Name: Non-contact, Label-free monitoring van cellen en extracellulaire matrix met behulp van Raman spectroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Leer Raman-spectroscopie voor het labelvrij monitoren van cellen en extracellulaire matrix zonder contact. Deze methode analyseert biochemische samenstelling via spectra en multivariate analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Steffen Koch voor zijn technische ondersteuning en Shannon Lee Layland (zowel Fraunhofer IGB Stuttgart) voor zijn nuttige suggesties op het manuscript. Dit werk werd financieel ondersteund door het aantrekken programma van de Fraunhofer-Gesellschaft en de BMBF (zowel voor KS-L.).

1. Voorbereiding van het biologische monster <ol><li> Voorbereiding van levende cellen <ol><li> Bereiding van hechtende cellen <ol><li> Zaad in vitro gekweekte-of vers geïsoleerde cellen op een glazen onderste schaal (Greiner BioOne / Duitsland) en incubeer ze bij 37 ° C en 5% CO2 tot celhechting is voltooid. </li><li> Verwijder de voedingsbodem en was voorzichtig drie keer met PBS voorafgaande meting. Houd de cellen bedekt met een PBS of celkweek medium in de gehele meetprocedure. </li></ol></li><li> Bereiding van cellen in suspensie <ol><li> Maak in vitro-gekweekte cellen op basis van gemeenschappelijke protocollen (bijvoorbeeld trypsine-EDTA, cel schrapen), centrifugeren de cellen en resuspendeer de verkregen celpellet in PBS of celkweek medium. </li><li> Breng 100 pi van de celsuspensie (concentratie. Max 100.000 cellen / ml) aan een glazen onderste schaal. </li></ol></li></ol></li><li> Voorbereiding van native weefsels <ol><li> Na het oogsten van de weefsels, overbrengen naar steriele, ijskoude PBS en bewaar ze niet langer dan 12 uur bij 4 ° C of op ijs eerdere meting. Eerdere experimenten hebben aangetoond dat een langdurige opslag tijd (koude ischemie tijd&gt; 12 uur bij 4 ° C) resulteerde in spectrale veranderingen door natuurlijke afbraakprocessen. </li><li> De metingen moeten worden uitgevoerd met het weefsel bedekt met PBS of medium om beschadiging van de ECM eiwitten en cellen als gevolg van weefsels drogen te voorkomen. </li></ol></li></ol> 2. Raman spectroscopie Onze op maat Raman-spectrometer een combinatie van een standaard fluorescentie microscoop (Olympus IX 71) met een Raman-spectrometer dat de directe vergelijking van bright-field en fluorescentie beelden met de Raman-spectra kunnen. De basis set bestaat uit een 784 nm diodelaser (Toptica fotonica AG / Duitsland), een inkeping filter voor de scheiding van de Raman-verstrooide licht van het excitatielicht een microscoop eennd een spectrograaf (Kaiser Optical Systems Inc, Ann Arbor / USA) met een Charge Coupled Device (CCD-camera) geoptimaliseerd voor de detectie van spectrale informatie (F-uitzicht vanuit Soft Imaging Systems / Duitsland). 3. Controle van de Laser Functie <ol><li> Start de software Andor Solis (Andor / Verenigd Koninkrijk) en de temperatuur van de CCD-camera tot -60 ° C instellen om het geluid veroorzaakt door thermisch geïnduceerde stromen in de camera te minimaliseren. </li><li> Plaats een siliciumplak de microscoop fase voor de kalibratie. </li><li> Zet de laser op en zet de stroom tot 85 mW. </li><li> Gebruik de software Cell B (Olympus / Duitsland) om de laser te richten op de wafer tot XY verschijnt. </li><li> Meet de silicium wafer met een integratietijd van 1 seconde met een 60x lucht doelstelling. </li><li> De eenheid van de x-as van het aantal pixels met Raman verschuiving (cm -1) in de Andor Solis software. </li><li> Verschillen van de laser focus van de silicium piek bij 520 cm -1 inde verzamelde spectrum om de maximale intensiteit voor dit Raman band vinden. Het minimumbedrag van de tellingen moet hoger zijn dan 11.000 voor een succesvolle kalibratie hebben. </li></ol> 4. Raman spectroscopische metingen Alle metingen zijn uitgevoerd bij kamertemperatuur. <ol><li> Basisinstellingen <ol><li> Gebruik 60x water immersie-objectief (Olympus / Duitsland) met een numerieke apertuur van 1,2 tot het spectrum van de monsters. </li><li> Wijzig de overname instellingen tot 10 integraties / 10 seconden voor een totaal van 100 seconden per metingen. </li></ol></li><li> Meting van hechtende cellen <ol><li> Neem de glazen bodem schotel met de cellen en plaats het op de microscoop podium. </li><li> Om een ​​beter signaal te krijgen en zorgen voor de reproduceerbaarheid, de focus van de laser op de celkern, zet de microscoop licht uit en beginnen met het verzamelen van het spectrum. </li><li> Meet een referentie spectrum van de achtergrond ezeer 10 spectra in door de laser gericht naast de cel. Het is belangrijk aan te nemen dat bij het veranderen van de focus van een nieuwe achtergrond moet worden verzameld voor iedere focus diepte. </li></ol></li><li> Meting van cellen in suspensie <ol><li> Breng 100 pi van de celsuspensie in het glas onderste schaal en leg hem op de microscoop podium. </li><li> Richt de laser op het midden van de cel, zet de microscoop licht uit en beginnen met het verzamelen van het spectrum. </li><li> Meet een infraroodspectrum van de achtergrond elke 10 spectra in door de laser gericht naast de cel. Bij het wijzigen van de focus, moet er een nieuwe achtergrond worden verzameld voor de nieuwe focus diepte. </li></ol></li><li> Meting van inheemse weefsels <ol><li> Neem het monster en plaats deze in een glazen bodem schaal. Het gebied van belang (ROI) moet gericht naar de bodem van de schotel. </li><li> Vul de schaal met voldoende PBS om het monster te dekken. </li><li> Plaats een deksel glas over het monster aan een mov te voorkomenement van het monster gedurende metingen. </li><li> Stel de laser aandacht in de structuur van belang (diepte resolutie is met een laser-en weefsel-afhankelijk is) en beginnen met het verzamelen van de spectra. </li><li> Verzamel een referentie spectrum van de achtergrond elke 10 spectra door het bewegen van de laser zich uit van het hele weefsel gebied. Bij het wijzigen van de focus, moet er een nieuwe achtergrond worden verzameld voor de nieuwe focus diepte. </li></ol></li><li> Meting van immunofluorescentie (IF)-gemerkte vriescoupes <ol><li> Sectie verse, snap-bevroren weefsel monsters met behulp van een standaard cryotom en monteer ze op silica-gecoate dekglaasjes. </li><li> Vlek de cryosecties na routine protocol voor IF, gebruik een korte fixatie stap (max. 10 minuten met 4% paraformaldehyde) met een geschikt antilichamen voor de detectie van het eiwit van interesse. </li><li> Voer Raman metingen richten in het gebied waar fluorescentie optreedt. </li></ol></li><li> Elastine degradatie experimenten <ol><li> Place de ventricularis van de ontleed varkens aortaklep folders (elastine-rijk, bloed instroom-side laag van de hartklep folder) naar de bodem van het glas onderste schaal. </li><li> Meet de natuurlijke weefsel als een &#39;niet-bebroede control&#39; bij 30 willekeurige punten over het gehele weefsel oppervlak waarbij de aandacht met de fibrillaire structuren. </li><li> Verdeel het monster in 3 secties en plaats ze in aparte 2,5 ml Eppendorf-buisjes gevuld met 2 ml van een elastase oplossing (5 U / ml, Worthington / Duitsland). </li><li> Incubeer de weefsel voor 15 of 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Na incubatie gedurende een 15 of 30 minuten de weefsels van de eppendorfbuisje en wassen zorgvuldig met PBS om volledig stoppen enzymatische reactie. </li><li> Meet elk monster bij 30 willekeurige punten, met de nadruk op de fibrillaire structuren. </li></ol></li></ol> 5. Gegevensverwerking en-analyse <ol><li> Raman spectra verwerking De voorbehandeling van hetgegenereerde spectra werd uitgevoerd met behulp van OPUS software (Bruker Optik GmbH / Duitsland). <ol><li> Om storende signalen van het glas en medium en het reduceren van variaties veroorzaakt door veranderingen in de concentratie tijdens metingen te voorkomen, trekt de overeenkomstige achtergrond spectrum van de verzamelde spectra. </li><li> Verminder de spectra van de golfgetalgebied gebied tussen 400-1800 cm-1, die de grootste hoeveelheid informatie biedt. </li><li> Indien nodig, normaliseren van de spectra van de maximale piek. Normalisatie factoren die de intensiteit schommelingen en systematische fouten, de vereenvoudiging van de detectie van structurele veranderingen in de steekproef spectra. </li><li> Voer een basislijn correctie op de vergelijkbaarheid van de verschillende experimenten te verhogen. </li></ol></li><li> Raman spectra analyse De Raman spectra werden geanalyseerd met behulp van PSO met The Unscrambler (CAMO / Noorwegen) software. Deze multivariate analyse detecteert verschillen en overeenkomsten binnen de spectrale gegevenssets. Elke spectrum is uitgezet als een punt in een meerdimensionele basis van de verzamelde telt elke Raman verschuiving. Elke principe component (PC) beschrijft een bepaalde hoeveelheid van de totale informatie in de oorspronkelijke data. De eerste PC is degene die de grootste bron van variatie bevat. Elke volgende pc bevat, in volgorde, minder informatie dan de vorige. Elke variabele heeft een score en een belasting op elke PC. Door het uitzetten van pc&#39;s (= scores) kunnen belangrijke monster correlaties worden blootgesteld. De belasting beschrijven de bijdrage van elke variabele geanalyseerd aan de PSO. <ol><li> Label elke groep van de metingen door het creëren van rij varieert voor ieder monster groep. </li><li> Gebruik de volgende basisinstellingen voor de PCA: cross validatie, de NIPALS algoritme, geen rotatie en start de analyse. Deze instellingen zijn afhankelijk van spectra. </li><li> Voer de PSO. </li></ol></li></ol> 6. Representatieve resultaten Raman spEctra gegenereerd hechtende cellen vaak blijkt een lage signaal-ruisverhouding en een lage totale signaalintensiteit (Fig. 1). 11 Door het feit dat de laser aandacht worden dicht bij de glazen bodem, de invloed van de storende glas signaal is vrij hoog, waardoor maskeren van het werkelijke monster signaal. Bijgevolg kan de steekproef signaal worden geminimaliseerd of zelfs geëlimineerd tijdens een latere achtergrond aftrekken. Zo wij de voorkeur aan cellen in suspensie gebruikt voor onze Raman spectroscopische analyse, aangezien zij de detectie van meer gedetailleerde spectrale informatie. De spectra van hechtende en suspensie cellen vertonen dezelfde belangrijkste pieken slechts verschillen in hun intensiteit. Voor de karakterisering van de verschillende celtypes in een schorsing, is er geen voorbehandeling nodig. De gemiddelde Raman-spectra en standaarddeviaties van de menselijke fibroblasten, mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s), chondrocyten en keratinocyten gemeten in suspensie zijnin figuur 2. Alle Raman spectra dezelfde structuur met toppen uit typische biomoleculen zoals eiwitten, nucleïnezuren, lipiden (zie Tabel 1). 12 Voor deze celtypen het spectrale gebied tussen 600 en 1800 cm1 bevat meest relevante spectrale gegevens van die duidelijke verschillen worden waargenomen tussen de verschillende celtypes (Fig. 2A). Voorbeeldige, hebben we gewezen op een spectrale gebied (1280-1350 cm -1) tonen duidelijk structurele verschillen, dat is toewijsbaar aan moleculaire vibraties van collageen en lipiden. Daarentegen morfologische analyses zijn niet geschikt voor de identificatie en onderscheid van de meeste cellen (Fig. 2B-I). Het verschil tussen chondrocyten en huidcellen waarneembaar (Fig. 2D, H tegenover B, F en E I), fibroblasten en MSC&#39;s zijn moeilijk te scheiden met uitsluitend helder veld micrsocopy (fig. 2B, F ten opzichte van C, G). 13 Raman spectroscopische analyse van natuurlijke weefsel, in het bijzonder van ECM eiwitten vereist dat ROI kan worden gevisualiseerd door helder veld beeldvorming te kunnen richten op de respectieve structuur. Bij het toekennen van een eiwit met een bepaalde vingerafdrukspectrum genereerden we Ramanspectra commercieel beschikbare zuivere eiwitten en immunohistologisch gekleurd cryosecties. Hier hebben we gewezen op de vingerafdruk spectra van de elastische vezels in eigen weefsels te vergelijken gevriesdroogde elastine en immunofluorescentie-gekleurde vriescoupes het gebruik van een antilichaam tegen elastine. Echter, omdat elastine beschikt over een hoge autofluorescentie, hetgeen tot uiting komt in de Raman-spectra, de data-analyse is een uitdaging (fig. 3A). Om het systematische falen te verminderen als gevolg van sample-specifieke eigenschappen zoals autofluorescentie, een juiste verwerking van de gegevens is van cruciaal belang. In onze data eenalyses gebruikten we normalisatie de aanzienlijk hogere signaalsterkte van het zuivere elastine eiwit heffen en dus konden we vergelijkbaar Ramanspectra genereren (Fig. 3B). Elastine is een van de meest stabiele ECM eiwitten in het lichaam en bijgevolg zeer moeilijk vermindert. 14 de experimentele opstelling wij geïnduceerd elastine afbraak in gezonde varkens aortaklep folders door het uitvoeren van een enzymatische afbraak. Het toepassen van de multivariate analyse PCA, identificeerden we significante verschillen tussen de Raman-spectra van enzymatisch behandelde monsters en inheemse controles (fig. 3C). Deze spectrale verschillen waargenomen bij het ​​laden spectrum 861, 1003 en 1664 cm-1. Verwachte structurele veranderingen in de elastine-bevattende vezels als gevolg van langdurige blootstelling keer om elastase werden getoond door kleuring HART&#39;s (afb. 4), die ook tot uiting in meer verschillende scheiden score clusters (fig. 3C). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig1.jpg" /> Figuur 1. De gemiddelde Raman-spectra van vrijstaande en aanhanger fibroblasten. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig2.jpg" /> Figuur 2. (A) De gemiddelde Raman-spectra en standaarddeviaties van de vier verschillende primaire geïsoleerde soorten cellen (fibroblasten, MSC, chondrocyten en keratinocyten). Het frame benadrukt de spectrale gebied van 1280 - 1350 cm -1 met structurele verschillen. (BE) Helder-gebied beelden losse (B) fibroblasten (C) MSC&#39;s (D) chondrocyten en (E) keratinocyten. Schaal bar is gelijk aan 20 urn. (FI) Helder-gebied beelden van hechtende (F) fibroblasten (G) MSC&#39;s (H) en chondrocyten (I) keratinocyten. Schaal bar is gelijk aan 200 micrometer. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig3.jpg" /> Figuur 3. (A) Raman spectra zonder normalisering van de lyophilized elastine (blauwe lijn), immunofluorescentie (IF)-gemerkt vriescoupes (oranje lijn) en elastische vezels (rode lijn) gemeten binnen inheemse aortaklep folders. De hoge signaal intensiteit van gevriesdroogde elastine wordt veroorzaakt door autofluorescentie. (B) Raman spectra na normalisatie, om storingen in het systeem te elimineren. (C) Scores en belastingen van de vergelijking tussen de niet-behandelde controle (rood) en enzymatisch-afgebroken (blauw en groen) elastische vezels in het eigen weefsel. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig4.jpg" /> Figuur 4. HART&#39;s-gekleurde varkens aortaklep folders. Elastische vezels worden gevisualiseerd in zwart. (A) en (B) aantonen dat niet-behandelde controle en (C) en (D) tonen weefselmonsters werden de elastine afbrekend enzym elastase blootgesteld 30 minuten. <table border="1"><tbody><tr><td> Golfgetal in cm -1 </strong&gt; </td><td colspan="2"> Opdracht 12 </td></tr><tr><td> 717-719 </td><td> CN </td><td> Fosfolipiden </td></tr><tr><td> 785-788 </td><td> DNA / RNA basen, OPO ruggengraat </td><td> DNA / RNA </td></tr><tr><td> 1003 - 1005 </td><td> Fenylalanine </td><td> Eiwit </td></tr><tr><td> 1220-1280 </td><td> Amide III </td><td> Eiwit </td></tr><tr><td> 1445-1447 </td><td> CH2 </td><td> Eiwit / Lipid </td></tr><tr><td> 1655-1680 </td><td> Amide IC = C </td><td> Eiwit Lipid </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Raman banden die zijn gedetecteerd spectra van celtypen (fibroblasten, MSC, chondrocyten en keratinocyten).

<ol><li>Chan, J. W., Lieu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biochemical+characterization+of+stem+cells+using+vibrational+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Label-free biochemical characterization of stem cells using vibrational spectroscopy.</a> J. Biophotonics. 2, 656-668 (2009).</li>
<li>Downes, A., Mouras, R., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+spectroscopy+for+noninvasive+monitoring+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optical spectroscopy for noninvasive monitoring of stem cell differentiation.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 101864-101864 (2010).</li>
<li>Gentleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+materials+differences+revealed+in+engineered+bone+as+a+function+of+cell-specific+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Comparative materials differences revealed in engineered bone as a function of cell-specific differentiation.</a> Nat. Mater. 8, 763-770 (2009).</li>
<li>Notingher, I., Hench, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+microspectroscopy%3A+a+noninvasive+tool+for+studies+of+individual+living+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Med.+Devices%22%5BJournal%5D)">Raman microspectroscopy: a noninvasive tool for studies of individual living cells in vitro.</a> Expert. Rev. Med. Devices. 3, 215-234 (2006).</li>
<li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+preservation+of+extracellular+matrix+in+cardiac+tissues%3A+implications+for+long-term+graft+durability%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Optimized preservation of extracellular matrix in cardiac tissues: implications for long-term graft durability.</a> Ann. Thorac. Surg. 83, 1641-1650 (2007).</li>
<li>Raman, C. V., Krishnan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+type+of+secondary+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new type of secondary radiation.</a> Nature. 122, 12(1928).</li>
<li>Frushour, B. G., Koenig, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+scattering+of+collagen%2C+gelatin%2C+and+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Raman scattering of collagen, gelatin, and elastin.</a> Biopolymers. 14, 379-391 (1975).</li>
<li>Pudlas, M., Koch, S., Bolwien, C., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+as+a+tool+for+quality+and+sterility+analysis+for+tissue+engineering+applications+like+cartilage+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Artif.+Organs%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy as a tool for quality and sterility analysis for tissue engineering applications like cartilage transplants.</a> Int. J. Artif. Organs. 33, 228-237 (2010).</li>
<li>Votteler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+for+the+non-contact+and+non-destructive+monitoring+of+collagen+damage+within+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy for the non-contact and non-destructive monitoring of collagen damage within tissues.</a> J. Biophotonics. , (2011).</li>
<li>Wold, S., Esbensen, K., Geladi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principal+component+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometrics+and+Intelligent+Laboratory+Systems%22%5BJournal%5D)">Principal component analysis.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2, 37-52 (1987).</li>
<li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+Spectroscopy%3A+A+Noninvasive+Analysis+Tool+For+The+Discrimination+of+Human+Skin+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Raman Spectroscopy: A Noninvasive Analysis Tool For The Discrimination of Human Skin Cells.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 10, (2011).</li>
<li>Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. Raman Spectroscopy of Biological Tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42, 493-541 (1080).</li>
<li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-contact+discrimination+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+and+fibroblasts+using+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Laser+Application%22%5BJournal%5D)">Non-contact discrimination of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts using Raman spectroscopy.</a> Medical Laser Application. 26, 119-125 (2011).</li>
<li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+elastic+tissue+biology%3A+elastin+isolation+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods in elastic tissue biology: elastin isolation and purification.</a> Methods. 45, 32-41 (2008).</li>
<li>Downes, A., Mouras, R., Bagnaninchi, P., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+and+CARS+microscopy+of+stem+cells+and+their+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy and CARS microscopy of stem cells and their derivatives.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 42, 1864-1870 (2011).</li>
<li>Krafft, C., Dietzek, B., Popp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+and+CARS+microspectroscopy+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues.</a> Analyst. 134, 1046-1057 (2009).</li>
<li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+multiphoton+imaging+of+extracellular+matrix+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Non-invasive multiphoton imaging of extracellular matrix structures.</a> J. Biophotonics. 1, 451-462 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Raman spectroscopie is een geschikt hulpmiddel om biologische monsters, zoals het analyseren van in vitro-gekweekte cellen en ECM eiwitten en cellen in cellen. 11,15,16 Hier hebben we aangetoond dat deze non-contact, label-free techniek maakt het mogelijk de discriminatie van verschillende celtypes en de detectie van ECM afbraak van eiwitten uitsluitend gebaseerd op de intrinsieke biomoleculaire samenstelling van deze biologische monsters. Het grote voordeel van Raman spectroscopie is het vermogen om niet-invasief meten van de biochemische vingerafdruk van een monster door de resulterende Raman spectra. In tegenstelling tot infrarood spectroscopie, die vergelijkbare informatie oplevert, kan Raman spectra worden verzameld uit waterige monsters, zoals de Raman verstrooiing uit het water zwak is. Bovendien wordt Raman spectroscopie uitsluitend gebaseerd op de detectie van terugverstrooiing van monochromatisch licht, dus geen monster verwerking vereist voor meting. Deze attributen maken Raman spectroscopie een veelbelovend alternatief voor potentiële in vivo imaging-toepassingen. In dit gebied, coherent anti-Stokes Raman spectroscopie (CARS) is een zeer interessante techniek omdat het in staat stelt sneller en meer gevoelige verwerving van gegevens op basis van dezelfde vibratie signalen gebruikt in onze experimenten. 15,16 Andere alternatieve methoden, met inbegrip multifoton-geïnduceerde autofluorescentie en tweede frequentieverdubbeling beeldvormende eerder gebleken geschikt voor het bewaken biologische monsters niet of weinig invasief 17. Maar deze beeldvorming geassocieerd met zeer hoge kosten en zijn beperkt tot autofluorescentie genereren moleculen. Bovendien Raman spectrometer gemakkelijk te combineren met conventionele optische microscoop. Deze eigenschappen maken Raman spectroscopie een waardevol instrument om biologische monsters te studeren in fysiologische omgevingen. Een van de huidige beperkingen van onze Raman spectroscopie opgezet isde relatief kleine laser focus (250 nm volle breedte half maximum (FWHM) lateraal en 700 nm FWHM axiale) dat is gemaakt door een hoge numerieke apertuur doel (NA = 1,2). Hoewel een hoge numerieke apertuur toelaat betrekking op een goede hoeveelheid van het uitgezonden licht Raman waardoor een hoge signaal-ruisverhouding hoge NA produceert slechts een verzameling aandacht in het monster die doorgaans veel kleiner dan een cel. Om vergelijken Raman spectra van verschillende cellen, het verzamelen van een representatieve spectrum essentieel, die moeilijk te verkrijgen met een focusgebied. Om dit probleem aan te pakken, werken we aan een proces om het signaal collectie te automatiseren op verschillende punten in de cel (= Raman spectroscopische mapping), wat resulteert in een spectraal gemiddeld en toegeven aan een representatief spectrum. Bovendien kan deze techniek geven een overzicht van de verdeling van specifieke Raman banden, bijvoorbeeld van het eiwit verdeling in een cel. Bioltief voor farmacologische monsters zijn zeer complex en bestaan ​​uit een heterogeen mengsel van biomoleculen die bijdragen aan de verzamelde Raman spectra. Daarom is de spectrale patroon is zeer complex en het toezicht op een type van een molecuul in een Raman spectrum is moeilijk te bereiken met de overlapping van verschillende molecuul signalen. Daarnaast kan de intrinsieke fluorescentie van het monster te maskeren waardevolle informatie van de zwakkere Raman signalen. Interessant is dat in sommige van onze vorige studies hebben we geïdentificeerd autofluorescentie in de Raman-spectra als de belangrijkste onderscheidende factor tussen celtypes (MSC&#39;s en fibroblasten) met behulp van een geschikte analyse-instrument. 13 We stelden ook vast dat veranderingen in de algemene Raman intensiteit van het signaal kan dienen als een indicator voor de staat van collageen en collageen vezels in de ECM van aortaklep folders. 9 Echter, bij het ​​analyseren van de toestand van elastine in deze weefsels, waren we niet in staat om vergelijkbare resultaten te detecteren. Zoals in het resultaats paragraaf wordt konden alleen veranderingen in bepaalde Raman banden detecteren in de elastase-behandelde monsters in vergelijking met de oorspronkelijke controles. We niet van een afname van de totale Raman signaal in het enzymatisch behandelde monsters verwacht. Deze waarnemingen resulteerde in een score plot die niet blijkt duidelijk clustervorming zoals in de vorige studie. 9 daarentegen de invloed van de enzymatische behandeling detecteerbaar in de PCA resultaten. We veronderstellen dat deze verschillen tussen de twee ECM eiwitten elastine en collageen, zijn gebaseerd op morfologische verschillen en verschillende enzymatische afbraak processen: in de aortaklep bijsluiter het collageen rijk gebied (fibrosa) een continue laag die raakt los door de enzymatische behandeling, waarbij de elastine met zone (ventricularis) een netwerkconfiguratie weergegeven gefragmenteerd na blootstelling aan elastase (Fig. 4). Single ter plekke metingen waren dus niet appropriaten om dergelijke kleine breuken te detecteren binnen het elastine netwerk. Hier zou een Raman in kaart brengen van het weefsel te helpen om te netwerken storingen te identificeren. Een ander probleem bij Raman spectroscopie van biologische monsters is om de meettijden. Een oplossing is om de laservermogen, dat geschikt is zolang de biologische monsters niet beïnvloed door foto-schade. Al onze huidige experimenten zijn proof-of-principle studie zich richt op fundamenteel onderzoek, maar onze algemene doel is om Raman spectroscopie te voeren voor klinische toepassingen, zoals regeneratieve geneeskunde (bv. kwaliteitscontrole van tissue-engineered producten), pre-transplantatie graft monitoring en diagnose van kanker.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> elastase </td><td> Worthington </td><td> LS006363 </td><td></td></tr><tr><td> anti-elastine antistoffen </td><td> Sigma </td><td> HPA018111 </td><td> 1:75; citraatbuffer </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Lonza </td><td> 17 512F </td><td></td></tr><tr><td> glazen bodem gerechten </td><td> Greiner BioOne </td><td> 627860 </td><td></td></tr><tr><td> De Unscrambler </td><td> CAMO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opus </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-contact, label-free monitoring van cellen en extracellulaire matrix met behulp van raman spectroscopie

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Niet-destructieve, non-contact en label-free technologieën om cel-en weefselculturen monitoren nodig zijn op het gebied van biomedisch onderzoek. 1-5 echter op dit moment beschikbaar zijn routinematige methoden vereisen de verwerking van stappen en te veranderen monster integriteit. Raman spectroscopie een snelle methode die de meting van biologische monsters kunnen zonder verdere processtappen. . Deze laser gebaseerde technologie detecteert de inelastische verstrooiing van monochromatisch licht 6 Zoals elk chemisch trilling wordt toegewezen aan een specifieke Raman band (golfgetal in cm -1), die elk biologisch monster beschikt over een typisch spectrale patroon vanwege hun specifieke biochemische samenstelling 7. - 9 Binnen Raman spectra, de piek intensiteiten correleren met het bedrag van de huidige moleculaire bindingen. 1 Overeenkomsten en verschillen van de spectrale gegevens kan worden gedetecteerd door het gebruik van een multivariate analyse (bijvoorbeeld principal component analyse (PCA)) 10. </sup&gt; Hier voeren we Raman spectroscopie van levende cellen en cellen. Cellen worden uitgezaaid hetzij op glas bodem schalen of in suspensie onder normale celcultuur condities (37 ° C, 5% CO2) voor meting. Natieve weefsels worden ontleed en opgeslagen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C voor metingen. Afhankelijk van de experimentele opstelling wij vervolgens gericht op de celkern of extracellulaire matrix (ECM) eiwitten zoals elastine en collageen. Voor alle studies, zijn een minimum van 30 cellen of 30 willekeurige punten van belang in de ECM gemeten. Verwerking van gegevens stappen te ondernemen die achtergrond aftrek en normalisatie.

Raman spectroscopie is een geschikte techniek voor de non-contact, label-free analyse van levende cellen, weefsel-engineering constructen en cellen. Bronspecifieke spectrale vingerafdrukken worden gegenereerd en geanalyseerd met multivariate analyse.

Non-contact, Label-free monitoring van cellen en extracellulaire matrix met behulp van Raman spectroscopie

Niet-destructieve, contactloze en labelvrije technologieën voor het monitoren van cel- en weefselculturen zijn nodig in het veld van het biomedisch onderzoek.1-5 Echter, ...

Het algemene doel van deze procedure is om cellen en weefsels te monitoren via een contactloze en marker-vrije methode. Dit wordt bereikt via Raman-spectroscopie, een lasergebaseerde technologie die de inelastische verstrooiing van monochromatisch licht detecteert, waarbij een kenmerkend spectraal patroon voor elk biologisch monster wordt geproduceerd op basis van de inherente biochemische samenstelling, gebruikmakend van een standaard fluorescentiemicroscoop gekoppeld aan een Raman-spectrometer. Directe vergelijking van brightfield- en fluorescentiebeelden met Raman-spectra wordt gebruikt om talrijke biologische monsters te monitoren.Aan elke chemische vibratie wordt een specifieke Ramanband toegewezen, en de piekintensiteit is gecorreleerd met de hoeveelheid aanwezige moleculaire bindingen. Overeenkomsten en verschillen in de spectrale datasets worden gedetecteerd. Door gebruik te maken van een multivariate analyse kunnen de resulterende spectra worden gebruikt om de integriteit van weefsels na het nemen van een biopsie te controleren of om de steriliteit van geïsoleerde cellen aan te tonen.Daarnaast maakt deze techniek de karakterisering en identificatie van verschillende celtypen in vitro mogelijk. Uiteindelijk is ramenspectroscopie een veelbelovende lasergebaseerde techniek voor weefseltechnologie en klinische toepassingen door middel van contactloze, labelvrije analyse. De procedure zal worden gedemonstreerd door Daniel Cabal Barrio, een technicus, en Miriam Tala, een promovendus in mijn laboratorium. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande routinemethoden, zoals histologie en immunofluorescentie-imaging, is dat er geen monsterbewerking vereist is.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de status van individuele cellen en matrixcomponenten, kan zij ook worden toegepast op multicellular weefsels en organen. Om aangepaste Raman-spectra te verkrijgen, wordt een standaard fluorescentiemicroscoop gekoppeld aan een Raman-spectrometer, waardoor directe vergelijking van fluorescentiebeelden met Raman-spectra mogelijk is. De basisopstelling bestaat uit een diodelaser van 784 nanometer, een notchfilter voor de scheiding van het verstrooide Raman-licht van het excitatielicht, een microscoop en een spectrograaf met een charge-coupled device die is geoptimaliseerd voor de detectie van spectrale informatie.Om de laserfunctie te regelen, start u de software en/of Solace en stelt u de temperatuur van de CCD-camera in op -60 °C om de ruis te minimaliseren die wordt veroorzaakt door thermisch geïnduceerde stromingen in de camera. Plaats een siliciumwafer op de microscopietafel voor de kalibratieprocedure. Schakel de laser in en stel het vermogen in op 85 milliwatts.Gebruik de softwarecel B om de laser op de wafer te focussen totdat XY verschijnt. Meet de siliciumwafer met een enkele integratietijd van één seconde. Verander, met behulp van een 60 X luchtobjectief, de eenheid van de X-as van pixelnummer naar ramen.Pas in de Soli-software de laserfocus van de siliciumpiek bij golfgetal 520 in het verzamelde spectrum aan. Om de maximaal mogelijke intensiteit voor deze Ramanband te vinden, moet het minimum aantal counts hoger zijn dan 11 000 voor een succesvolle kalibratie voorafgaand aan de spectrale meting; bereid de biologische monsters voor zoals beschreven in het bijbehorende geschreven protocol van deze video. Alle metingen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.Gebruik een 60x waterimmersie-objectief met een numerische apertuur van 1,2; spectra moeten worden verzameld met 10 integraties per 10 seconden, voor een totaal van 100 seconden per meting. Om metingen uit te voeren bij adherente cellen, plaatst u een glazen bodemschaal met de cellen op de microscooptafel. Om een beter signaal te verkrijgen en reproduceerbaarheid te waarborgen, focust u de laser op de celkern, schakelt u het microscooplicht uit en start u met het verzamelen van het spectrum.Meet elke 10 spectra een referentiespectrum van de achtergrond door de laserfocus naast de cel te verplaatsen. Het is belangrijk om rekening te houden met het feit dat bij het wijzigen van de focus voor elke focusdiepte een nieuwe achtergrond moet worden verzameld. Om cellen in suspensie te meten, brengt u alternatief 100 µL van de celsuspensie over in een glazen bodemschaal.Nadat het monster op de microscooptafel is geplaatst, focust u de laser op het centrum van de cel, schakelt u het microscooplicht uit en begint u opnieuw met het verzamelen van het spectrum. Meet elke 10 spectra een referentiespectrum van de achtergrond door de laserfocus naast de cel te verplaatsen. Om de spectra van natuurlijke weefsels te meten, plaatst u het monster in een schaal met glazen bodem.Het interessegebied moet naar de bodem van de schaal zijn georiënteerd. Vul de schaal met voldoende PBS om het monster te bedekken. Plaats een dekglas over het monster om elke beweging van het monster te voorkomen.Stel tijdens de metingen de laserfocus in op de betreffende structuur en begin met het verzamelen van de spectra. Verzamel elke 10 spectra een referentiespectrum van de achtergrond door de laserfocus buiten het gehele weefselgebied te verplaatsen; verzamel bij de spectrale meting van immunofluorescentie-gelabelde cryosneden altijd een nieuwe achtergrond voor elke focusdiepte. Snijd verse, snelgevroren weefselmonsters.Monteer de secties op met silica gecoate dekglasjes met behulp van een standaard cryotoom. Kleur de cryosecties volgens een routineprotocol voor immunofluorescentie, waarbij slechts een korte fixatiestap wordt toegepast en geschikte antilichamen worden gebruikt voor de detectie van het betreffende eiwit. Voer Raman-metingen uit waarbij de focus ligt op het gebied waar fluorescentie optreedt.Om experimenten naar elastinedegradatie te demonstreren, worden de ventrikels van gedisseceerde porcine aortaklepbladjes zodanig gepositioneerd dat ze naar de bodem van de glazen schaal zijn gericht. Meet het natuurlijke weefsel als niet-geincubeerde controle op 30 willekeurige punten over het gehele weefseloppervlak.Focus op de fibrillaire structuren, verdeel het monster in twee secties en plaats deze in afzonderlijke eppendorfbuisjes van 2,5 milliliter gevuld met twee milliliter elastase-oplossing. Incubeer het weefsel gedurende 15 of 30 minuten bij 37 °C. Verwijder na incubatie de weefsels uit het buisje en was ze zorgvuldig met PBS om de enzymatische reactie volledig te stoppen.Meet elk monster op 30 willekeurige punten, waarbij u zich richt op de fibrillaire structuren. De verwerking van de Ramanspectra begint met de voorbehandeling van de gegenereerde spectra met behulp van Opus-software. Trek eerst het overeenkomstige achtergrondspectrum af van de verzamelde spectra om storende signalen van het glas en het medium te verminderen, alsmede om variaties door veranderingen in de focus te voorkomen.Reduceer tijdens de metingen de spectra indien nodig tot het golfgetalgebied tussen 401 en 800, aangezien dit de meeste informatie biedt. Normaliseer de spectra via maximale pieknormalisatie om intensiteitsschommelingen door systematische fouten te elimineren, waardoor de detectie van structurele veranderingen in de monsterspectra wordt vereenvoudigd. Voer een basislijncorrectie uit om de vergelijkbaarheid tussen verschillende experimenten te vergroten.Analyseer de Raman-spectra met behulp van principale componentenanalyse of PCA met de Unscrambler-software. Deze multivariate analyse detecteert verschillen en overeenkomsten binnen de spectrale datasets. Elk spectrum wordt uitgezet als één enkel punt in een multidimensionale ruimte, gebaseerd op de verzamelde counts voor elke Raman-shift.Elke hoofdcomponent, afgekort als PC, beschrijft een bepaalde hoeveelheid van de totale informatie die in de oorspronkelijke gegevens is opgenomen. De eerste PC is degene die de grootste bron van variatie bevat. Elke volgende PC bevat opeenvolgend minder informatie dan de voorgaande.Elke variabele heeft een score en een lading op elke PC. Door de PC's uit te zetten, kunnen belangrijke correlaties tussen monsters worden blootgelegd. De ladingen beschrijven de bijdrage van elke geanalyseerde variabele aan de PCA. Label elke groep metingen door rijbereiken voor elke monstergroep aan te maken, gebruik de volgende basisinstellingen voor de PCA-kruisvalidering: het Nip Al-algoritme, geen rotatie, en start de analyse.Deze instellingen zijn afhankelijk van de spectra. Ten slotte wordt de PCA uitgevoerd; de ruwe Raman-spectra die gegenereerd worden vanuit adherente cellen vertonen vaak een lage signaal-ruisverhouding en een lage algemene signaalintensiteit. De laserfocus moet dicht bij de glazen bodem worden ingesteld, wat het werkelijke signaal van het monster maskeert.Bijgevolg kan het signaal van het monster worden geminimaliseerd of zelfs volledig verdwijnen tijdens een daaropvolgende achtergrondsubtractie. Omgekeerd maken cellen en suspensies de detectie van meer gedetailleerde spectrale informatie mogelijk. De spectra van adherente cellen en suspensiecellen vertonen echter dezelfde belangrijkste pieken, die slechts verschillen in hun intensiteiten; voor de karakterisering van verschillende celtypen binnen een suspensie is geen voorbehandeling vereist.Hier zijn de gemiddelde Raman-spectra en standaarddeviaties afgebeeld van menselijke fibroblasten, mesenchymale stamcellen, chondrocyten en keratinocyten, gemeten in suspensie. Alle Raman-spectra zijn op een vergelijkbare manier gestructureerd, met pieken die afkomstig zijn van typische biomoleculen zoals eiwitten, nucleïnezuren en lipiden. Voor deze celtypen bevat het spectrale gebied tussen golfgetal 601 en 800 de meest relevante spectrale informatie, waarmee duidelijke verschillen tussen de verschillende celtypen detecteerbaar zijn.Eén exemplarische spectrale regio vertoont duidelijke structurele verschillen, die kunnen worden toegeschreven aan moleculaire vibraties van collageen en lipiden. Daarentegen zijn morfologische analyses niet geschikt voor de identificatie en het onderscheid van de meeste cellen. Hoewel het verschil tussen chondrocyten en huidcellen observeerbaar is, zijn fibroblasten en mesenchymale stamcellen moeilijk van elkaar te onderscheiden.Door uitsluitend gebruik te maken van helderveldmicroscopie voor de toewijzing van inheems weefsel aan een specifiek vingerafdrukspectrum, werden Raman-spectra gegenereerd van commercieel beschikbare zuivere eiwitten en immunohistochemisch gekleurde cryosneden. Hierbij werden vingerafdrukspectra van elastische vezels in inheems weefsel geïdentificeerd door deze te vergelijken met gelyofiliseerd elastine en immunofluorescentie-gekleurde cryosneden die waren gelabeld met een antilichaam tegen elastine. Echter, aangezien elastine een hoge autofluorescentie vertoont, wat wordt weerspiegeld in de Raman-spectra, is de data-analyse uitdagend om systematische fouten als gevolg van monsterspecifieke eigenschappen zoals autofluorescentie te verminderen, en is een adequate verwerking van de datasets cruciaal.Bij de data-analyse werd normalisatie gebruikt om de significant hogere signaalintensiteit van het zuivere elastine-eiwit te elimineren, wat resulteerde in vergelijkbare Raman-spectra. Elastine is een van de meest stabiele extracellulaire matrixeiwitten in het lichaam en is daarom zeer moeilijk afbreekbaar. Hier.Elastine-degradatie werd geïnduceerd in gezonde porcine aortaklepbladen door een enzymatische digestie uit te voeren. Door middel van multivariate analyse, PCA, werden significante verschillen geïdentificeerd tussen de Raman-spectra van enzymatisch behandelde monsters en natuurlijke controles. Deze spectrale verschillen werden waargenomen in het loadingspectrum bij golfgetallen 861, 1003 en 1.664. De verwachte structurele veranderingen in de elastinebevattende vezels als gevolg van verlengde blootstellingstijden aan elastase werden weerspiegeld in meer duidelijk scheidbare score-clusters. Hier worden de scores getoond van de vergelijking tussen de onbehandelde controle en enzymatisch gedegradeerde elastische vezels binnen het natuurlijke weefsel. Deze verwachte structurele veranderingen zijn ook duidelijk zichtbaar in de gekleurde porcine aortaklepbladen, zoals gevisualiseerd in dit inzetstuk door de onbehandelde controle te vergelijken met de weefselmonsters die gedurende 30 minuten zijn blootgesteld aan het elastine-integrerende enzym elastase.Deze techniek maakt het voor onderzoekers in de cel- en matrixbiologie, evenals in de regeneratieve geneeskunde en tissue engineering, mogelijk om niet alleen real-time fenotype-analyse van cellen uit te voeren, maar ook om cruciale cel-cel- en cel-matrixinteracties in Z twee te identificeren binnen een natuurlijke omgeving.

non-contact-label-free-monitoring-cells-extracellular-matrix-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We bespreken de bouw en exploitatie van een complex niet-lineaire optische systeem dat ultrasnelle all-optisch schakelen gebruikt om te isoleren Raman van fluorescentie-signalen. Met behulp van dit systeem zijn wij in staat om succesvol scheiden Raman en fluorescentie-signalen gebruik te maken van puls energie en de gemiddelde krachten die blijven biologisch veilig.

Verwerping van Fluorescentie Achtergrond in Resonance en spontane Raman Microspectroscopie

We beschrijven de fabricage en karakterisering van nanobiologische systemen die geïnterfacede nanogestructureerde substraten met geïmmobiliseerde eiwitten en aptameren. De relevante experimentele stappen met betrekking tot lithographische fabricage van nanogestructureerde substraten, bio-functionalisering en karakterisering met behulp van oppervlakte-versterkte Raman-spectroscopie (SERS) worden gerapporteerd. SERS-detectie van op het oppervlak geïmmobiliseerde eiwitten en het onderzoek van...

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detectie van biomoleculen met behulp van EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Intercellulaire communicatie kritisch om diverse fysiologische activiteiten binnen en buiten de cel. Dit document beschrijft een protocol voor het meten van de ruimtelijke en temporele karakter van enkele cel afscheidingen. Om dit te bereiken, is een multidisciplinaire aanpak waarin label-free nanoplasmonic sensing met live-cell imaging integreert.

A-Label gratis Techniek voor de ruimte en tijd Imaging van Single Cell afscheiding

In dit manuscript wordt de implementatie beschreven van een gestimuleerde Raman verstrooiing (SRS) Microscoop, verkregen door de integratie van een SRS experimentele opstelling met een laser scanning microscoop. De SRS-Microscoop is gebaseerd op twee femtosecondelaser (FS) laserbronnen, een TI-Sapphire (TI: SA) en gesynchroniseerde optische parametrische oscillator (OPO).

Implementatie van een niet-lineaire Microscoop op basis van gestimuleerde Raman verstrooiing

Dit protocol presenteert een geïntegreerde Ramanspectroscopie-massaspectrometrie (MS) platform dat is geschikt voor het bereiken van één-cel resolutie. Raman-spectroscopie kan worden gebruikt om cellulaire reactie op drugs te bestuderen, terwijl MS kan worden gebruikt voor gerichte en kwantitatieve analyse van de opname van geneesmiddelen en metabolisme.

Een geïntegreerde Raman-spectroscopie en massaspectrometrie platform voor het bestuderen van de opname van één cel drug, metabolisme, en effecten

Gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie maakt selectieve, labelvrije beeldvorming van specifieke chemische moieties mogelijk en het is effectief gebruikt om lipidemoleculen in vivo in beeld te brengen. Hier geven we een korte inleiding tot het principe van SRS-microscopie en beschrijven we methoden voor het gebruik ervan bij de opslag van beeldvormende lipiden in Caenorhabditis elegans.

Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie

In deze studie ontwikkelden we een goedkope oppervlakte-verbeterde Raman scattering (SERS) -gebaseerde vingerafdruk nanoprobe met gunstige biocompatibiliteit om labelvrije levende celbioimaging te tonen en twee bacteriestammen te detecteren, die in detail laten zien hoe SERS-spectra van levende cellen kunnen worden verkregen in een niet-destructieve methode.

Labelvrije oppervlakte-verbeterde Raman Scattering Bioanalyse op basis van Au@Carbon Dot Nanoprobes

Dit protocol presenteert een multimodale benadering die Raman-spectroscopie en tomografische fasemicroscopie combineert voor labelvrije, niet-invasieve fenotypering van levende menselijke borstkankercellen. Het omvat een gebruiksvriendelijke, menselijke bias-vrije analysepijplijn voor snelle, kwantitatieve morfochemische analyse, die gedetailleerde moleculaire en structurele inzichten biedt met toepassingen in kankeronderzoek en celbiologie.

Een multimodaal beeldvormingskader om fenotypering van levende labelvrije borstkankercellen te bevorderen

Een grootveld-Fourier-transform microscoop, gebaseerd op een compacte en ultrastabiele birefringent interferometer, maakt het mogelijk om spectra parallel te verkrijgen voor alle pixels van een 2D-detector. De tijddomeinbenadering maakt het mogelijk fotoluminescentie- en Raman-signalen te ontwarren, en maakt snelle Raman-mapping mogelijk (~5 ms/pixel) met een ruimtelijke resolutie van ~1 μm en een spectrale resolutie van 23 cm-1 .

Een multimodale breedveld-Fourier-transformatie Ramanmicroscoop

Deeltjes volgen microrheology kunnen worden gebruikt om niet-destructieve kwantificeren en veranderingen in extracellulaire matrix mechanische eigenschappen in 3D tumormodellen ruimtelijk in kaart.

Longitudinale Meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D Tumor modellen met-Particle Tracking Microreologie

Leer Raman-spectroscopie voor het labelvrij monitoren van cellen en extracellulaire matrix zonder contact. Deze methode analyseert biochemische samenstelling via spectra en multivariate analyse.

Non-contact, Label-free monitoring van cellen en extracellulaire matrix met behulp van Raman spectroscopie

Meer video's verkennen