. R., Roder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+barrier-limited+protein+folding+kinetics+on+the+microsecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale.</a> Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).</li>
<li>Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+and+search+dynamics+of+apomyoglobin+folding+revealed+by+submillisecond+observations+of+alpha-helical+content+and+compactness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).</li>
<li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+Multiple+Folding+Pathways+for+the+Villin+Headpiece+Subdomain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Snelle menging is een ontwikkeling doel voor het gebied van het vouwen van eiwitten voor vele jaren, omdat het is al lang bekend dat de moleculaire processen van biomoleculen na verloop van tijd schalen variërend van picoseconden tot seconden. Conventionele gestopt-flow mixers hebben dode tijden van 1-5 ms die vooral wordt beperkt door turbulentie. Turbulente continue stroom mixers met mengtijden van 30-300 ps zijn ontwikkeld in de afgelopen 15 jaar door een klein aantal groepen, maar vereisen over het algemeen hoge debieten om deze mengtijden te bereiken en daarom gebruik maken van veel van het monster 6-8. Dit protocol beschrijft het gebruik van microfluïdische mengen chips snelle verdunning mogelijk in de laminaire stroming regime. Er zijn verschillende voordelen die binnen dit stelsel, maar primair men de mogelijkheid om het gehele mengproces met hoge nauwkeurigheid waarmee men wijzigen mengen reactie simuleren. T-mixers ontwikkeld door andere groepen met eenvoudige geometries gebleken mengtijden van 100-200 microseconden die voornamelijk zijn beperkt door de omvang van de kanalen 9-10. Door het schalen van de grootte van de kanalen 10 urn Knight verminderd mengtijd to ~ 10 microseconden 11. Yao en Bakajin toonde aan dat kleine veranderingen in de geometrie kan leiden tot aanzienlijke verbeteringen in de mengtijd 4. Maar dat werk is gebleken dat versnelling van het mengen kan ook leiden tot tragere fasen ook. Het ontwerp in dit werk 12-13 is een compromis tussen de twee beste ontwerpen in referentie 4 de langzamere exponentiele verval denatureringsmiddel concentratie ook minimaliseren en om de functie meer reproduceerbaar DRIE etsen. Er is enige controverse het gebied van ultrasnelle mengen over de definitie van de mengtijd. Het is belangrijk te herkennen het verschil tussen &quot;mengtijd&quot; en &quot;dode tijd&quot;. De dode tijd wordt bepaald in een turbulente mixer als de tijd waarin een METINGt kunnen worden gemaakt en in feite aanzienlijk langer dan de werkelijke mengtijd. Het is typisch bepaald door verschillende maten van een pseudo eerste orde bimoleculaire reactie (zoals quenching van fluorescentie van tryptofaan N bromosuccinate) bij verschillende concentraties. De waargenomen exponentiële vervalt zijn voorzien van naar elkaar toe in een enkele waarde uitgegaan van t = 0 s en de tijd tussen dat punt en het eerste gemeten punt is de dode tijd. Voor laminaire stroming mixers, kunnen metingen worden verricht tijdens het mengproces, zodat er geen dode tijd, alleen een mengtijd. De mengtijd bedraagt ​​slechts de tot twee oplossingen te combineren tot voldoende homogeniteit bereikt. Wij hebben eerder gedefinieerde mengtijd een 90/10, de tijd voor de concentratie van denaturerende op 90% dalen tot 10% van de ongemengde waarde. De vorm van de curve mengen niet volledig symmetrisch met de staart van het verval met een exponentiële component. Bovendien eiwitvouwing eenniet-lineair afhankelijk denatureringsmiddel concentratie zodat vouwen kan beginnen vaak zelfs indien het denatureringsmiddel alleen verminderd tweeledig. Daarom hebben we sinds kort gedefinieerd de mengtijd als de tijd om de denatureringsmiddel concentratie te verminderen met 80%. Zeker andere definities kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de eisen van het experiment. Het gebruik van deze mixer om het vouwen van eiwitten te bestuderen heeft steeds onthuld verrassende resultaten. Vouwen van cytochroom c en apomyoglobin al lang bestudeerd om meerdere inklapbare trap en de eerste resultaten te hebben met voortdurende stroom mixers toonde instorting voor te komen op de ~ 100 microseconden tijdschaal 10,14-15. De metingen met de mixer bleken er ten minste twee stappen dit tijdsbestek een zeer snelle, waarschijnlijk niet-specifieke, collaps (gemeten Trp fluorescentie spectrale shift) binnen de mengtijd van de menger, gevolgd door een tragere fase (zoals gemeten door de afkoeling van de totale emissie Trp) die waarschijnlijk de fEERSTE vorming van natieve structuur 5. We hebben ook waargenomen 50 ps proces in de B1 domein eiwit L, kantelen de conventionele interpretatie dat dit eiwit is een 2-state map 13. Een voordeel van deze snelle mixer is dat het sonde het vouwen van de snelste vouwen eiwitten gewoonlijk slechts zijn meetbaar door nanoseconde T-sprong instrumenten. T-sprong vereist normaliter waarneming van vouwen / ontvouwen ontspanning bij de smelttemperatuur van het eiwit en dus nooit volgt het vouwen van de gehele populatie. Met deze mixer hebben we gekeken naar het vouwen van γ-repressor (λ 6-86) met zowel Trp totale emissie en spectrale verschuiving en hebben bewijs gevonden dat het eiwit geen belemmering voor vouwen onder sterke vouwen voorwaarden die niet toegankelijk waren naar de vorige T heeft -springen metingen 12. Tenslotte hebben wij gemeten vouwen van de zendspoel villin HP-35-tHij snelste mappen nog gemeten en vastgesteld dat de vouwen snelheid gemeten na het mengen is ~ 5 keer langzamer dan gemeten door T-sprong onder dezelfde voorwaarden 16. Dit suggereert dat vouwen kinetiek afhankelijk van de beginvoorwaarden, kantelen grote aanname in het veld.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> AZ P4110 fotolak </td><td> AZ Electronic Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AZ 400 K ontwikkelaar </td><td> AZ Electronic Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Baker PRS 2000 fotolak stripper </td><td> Avantor Performance Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AquaBond </td><td> AquaBond Technologies </td><td> AquaBond 55 </td><td></td></tr><tr><td> 500 urn deksel wafer </td><td> SENSOR Prep Services </td><td></td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Dikte: 0,5 mm ± 0,025 mm Standaard Toleranties (tenzij anders aangegeven) Oppervlaktebehandeling: SI: 4-8a; SII: 8-12A Flats: Een primaire SEMI-STD; Een Scribe Schoon en gepolijst, Both Sides </td></tr><tr><td> 170 micrometer deksel wafer </td><td> SENSOR Prep Services </td><td> 7980 2G Wafers </td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Dikte: 0,17 mm ± 0,025 mm Standaard Toleranties (tenzij anders aangegeven) Oppervlaktebehandeling: SI: 4-8a; SII: 8-12A Flats: Een primaire SEMI-STD; Een Scribe Schoon en gepolijst, Both Sides </td></tr><tr><td> Deep reactief ionen etser voor oxiden </td><td> ULVAC </td><td> ULVAC NL-6000 </td><td></td></tr><tr><td> Argon Ion Laser </td><td> Cambridge Laser Laboratories </td><td> Lexel 95-SHG </td><td> λ = 258 nm </td></tr><tr><td> Argon Ion Laser </td><td> Melles Griot </td><td></td><td> λ = 488 nm </td></tr><tr><td> Microscoop </td><td> Olympus </td><td> IX-51</td><td></td></tr><tr><td> Microscoop Doelstelling </td><td> Thor Labs </td><td> OFR LMU-40X-UVB 0,5 NA </td><td> λ = 258 nm </td></tr><tr><td> Microscoop Doelstelling </td><td> Olympus </td><td> UPLSAPO 60XW 1,2 NA </td><td> λ = 488 nm </td></tr><tr><td> Nanopositioner </td><td> Mad City Labs </td><td> Nano-LP100 </td><td></td></tr><tr><td> Gemotoriseerde Vertaling Stage </td><td> Semprex Corp </td><td> KL-serie 12-6436 </td><td></td></tr><tr><td> GaAsP Photon Counter </td><td> Hamamatsu </td><td> H7421-40 </td><td></td></tr><tr><td> Monochrometer </td><td> Horiba Instruments Inc </td><td> MicroHR </td><td></td></tr><tr><td> CCD camera </td><td> Andor Technology </td><td> idus 420A-BU </td><td></td></tr><tr><td> Guanidine hydrochloride (GuHCI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td&gt; G4505 </td><td></td></tr></tbody></table>

microfluïdische mixers voor het bestuderen van eiwitten vouwen

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Het proces waarbij een eiwit vouwen in zijn natieve conformatie zeer relevant is voor de biologie en de gezondheid van de mens toch nog steeds slecht begrepen. Een reden hiervoor is dat vouwen plaatsvindt over een breed scala van tijdschema van nanoseconden tot seconden of meer, afhankelijk van de proteïne 1. Conventionele gestopt-flow mixers hebben toegestaan ​​meting van het vouwen van kinetiek vanaf ongeveer 1 ms. We hebben onlangs een microfluïdische mixer die verdunt denatureringsmiddel ~ 100-voudig in ~ 8 ps 2. In tegenstelling tot een gestopt-flow mixer deze mixer werkt in de laminaire stroming regime waarvan turbulentie niet optreedt. De afwezigheid van turbulentie zorgt voor een precieze numerieke simulatie van alle stromen in de mixer met een uitstekende overeenkomst om te experimenteren 3-4. Laminaire stroming wordt bereikt voor de Reynolds getallen Re ≤ 100. Voor waterige oplossingen, dit vereist micron schaal geometrieën. We gebruiken een harde ondergrond, zoals silicium of gesmolten silica, om kanalen 5-10 um breed en 10 urn diep (zie figuur 1). De kleinste afmeting, bij de ingang van het mengen regio, in de orde van 1 pm groot. De chip is afgesloten met een dunne glazen of fused silica dekglaasje voor optische toegang. Typische totale lineaire debieten ~ 1 m / s, waarbij Re ~ 10, maar het eiwit consumptie slechts ~ 0,5 nL / s en 1,8 pi / hr. Eiwitconcentratie afhankelijk van de detectie werkwijze: voor tryptofaan fluorescentie de gebruikelijke concentratie 100 uM (voor een Trp / eiwit) en FRET de gebruikelijke concentratie ~ 100 nM. Het vouwen proces wordt gestart door snelle verdunning van denaturerend van 6 M tot 0,06 M guanidine hydrochloride. Het eiwit met hoge denatureringsmiddel stroomt een centraal kanaal en wordt voldaan aan weerszijden van het mengen regio buffer zonder denatureringsmiddel bewegen ~ 100 keer sneller (zie figuur 2). Deze geometrie zorgt snelle vernauwing van het eiwit stroom in een smallejet ~ 100 nm breed. Verstrooiing van het licht denaturerende moleculen zeer snelle diffusie van terwijl de zware eiwitmoleculen veel trager, diffusie minder dan 1 micrometer 1 ms. Het verschil in diffusieconstante van het denatureringsmiddel en het eiwit resulteert in een snelle verdunning van het denatureringsmiddel van het eiwit stroom, waardoor de effectieve concentratie van het denatureringsmiddel rond het eiwit. Het eiwit jet stroomt met een constante snelheid naar beneden waarneming kanaal en fluorescentie van het eiwit tijdens het vouwen kan worden waargenomen met behulp van een scanning confocale microscoop 5.

In dit werk leggen we de fabricage en het gebruik van een microfluïdische mixer voor het mengen van twee oplossingen in ~ 8 ps. We tonen ook aan het gebruik van deze mixers met spectroscopische detectie met behulp van UV-fluorescentie en fluorescentie resonantie energie overdracht (FRET).

Microfluïdische Mixers voor het bestuderen van eiwitten vouwen

Het proces waarbij een eiwit vouwt tot zijn natuurlijke conformatie is zeer relevant voor de biologie en de menselijke gezondheid, maar is nog steeds onvoldoende begrepen. Een reden ...

Het algemene doel van deze procedure is om twee oplossingen snel te mengen om een biochemische reactie op een microseconde-tijdschaal te starten. Dit wordt bereikt door eerst een microfluïdische menger te fabriceren. De tweede stap is het hechten van een chip aan een dekglas om de kanalen af te dichten.Vervolgens wordt de chip gemonteerd op een manifold die de reservoirs voor de oplossingen bevat. De laatste stap is het afbeelden van de gemengde oplossing met behulp van confocale fluorescentiemicroscopie. Uiteindelijk wordt de biochemische reactie op een microsecondenschaal vastgelegd door de afstand langs het uitgangskanaal om te zetten in tijd.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals stop-flow menging, is dat de menging niet wordt beperkt door turbulentie en in enkele microseconden plaatsvindt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van eiwitvouwing, zoals wanneer een hydrofobe collaps optreedt? De procedure zal worden gedemonstreerd door Ling Woo, een postdoc in mijn laboratorium, om te beginnen met de fabricage van microfluïdische mengchips.Reinig eerst vier inch FU silica-wafers met een verse piranha-oplossing, zoals beschreven in het geschreven protocol bij deze video. Gebruik vervolgens een oven voor chemische dampdepositie onder lage druk om een polysiliciumlaag aan te brengen met een dikte van ongeveer één micron voor elke beoogde 10 micron diepte van de uiteindelijke microfluïdische kanalen. Na verdere behandeling van de wafers zoals beschreven in de tekst, breng via spincoating een 900 nanometer dikke laag Z 52 14 fotolak aan op de wafers en voer vervolgens een soft-bake uit op 90 °C direct op een warmteplaat gedurende één minuut, of in een oven op 110 °C gedurende 30 minuten.Nadat een fotomasker is uitgelijnd, wordt een hard vacuümcontact gemaakt door de fotoresist eerst enkele seconden aan UV-licht bloot te stellen. Ontwikkel vervolgens het patroon in de fotoresist zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Inspecteer de structuren op de wafer met een microscoop en voer een hard bakproces uit op 115 °C direct op een hotplate gedurende twee minuten.Voer vervolgens een DCU uit op de wafers met een Asher of zuurstofplasma gedurende 2,5 minuten bij een RF-vermogen van 100 watt. Ets met een deep reactive ion etcher de polysilicalaag volledig weg tot aan het onderliggende gesmolten silica. Verwijder de resterende fotolak en behandel de wafer zoals beschreven in de tekst.Meet de etsdiepte om er zeker van te zijn dat deze volledig door de poly-coating gaat. Gebruik een diep reactieve ionen-etser die geschikt is voor oxiden om gefuseerd silica te etsen tot een diepte van ongeveer 10 micron per micron dikte van de poly-coating. Reinig de wafer met de matrix Asher gedurende vier minuten bij een RF-vermogen van 100 watt, en verwijder het polysilicium met een xenondifluoride-etser. Breng vóór het boren van gaten in de wafer via spin-coating een nieuwe laag photoresist van één micron aan om de kanalen te beschermen tijdens de verdere verwerking.Monteer vervolgens de wafer met de functionele zijde naar beneden op een opofferingsglasplaat met Aqua Bond 55. Zorg ervoor dat de bonding vrij blijft van bellen en gebruik een computergestuurde diamantboor met micro 90-reinigingsoplossing. Dit voorkomt dat kleine glasfragmenten aan de kanalen kleven, waardoor de chip tijdens gebruik zou kunnen verstoppen.Ga verder met het boren van ingangs- en uitgangsgaten in elke chip. Spoel de wafer met gedeïoniseerd water door een spuit te gebruiken om water in elk gat te injecteren. Week de wafer vervolgens een uur in zeepsop na het verwijderen van de fotolithografie.Pas de resist en bonder toe zoals beschreven in de tekst. Spoel de wafer af met gedeïoniseerd water en warm zeepsop. Spoel elk gat opnieuw af met een spuit, waarbij de geëtste structuren worden vermeden nadat er stikstof over de wafer is geleid.Laat het verder drogen in een vacuümoven die is ingesteld op 120 °C. Inspecteer de gaten om er zeker van te zijn dat ze vrij zijn van vuil en herhaal de reinigingsstappen indien nodig. De volgende stappen moeten in de cleanroom worden uitgevoerd.Meet de diepte van de kanalen met een optische of mechanische oppervlakteprofielmeter. Reinig de wafer en een dekglas van gefuseerd silica in een cleanroom, zoals beschreven in de tekst. Droog de wafer grondig gedurende ten minste vijf minuten met stikstofgas.Plaats de wafer vervolgens met de functionele zijde naar boven op een stapel van drie tot vier cleanroom-doekjes, die op hun beurt op een hard, vlak oppervlak zijn geplaatst, zoals een kleine glasplaat. Herhaal dit met het dekglas. Pak het dekglas aan de rand vast en keer het om, zodat de gepolijste zijde naar beneden over de wafer wordt gehouden.Lijn de vlakke randen zorgvuldig uit, laat het dekglas op de wafer vallen en laat het rusten; verschuif het alleen horizontaal om de uitlijning aan te passen. Druk met één vinger op het midden van de wafer. Men moet een bondingfront zien dat naar buiten toe uitstraalt.Breng indien nodig extra druk aan op andere posities rond de wafer om het bondingfront verder te laten vorderen. Nadat de verzegelde wafers in een oven bij hoge temperatuur zijn geplaatst, geprogrammeerd volgens het in de tekst vermelde temperatuurprofiel, wordt de wafer met een waferzaag in individuele chips gesneden. Het collectormanifold om de mengchip en oplossingen vast te houden, kan worden gemaakt van kunststof zoals Lexan of plexiglas, of van aluminium.Voor de temperatuurregeling wordt de chip met kleine o-ringen op het verdeelstuk bevestigd en op zijn plaats gehouden met een borgring die een vrij optisch zicht op het midden van de chip mogelijk maakt. De o-ringgroeven moeten ondieper zijn dan gebruikelijk om een goede aansluiting te garanderen zonder te veel druk op de chip uit te oefenen. Zodra de chip is gemonteerd, worden de oplossingen aan het centrale en de zijdelingse reservoirs toegevoegd, waarbij nauwgezet moet worden gelet op het verwijderen van eventuele luchtbellen die onderin de putjes zijn opgesloten.Plaats het verdeelstuk op een omgekeerde microscoop en onderzoek het menggebied met het oculair of de camera-output. Een gloeilampzaklamp bovenop het verdeelstuk biedt voldoende licht. Gebruik een kleurstof of een oplossing met een hoge brekingsindex in het centrale kanaal om de straal te kunnen zien.Omdat de volumes die in deze menger worden gebruikt zo klein zijn, kan de stroming worden geregeld met luchtdruk die boven de oplossingputjes wordt aangelegd. Om de jet te visualiseren, begint u met de druk in het zijkanaal op nul pounds per square inch en verhoogt u deze langzaam tot deze gelijk is aan de druk in het centrale kanaal. Als één zijkanaal verstopt is, zal de jet tegen een van de wanden van het uitgangskanaal worden geduwd.Als er een zichtbare verstopping optreedt, kan deze worden verholpen door druk of vacuüm uit te oefenen op het uitgangskanaal met een spuit. Indien eiwitten of ander organisch materiaal de chip verstoppen, kan deze worden gereinigd door de chip gedurende de nacht in piranha-oplossing te weken. Leid een gecoate laserstraal in een microscoop van onderzoekskwaliteit met behulp van een dichroïsche spiegel, deze bevindt zich ofwel in of net buiten de microscoop.Lijn de laser zodanig uit dat de focus in het oculair of de camera enigszins nabij het menggebied zichtbaar is. Fluorescentie van het eiwit in de mengkamer wordt opgevangen door het objectief, via de dichroïsche spiegel geleid, door een lens op een pinhole gefocust en afgebeeld op een fotonteller. Scan de chip met een piëzo-elektrische scanner in x- en y-richting om het menggebied in beeld te brengen.Kies een positie op de jet en scan in X en Y om de focus in het verticale centrum van het kanaal te vinden. De scherptediepte van de microscoop is veel kleiner dan de kanaaldiepte, en de stroomsnelheid in het kanaal is uniform, behalve binnen één micron van de wanden. Daarom wordt de temporele resolutie van de waargenomen fluorescentie primair bepaald door de grootte van de confocale spot.Scan horizontaal binnen het uitgangskanaal in stappen van 100 micron langs de jet, waarbij per positie gedurende ongeveer één milliseconde wordt geobserveerd. Verplaats de microscooptafel met 80 tot 90 micron langs de jet om latere tijdstippen vast te leggen. Alternatief kan het licht na de dichroïsche spiegel worden gedetecteerd door een spectrograaf en CCD, waarbij een lens wordt gebruikt om het licht op de ingangsspleet te focussen.Aangezien de gegevensverzameling trager verloopt dan bij de fotonteller, wordt de jet doorgaans eerst met de fotonteller in beeld gebracht, waarna punten langs de jet met de spectrograaf worden gemeten. De gegevens van de fotonteller worden geanalyseerd door drie tot vijf pixels rond de jet bij elke positie op te tellen om een grafiek van intensiteit tegenover afstand te maken. De tijd wordt uit de afstand berekend met behulp van een berekende snelheid op basis van de toegepaste drukken.Analyse als laatste stap de gegevens van de spectrograaf met behulp van een van de in de tekst beschreven methoden. Hier wordt een contourplot getoond van de intensiteit in het menggebied, gemeten door de fotonteller. De achtergrond in het uitlaatkanaal buiten de jet moet dicht bij de ruisvloer van de detector liggen en wordt doorgaans niet afgetrokken.Een hogere achtergrond kan wijzen op een slechte uitlijning of op het feit dat het eiwit aan de wanden van het kanaal kleeft. Omgekeerd duidt een jet die er geknikt of scheef uitziet, vooral nabij het menggebied, op een slechte etsing van de nozzles. Een tijdsondersteunend spectrum wordt getoond van het eiwit ACell coenzyme a binding protein of A CBP gelabeld met Alexa 4 88 en Alexa 6 47.De groene en rode rechthoeken tonen de golflengten die respectievelijk zijn aangewezen als donor- en acceptorkanalen. Bij deze gegevens is de achtergrond afgetrokken om de donkerstroom en het lasersignaal te verwijderen. Het achtergrondsignaal is gemeten met een druk in het centerkanaal van nul pounds per square inch.De mengtijd kan worden bepaald door een snelle reactie te meten die veel sneller is dan het mengproces, zoals de quenching van tryptCaanfluorescentie door kaliumjodide. Omdat de jet kleiner is dan de optische resolutie van de microscoop, is er een aanzienlijke daling in intensiteit in het menggebied. Naarmate de jet zich vormt, kan deze instrumentrespons worden verwijderd door een controlemeting uit te voeren waarbij geen enkele oplossingconditie wordt gewijzigd.De verhouding tussen meng- en niet-mengexperimenten van N-acetyltryptofaanamide-fluorescentie wordt in deze figuur weergegeven. De lijn toont de voorspelde concentratie van kaliumjodide op basis van console multiphysics-modellering en simulaties. De mengtijd, gemeten als de tijd die nodig is voor de concentratie om met 80% af te nemen, bedraagt acht microseconden.Deze grafiek toont de veranderingen in de FRET van het eiwit A CBP na verdunning van het denatureermiddel van zes molair naar 0,06 molair. Deze gegevens vereisen geen controle-experiment. Aangezien de FRET al een ratio is en de instrumentrespons reeds is verwijderd, vertegenwoordigt de snelle sprong nabij T gelijk aan nul een snelle verandering in het FRET-signaal binnen de mengtijd.Na deze ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van eivouvouwing om de vroegste stappen in de vorming van de eiwitstructuur te onderzoeken.

microfluidic-mixers-for-studying-protein-folding

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier beschrijven we een procedure die de microschalige schlieren-techniek gebruikt om mengingsongelijkheid in een microfluïdisch apparaat te meten. Door middel van kalibratie kan de verdeling van de concentratiegradiënt worden afgeleid uit de micro-schlieren-afbeelding.

Het analyseren van Mengen Inhomogeniteit in een microfluïdische apparaat door Microscale Schlieren Technique

Dit protocol beschrijft in detail hoe te fabriceren en te exploiteren van microfluidic apparaten voor röntgendiffractie gegevensverzameling bij kamertemperatuur. Bovendien, het beschrijft hoe eiwitten kristallisatie controleren door Dynamische lichtverstrooiing en hoe om te verwerken en analyseren diffractie gegevens verkregen.

Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

We laten zien dat de fabricage en het gebruik van een microfluidic apparaat waarmee meerdere deeltje bijhouden microrheology afmetingen om te bestuderen van de reologische effecten van herhaalde fase-overgangen op zachte materie.

Combinatie van Microfluidics en Microrheology om te bepalen de Rheologische eigenschappen van zachte materie tijdens herhaalde fase-overgangen

Dit artikel beschrijft het fabricageprotocol van microfluïdische chips ontwikkeld voor on-chip eiwitkristallisatie met de dialysemethode en in situ röntgendiffractie-experimenten. Het microfabricatieproces maakt het mogelijk om een semipermeabel geregenereerd cellulosedialysemembraan te integreren met elke moleculaire gewichtsafsnijd, tussen twee lagen van de chip.

Kristallisatie van eiwitten op chip door microdialyse voor in Situ röntgendiffractiestudies

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van Spotiton, een nieuw robotsysteem, om twee interessante monsters af te leveren op een zelfafvoerend nanodraadrooster dat zich minimaal 90 ms mengt voorafgaand aan vitrificatie in vloeibaar cryogeen.

Cryo-Elektron Microscopische Rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste studies met behulp van een nieuw robotsysteem, Spotiton

We presenteren protocollen voor eenvoudige actinefilamentmicrofluïdische assays, in combinatie met fluorescentiemicroscopie, waarmee men individuele actinefilamenten in realtime nauwkeurig kan volgen terwijl ze sequentieel worden blootgesteld aan verschillende eiwitoplossingen.

Microfluïdica en fluorescentiemicroscopie gebruiken om de assemblagedynamiek van single actinefilamenten en -bundels te bestuderen

Dit protocol combineert massafotometrie met een nieuw microfluïdica-systeem om eiwit-eiwitinteracties met een lage affiniteit te onderzoeken. Deze aanpak is gebaseerd op de snelle verdunning van sterk geconcentreerde complexen in oplossing, wat metingen met een lage affiniteit mogelijk maakt en de toepasbaarheid van massafotometrie verbreedt.

Analyse van de vorming van eiwitcomplexen bij micromolaire concentraties door microfluïdica te koppelen aan massafotometrie

De fabricage van een dubbellaags apparaat op basis van polydimethylsiloxaan (PDMS) voor de productie van combinatorische bibliotheken in water-in-olie-emulsies (pluggen) wordt hier gepresenteerd. De benodigde hardware en software die nodig zijn om de productie van stekkers te automatiseren, worden gedetailleerd beschreven in het protocol en de productie van een kwantitatieve bibliotheek van fluorescentiestekkers wordt ook gedemonstreerd.

Dubbellaags microfluïdisch apparaat voor de productie van combinatorische pluggen

Dit protocol beschrijft het ontwerp en de fabricage van een microfluïdisch apparaat dat geschikt is voor het onderzoeken van de mechanica van microtubuli-polymeren. De synthese van microfabricage, geautomatiseerde stroomregeling en computationele modelleringstechnieken maakt een flexibel systeem mogelijk dat bij uitstek geschikt is om het cellulaire cytoskelet in vitro te onderzoeken.

Ontwikkeling van een op microfluïdica gebaseerde benadering voor het onderzoeken van de mechanica van microtubuli-polymeren

In dit artikel presenteren we een microfluïdisch-gebaseerde methode voor deeltjesfysica opsluiting op basis van hydrodynamische stroming. Tonen we stabiel deeltje trapping in op een vloeiende stagnatie punt met behulp van een feedback control mechanisme, waardoor opsluiting en micromanipulatie van willekeurige deeltjes in een geïntegreerde microdevice.

Een Microfluïdische-gebaseerde Hydrodynamische Trap voor Single Particles

Leer hoe je een microfluïdische mixer fabriceert voor snelle biochemische reacties op microseconden-schaal. Deze methode maakt spectroscopische detectie van eiwitvouwingsdynamica mogelijk.

Microfluïdische Mixers voor het bestuderen van eiwitten vouwen

Meer video's verkennen