Oprichting van Microbiële Eukaryote Enrichment Culturen van een chemisch Stratified Antarctic Lake en Beoordeling van Carbon Fixatie Potentiële

Het algemene doel van deze procedure is om verrijkingsculturen van protisten te produceren uit het Antarctische Lake Bonnie, en koolstoffixatie te meten als een initiële indicator voor metabole diversiteit. Dit wordt bereikt door eerst monstername uit te voeren op dieptes in Lake Bonnie die overeenkomen met bekende pieken in protisten en fytoplankton. De monsters lake water worden vervolgens geïnoculeerd in diverse groeimedia en gedurende vier tot zes weken geïncubeerd in een groeikamer die is uitgerust met een temperatuurregelaar en verlichting.

De culturen kunnen indien nodig worden getransporteerd bij vier graden Celsius. De volgende stap is het extraheren van ruwe celllysaten uit de verrijkingsculturen. De laatste stap van deze procedure is het beoordelen van het koolstoffixatiepotentieel in het cellysaat met behulp van een radio-isotopenassay voor ribulose-1,5-bisfosfaatcarboxylase/oxygenase- of Rubisco-activiteit.

Uiteindelijk tonen de verrijkingsculturen van protisten een variatie in het potentieel voor koolstoffixatie binnen de natuurlijke protistengemeenschap. Deze methode kan ons helpen om kernvragen te beantwoorden over de microbiële ecologie van meren. Bijvoorbeeld de rol van microbiële eukaryoten in de koolstofcyclus tijdens verschillende fasen in gestratificeerde Antarctische meren.

Hoewel het bemonsteren van de waterkolom voor opeenvolgende generaties van verrijkingsculturen een veelgebruikte techniek is, bevat deze methode aanpassingen om te kunnen werken in een extreem koude omgeving waar onvoorziene complicaties kunnen optreden. Ik bedacht deze methode voor het eerst toen ik nadacht over manieren om de Redisco-assay te testen in natuurlijke meermonsters. Visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de bemonsteringsstappen moeilijk voor te stellen zijn omdat de bemonsteringslocaties zich bevinden in een omgeving die voor veel onderzoekers vreemd is.

Monsters worden verzameld uit Lake Bonnie, een van de vele permanent met ijs bedekte meren in de McMurdo Dry Valleys in Antarctica. Kies één dag voor het bemonsteren van de waterkolom de bemonsteringslocatie en bereid deze voor. Dit stelt de gestratificeerde lagen van de waterkolom in staat om zich te herstellen na verstoring door boorwerkzaamheden en het smelten van het ijsgat. Identificeer de locatie van de boorplaats via GPS om toegang te krijgen tot de waterkolom.

Begin met het boren van een gat door het ijs met een Jiffy Ice-boor bevestigd aan een Jiffy-verlengstuk en boorkop van vier inch om te voorkomen dat de boor in het gat vastvriest. Probeer te voorkomen dat er in het vloeibare water wordt geboord door het boren te stoppen op ongeveer vier tot zes inch boven de bovenkant van de waterkolom. Het boorgat moet voor de bemonstering worden verbreed van een diameter van zes inch naar twee voet.

Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een hot sea model hole melter die verhitte polyethyleenglycol door een koperen pijpgat circuleert. Het smelten duurt gewoonlijk tot 18 uur op de dag voorafgaand aan het bemonsteren van de waterkolom. Zorg ervoor dat alle benodigde apparatuur en bemonsteringsvaten op de bemonsteringslocatie verzameld zijn.

De bemonsteringsmaterialen omvatten een NICU-fles met een capaciteit van vijf tot 10 liter, een lier met dieptegekalibreerde kabel, voldoende monsterflessen voor elke bemonsteringsdiepte, een messenger en koelboxen voor het transport van de monsters. Begin de bemonstering vroeg op de dag, rond 5:00 uur, aangezien het filteren van het meerwater op de dag van bemonstering voltooid moet zijn. Gebruik hiervoor een kin-sampler die is bevestigd aan een gekalibreerde handlier.

Verzamel watermonsters van één tot vijf liter op de voor deze studie gewenste diepten. De bemonsteringsdiepten zijn zes meter, 15 meter en 18 meter, gemeten vanaf het PI-symmetrische waterniveau in het ijsgat. Bewaar de meermonsters in koelboxen en transporteer deze van de bemonsteringslocatie naar het veldlaboratorium.

Met behulp van een slee die is bevestigd aan een ATV moeten monsters in het veldlaboratorium worden verwerkt of gestabiliseerd. Direct na de bemonstering moet de kweek van verrijkingsculturen worden gestart zodra de monsters naar het veldlaboratorium zijn getransporteerd. Concentreer 0,5 tot één liter meerwater op een filter van 47 millimeter met een poriegrootte van 0,45 micron.

POLYETHERSulfonfilters met behulp van milde filtratie. Indien de diversiteit van de natuurlijke gemeenschap gewenst is, wordt een tweede monster gefiltreerd op 47 millimeter, 0,45 micron poriegrootte.

Bevries de polyethersulfonfilters snel in vloeibare stikstof. Breng elk filter over naar een steriele Falcon-buis van 50 milliliter die ongeveer 20 milliliter gefilterd meerwater bevat, verzameld op dezelfde bemonsteringsdiepte als het filter.

Overbreng de celsuspensie naar een steriele kweekfles voor celculturen van 25 centimeter vierkant voor verrijkingen op verschillende culturemedia. Stel meerdere replica's op voor elke bemonsteringsdiepte. Vul elke kweekfles aan met 50 x steriele oplossingen van de volgende culturemedia: bold basil medium, BG 11 en F twee.

Indien de kweek van mixotrofe organismen vereist is, stel dan twee supplementeerden F twee-vaten op en voeg twee tot drie korrels steriele rijst toe aan één van de incubatiekweekkolven; incubeer deze bij een lage temperatuur en een lagere radiantie in een temperatuurgecontroleerde groeincubator gedurende ten minste vier weken voorafgaand aan de verzending naar het laboratorium in de VS. Draag de verrijkingsculturen over naar steriele 50 milliliter Falcon-buisjes. Vermeld op het verzendingsverzoek de verzendingsvereisten "niet vriezen" en "koel houden". Na aankomst in de VS worden vijf milliliters van elke verrijkingscultuur overgebracht naar 45 milliliters van het geschikte groeimedium in een 125 milliliter kolf.

Steriele Erlenmeyer-kolf afgesloten met een steriele spons. Voor het onderhouden van verrijkingsculturen als staande culturen in een temperatuurgecontroleerde groeikamer van 4 °C en lagere straling, worden de culturen elke 30 dagen overgezet naar vers medium. Om de procedure voor het extraheren van cellysaten te starten, worden vijf liter van de verrijkingscultuur met een zacht vacuüm gefilterd op een 25 millimeter Watman GF/F-filter.

Knip vervolgens het filter met steriele stalen scharen in vier tot vijf secties. Gebruik daarna steriele pincetten om de stukjes over te brengen naar een schroefdopbuisje van twee milliliter dat voor één vijfde gevuld is met 0,1 millimeter diameter.

Zirconia-silicakralen. Voeg 1,25 milliliters filterextractiebuffer toe aan de buis en disrupt vervolgens de cellen met een mini-bead beader gedurende 30 seconden op een snelheidinstelling van 48, gevolgd door één minuut op ijs. Herhaal het bead-beating proces nog twee keer, met tussen elke beurt een incubatie van één minuut op ijs om opwarming van het monster tijdens het centrifugeren te voorkomen.

Filter de suspensie gedurende twee minuten bij 3000 ×g bij vier graden Celsius. Er vormt zich een losse pellet van GFF-filtervezels en celwandresten. Verwijder een aliquoot van 200 µL van de pellet en dompel deze onder in 800 µL ijskoud 90% acetone.

Breng het resterende supernatant over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Meet het extraheerbare chlorofyl A in een spectrofotometer bij golflengtes van 664 nanometers en 647 nanometers. Centrifugeer het resterende supernatant gedurende twee minuten bij 15.000 ×g bij vier graden Celsius.

Overbreng de S naar een schone microcentrifugebuis van 1,5 milliliter, terwijl u het pellet van onoplosbare celmembranen en overgebleven GFF-filtervezels vermijdt. Dit oplosbare cellysaat kan nu worden gebruikt in de rubisco-carboxylase-activiteitsassay, die hierna zal worden gedemonstreerd. Om deze assay te starten, overbrengt u 125 microliters van elk oplosbaar lysaat naar een 1,5 schroefdop microcentrifugebuis die op ijs is gekoeld.

Voeg voor negatieve controlemonsters 125 µL oplosbare lysaat toe aan een 1,5 mL schroefdop microcentrifugebuis, maar voeg geen substraat toe. Voer later dubbele reacties uit voor alle monsters en negatieve controles. Bereid 10 mL assaybuffer vers en koel deze op ijs.

Voeg voldoende assaybuffer voor alle monsters en negatieve controles toe aan een buisje van vijf milliliter. Vanaf dit punt moeten alle stappen onder een zuurkast worden uitgevoerd. Voeg C 14-gelabeld natriumbicarbonaat toe aan de toegewezen buffer en bewaar de buffer op ijs.

Verwijder 10 µL van de assaybuffer die C 14 bevat en verdun deze in één milliliter assaybuffer door te keren. Voeg ter menging 100 µL van het verdunde mengsel toe aan drie milliliter bios safe two scintillatieteller-cocktail in een scintillatiebuisje en keer dit om om te mengen. Meet de C 14-counts met een Beckman LS 6, 500-teller; de scintillatiecounts moeten boven de 18 000 counts per minuut liggen voordat men verdergaat met de assay.

Wanneer er voldoende met C 14 gelabeld natriumbicarbonaat aan de assaybuffer is toegevoegd, worden de reactiebuisjes verplaatst naar een droogbad dat is ingesteld op 25 °C en gedurende drie tot vijf minuten geïncubeerd. Voeg vervolgens 100 µL assaybuffer toe aan de lysaten en incubeer deze vijf minuten bij 25 °C. Voeg na vijf minuten ribulosebisfosfaat toe aan elk monster en laat de reactie vijf tot 10 minuten lang doorgaan bij 25 °C.

Om de reactie te stoppen, voegt u 100 µL 100% probiotisch zuur toe en centrifugeert u gedurende één uur bij 2000 ×g om niet-ingebouwd C 14 te verwijderen. Overbreng ten slotte het totale volume van de monsters naar scintillatiebuisjes die drie mL bios. Safe two scintillatietellingscocktail bevatten; bepaal vervolgens de counts per minute van het stabiele zuur.

Eindproducten via scintillatietelling. Verrijkingscultuur werd gebruikt om nieuwe koude-geadapteerde fototrofe en mixotrofe protisten te isoleren uit het Antarctische Lake Bonnie op drie verschillende dieptes. Verschillende typen groeimedia werden gebruikt om een grotere diversiteit aan organismen te selecteren: Bold's Basal Medium (BBM), marine medium en BG 11 medium.

De nutriëntenconcentratie en de fotosynthetisch actieve straling of PAR die in deze tabel worden weergegeven, vertegenwoordigen de omstandigheden op het moment van monstername. Visuele inspectie van de verrijkingsculturen via lichtmicroscopie wees uit dat de culturen gedomineerd werden door fototrofe protisten, zoals aangegeven door de aanwezigheid van chlorofylpigment in de meeste cellen. De culturen bevatten bovendien een verscheidenheid aan celmorfologieën, afhankelijk van de bemonsteringsdiepte waarvan het inoculum was genomen en het type medium dat in de cultuur werd gebruikt.

Maximale snelheden van carboxylase-activiteit gekatalyseerd door het enzym rubis werden gemeten in de verrijkte culturen als maatstaf voor koolstoffixatie. De abundantie van potentieel chlorofyl a werd eveneens gemonitord als schatting van de fototrofe protistenbiomassa, zoals hier wordt getoond.

Ondanks de kweek van alle culturen onder dezelfde temperatuur, varieerden het lichtregime, het koolstoffixatiepotentieel en de fototrofe biomassa drastisch tussen de verrijkingsculturen. De maximale rubis O-activiteit werd waargenomen in verrijkingsculturen vier en zes die groeiden in BBM-medium en verrijkingsculturen 13 en 14 die groeiden in BG 11-medium. In tegenstelling hiermee vertoonden culturen 1921 and 23, verrijkt op F twee-groeimedium, maximale carboxylase-activiteiten die vier tot 34 keer lager waren.

Deze verschillen waren niet te wijten aan lagere biomassaniveaus in de twee F-culturen, aangezien de carboxylase-activiteit werd uitgedrukt op basis van chlorofyl a. Bovendien bleek uit een Pearson-correlatieanalyse dat de rubisco-activiteit niet correleerde met de chlorofyl a-concentratie. De BBM-culturen werden geïnoculeerd met meerwater van zes meter en 15 meter.

Forum vijf van de verrijking vertoonde de hoogste chlorophyll A-gehaltes, terwijl alle andere culturen relatief lage gehaltes aan chlorophyll a vertoonden, ongeacht de rubis-enzymactiviteit. Eenmaal beheerst, vergt het uitvoeren van de technieken voor meerwatermonsters ongeveer twee uur. Afhankelijk van het aantal genomen monsters duurt de carboxylase-assay eveneens twee uur wanneer deze correct wordt uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals de assay voor heterotrofe enzymactiviteit, worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals op welke diepte heterotrofen voorkomen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u meerwatermonsters verzamelt, deze verrijkt voor produceren en de rubis-carboxylaseactiviteit bepaalt.