Gebruik van een robot voor High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen
1 september 2012
Hierin beschreven een robot benadering high-throughput kristallisatie van membraaneiwitten in lipidische mesofasen voor gebruik in structuurbepaling met macromoleculaire X-ray kristallografie. Drie robots staat de behandeling van de viskeuze en kleverige eiwit beladen mesofase een integraal onderdeel van de methode worden geïntroduceerd.
Hallo en welkom bij de Membrane Structural and Functional Biology Group. Mijn naam is Martin Caffery. Dit is weer een in een reeks van JO van artikelen over het kristalliseren van membraaneiwitten voor structurele determinatie met behulp van de in meso of lipic kubieke fase methode.
In het eerste artikel, JoVE 1 7 1 2, hebben we laten zien hoe de eiwitbeladen kubieke fase wordt bereid en hoe de stroperige en kleverige misa fase handmatig wordt uitgedeeld in glazen sandwich platen voor kristallisatieproeven. Dit videoartikel beschrijft methoden voor het gebruik van een in meso kristallisatie robot. Een robot biedt de voordelen van snelheid, nauwkeurigheid, precisie, miniaturisatie en het kunnen werken gedurende langere periodes onder ongemakkelijke omstandigheden, zoals in het donker of bij lage temperaturen.
Robots kunnen, wanneer correct gebruikt, de productiviteit van membraaneiwitstructuur- en functieonderzoek aanzienlijk verbeteren. In dit videoartikel demonstreren we het gebruik van drie commercieel verkrijgbare robots. De eerste robot is ontwikkeld in de membraan structurele en functionele biologiegroep en wordt in detail beschreven in referentie één.
De andere twee zijn pas recent beschikbaar geworden en worden hier voor de volledigheid opgenomen. Het voorbereiden van de kristallisatieplaat voor het robotmatig uitvoeren van een kristallisatieproef begint met het voorbereiden van de basisplaat van de glazen sandwich kristallisatieplaat, die in detail wordt beschreven in de referentie. De basisplaat moet eerst worden gesiliceerd en de geperforeerde dubbelzijdige ruimtegever die de putjes creëert, moet op de plaat worden aangebracht. De hiervoor benodigde materialen worden hier getoond.
Ze omvatten een glazen kristallisatiebasisplaat, een geperforeerde dubbelzijdige ruimtegever, een oplossing voor het gesiliceren, een roller of brayer, papieren tissues en een beker met UE-water. De plaat wordt op een papieren handdoek op een werkblad geplaatst. Er worden een paar druppels stille oplossing aangebracht en vervolgens gelijkmatig over het oppervlak van de plaat verdeeld met een papieren tissue.
De plaat wordt van overtollige gesilicerende oplossing bevrijd door deze volledig in een beker met water te dompelen. De plaat wordt uit de beker genomen en op een droge papieren handdoek geplaatst. Met de gesiliceerde kant naar boven en het blootgestelde oppervlak wordt lichtjes gedroogd met papieren handdoeken.
Vervolgens wordt de beschermende kap op de geperforeerde dubbelzijdige ruimtegever verwijderd en wordt de ruimtegever op het gesiliceerde oppervlak van de glazen plaat aangebracht. Het is belangrijk dat de ruimtegever correct op de basisplaat wordt gepositioneerd, met de bovenste linkerhoek en de twee aangrenzende zijden van de ruimtegever en de plaat samenvallen. Een roller of brayer wordt gebruikt om de ruimtegever op de basisplaat plat te maken en om een strakke afdichting tussen hen te creëren.
We merken overigens op dat gesiliceerde platen, compleet met geperforeerde ruimtegevers, commercieel verkrijgbaar zijn, zoals beschreven in de referentiesectie. Nadat de kristallisatiebasisplaat is voorbereid, gaan we verder met het instellen en gebruiken van de in meso robot. Zoals vermeld in het volgende, demonstreren we het gebruik van drie in meso robots.
In alle getoonde gevallen worden de robots ingesteld en gebruikt in een temperatuurgecontroleerde ruimte ingesteld op 20 graden Celsius. In meso robot één, de eerste in meso robot die in deze video wordt gedemonstreerd, is ontwikkeld in het laboratorium van de PI en is nu commercieel verkrijgbaar. Volledige details zijn te vinden in de referentiesectie.
De materialen en de apparatuur die nodig zijn om een kristallisatieproef robotmatig in te stellen, worden hier getoond. Ze omvatten een laboratorium notitieboekje, eiwitbeladen mease, vers bereid zoals beschreven in Jo van Artikel 1 7 1 2 en ondergebracht in een Hamilton-spuit. Gesiliceerde basisplaten met ruimtegevers en bijpassend dekglas, waterfles en tissues, en de in miso robot.
De eerste weergave is van de robot met een leeg deck. De volgende weergave is van de robot compleet met bevochtigingsstation, kristallisatiebasisplaat en diep welblok met precipitaatoplossingen. We beginnen de instelling door de basisplaat op het deck van de robot te plaatsen.
Het heeft zijn eigen platform, duidelijk gemarkeerd met putposities voor doeleinden van basisplaatuitlijning. De plaat moet duidelijk worden gelabeld voor identificatiedoeleinden. Het 96-welblok met precipitaatoplossingen wordt beveiligd in zijn eigen platform op het deck van de robot naast de kristallisatieplaat.
Het blok wordt geopend door voorzichtig de plastic plafondkap eraf te trekken. De bevochtigingsstroom van de bevochtiger wordt geleid om over en over de basisplaat op het deck van de robot te stromen. De robot instellen. De robot wordt geïnitialiseerd door de instructies van de fabrikant te volgen.
We zullen dit hier niet in detail demonstreren omdat de exacte protocollen in de loop van de tijd zullen veranderen. Essentieel wat er gebeurt tijdens initialisatie is dat de mease dispenserende arm op de robot wordt voorzien van referentieposities in drie orthogonale richtingen, x, Y en Z. Vervolgens wordt de eiwitbeladen meza fase in een Hamilton-spuit compleet met dispenserende naald aan arm één van de robot bevestigd. Volledige details van hoe de meza fase en de spuit te bereiden, worden beschreven in Jo of Article 1 7 1 2 en in referentie één. De naaldpunt van de dispenserende spuit moet nu worden uitgelijnd met de bodem en het midden van de bovenste put in de linkerhoek van de kristallisatieplaat. Dit komt overeen met put-identifier A één die uitlijnt met de bodem van put A één als de eerste taak.
Dit wordt gedaan door I het aanpassen van de hoogte of Z-coördinaat na dispenserende arm terwijl wordt gekeken hoe dicht de naaldpunt bij de bodem van de put komt. Dat de punt net de bodem van de put raakt, kan worden beoordeeld door de plaat met de hand van kant naar kant op het platform te bewegen terwijl de hoogte van de dispenserende arm wordt aangepast, wordt de Z-coördinaat van de dispenserende arm waar de punt de plaat raakt in de computer geprogrammeerd om plaats te vinden met de naaldpunt op enkele micrometers van deze referentie Z-positie, die overeenkomt met het oppervlak van de basisplaat. De robot wordt vervolgens geactiveerd om een re
Overzicht
Dit artikel beschrijft een robotische benadering voor high-throughput kristallisatie van membraaneiwitten in lipidische mesofasen, die structuurbepaling via macromoleculaire röntgenkristallografie vergemakkelijkt. Drie robots die zijn ontworpen om de viskeuze eiwitbevattende mesofase te verwerken, worden geïntroduceerd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Structurele biologie
- Biofysica
- Robotica in onderzoek
Achtergrond
- Kristallisatie van membraaneiwitten is cruciaal voor structurele studies.
- De in meso of lipidische kubieke fase methode is een veelgebruikte benadering.
- Handmatig doseren van viskeuze mesofasen kan uitdagend zijn.
- Robotische systemen kunnen de snelheid en nauwkeurigheid in kristallisatieproeven verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om het gebruik van robots voor high-throughput kristallisatie te demonstreren.
- Om de efficiëntie van structuurbepaling van membraaneiwitten te verbeteren.
- Om drie verschillende robotische systemen voor dit doel te presenteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van kristallisatieplaten met een silanized oppervlak.
- Installatie van in meso robots in een temperatuurgecontroleerde omgeving.
- Dosering van eiwitbevattende mesofase met behulp van robotarm.
- Uitlijning en initialisatie van robotische doseersystemen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle demonstratie van robotische kristallisatietechnieken.
- Verbeterde reproduceerbaarheid en snelheid in kristallisatieproeven.
- Effectieve behandeling van viskeuze mesofasen door robots.
- Verbeterde productiviteit in onderzoek naar membraaneiwitten.
Conclusies
- Robotische systemen verbeteren de kristallisatieworkflows aanzienlijk.
- Automatisering kan leiden tot betere resultaten in structurele biologie.
- Toekomstige studies kunnen deze robotische technieken verder verfijnen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Robotic automation of lipidic mesophase crystallization addresses a critical bottleneck in membrane protein structure determination by enabling high-throughput, reproducible dispensing of viscous samples. This capability accelerates target validation and lead identification campaigns by improving crystallization success rates and reducing hands-on time. The approach supports predictive confidence in structural biology workflows by standardizing a traditionally low-yield, operator-dependent step.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables systematic screening of membrane protein constructs under standardized conditions to clarify structure-function relationships.
- Operational Value: Reduces variability in crystallization trials through precise, robot-controlled nanoliter dispensing of protein-laden mesophase.
- Predictive Value: Increases likelihood of obtaining diffraction-quality crystals, thereby de-risking downstream structural analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, reproducible crystallization outputs suitable for assay optimization and hit validation.
- Operational Value: Facilitates miniaturized, parallel screening of precipitant conditions across 96-well formats with minimal sample consumption.
- Assay Readiness: Produces sealed, uniform crystallization plates compatible with automated imaging and crystal growth monitoring systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports structure-guided drug design by providing reliable access to high-resolution membrane protein targets.
- Preclinical Alignment: Enables consistent production of structural data for target engagement and mechanism-of-action studies.
- Mechanistic De-risking: Reduces attrition risk in lead optimization by improving confidence in target structural models.
Pipeline & Workflow Integration
Robotic in meso crystallization fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where structural data informs medicinal chemistry decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling rapid structural characterization of membrane protein targets and variants.
- Screening: Delivers assay-ready crystallization plates with standardized mesophase and precipitant distribution for reliable hit confirmation.
- Analytics: Provides structural readouts (crystal quality, diffraction resolution) that guide protein engineering and construct selection.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation through reproducible structure determination pipelines.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, shared capability for membrane protein projects across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through increased access to high-resolution structural data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput of crystallization trials via automated, precise liquid handling.
- Strategic Value: Accelerates lead identification by reducing time-to-structure for challenging membrane protein targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted project prioritization by enabling earlier structural insights into target druggability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in membrane protein biochemistry and crystallization screening design.
- Depends on access to robotic platforms capable of handling high-viscosity lipidic mesophases.
- Necessitates standardized plate preparation and sealing protocols to ensure crystallization success.
- Involves environmental controls (temperature, humidity) to maintain mesophase stability during dispensing.
- Demands training for robotic system setup, alignment, and maintenance to ensure dispensing accuracy.
