Gebruik van een robot voor High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Hallo en welkom bij de Membrane Structural and Functional Biology Group. Mijn naam is Martin Caffery. Dit is een volgende video in een serie JoVE-artikelen over het kristalliseren van membraaneiwitten voor structurele bepaling met behulp van de in meso- of lipidekubischefasemethode.

In het eerste artikel, JoVE 1 7 1 2, hebben we aangetoond hoe de eiwitgeladen kubische fase wordt voorbereid en hoe de viskeuze en kleverige misa-fase handmatig in glazen sandwichplaten wordt gedoseerd voor crystallisatieproeven. Dit video-artikel beschrijft methoden voor het gebruik van een in meso crystallisatie-robot. Een robot biedt de voordelen van snelheid, nauwkeurigheid, precisie-miniaturisering en het vermogen om gedurende langere perioden onder oncomfortabele omstandigheden te werken, zoals in het donker of bij lage temperaturen.

Robots kunnen, mits correct gebruikt, de productiviteit van onderzoek naar de structuur en functie van membraaneiwitten aanzienlijk verhogen. In dit video-artikel demonstreren we het gebruik van drie commercieel beschikbare robots. De eerste robot is ontwikkeld binnen de onderzoeksgroep voor membraan structurele en functionele biologie en wordt in detail beschreven in referentie één.

De andere twee zijn onlangs beschikbaar gekomen en zijn hier voor de volledigheid opgenomen. Het voorbereiden van de kristallisatieplaat voor het robotisch uitvoeren van een kristallisatieproef begint met het voorbereiden van de basisplaat van de glazen sandwich-kristallisatieplaat, die in detail wordt beschreven in de referentie naar de basisplaat; deze moet eerst gesiliciseerd worden, waarna de geperforeerde dubbelzijdige plakspacer die de wells vormt, op de plaat moet worden aangebracht. De benodigde materialen hiervoor worden hier getoond.

Deze omvatten een glazen crystallisatiebasisplaat, een geperforeerde dubbele afstandhouder, een rol of brayer, papieren tissues en een beker met UE-water. De plaat wordt op een papieren handdoek op een werkblad geplaatst. Er worden enkele druppels silent-oplossing aangebracht, die vervolgens met een papieren tissue gelijkmatig over het plaatoppervlak worden verdeeld.

De plaat wordt gereinigd van overtollige silaniseeroplossing door deze volledig onder te dompelen in een bekerglas met water. De plaat wordt uit het bekerglas gehaald en op een droge papieren handdoek geplaatst. De gesilaniseerde zijde bevindt zich bovenop en het blootgestelde oppervlak wordt gedroogd door er lichtjes met papieren handdoeken overheen te vegen.

Vervolgens wordt de beschermkap van de geperforeerde dubbele plakspacer verwijderd en wordt de spacer op het gesilaniseerde oppervlak van de glasplaat aangebracht. Het is belangrijk dat de spacer correct op de basisplaat wordt geplaatst, waarbij de linkerbovenhoek en de twee aangrenzende zijden van de spacer en de plaat samenvallen. Een roller of brayer wordt gebruikt om de spacer op de basisplaat plat te drukken en een luchtdichte afsluiting tussen beide te creëren.

Tussen haakjes merken we op dat gesiloïseerde platen, compleet met geperforeerde spacers, commercieel verkrijgbaar zijn zoals beschreven in de sectie met referenties. Nadat de basisplaat voor kristallisatie is voorbereid, gaan we over tot het instellen en gebruiken van de in meso robot. Zoals hierna wordt vermeld, demonstreren we het gebruik van drie in meso robots.

In alle getoonde gevallen zijn de robots geïnstalleerd en gebruikt in een temperatuurgecontroleerde ruimte ingesteld op 20 °C. De meso robot one, de eerste meso robot die in deze video wordt gedemonstreerd, is ontwikkeld in het laboratorium van de PI en is nu commercieel verkrijgbaar. Volledige details zijn terug te vinden in de sectie referenties.

De materialen en apparatuur die nodig zijn om een crystallisatiewetenschappelijke proef robotisch op te zetten, worden hier getoond. Deze omvatten een laboratoriumnotitieboek, proteïnehoudige monsters, vers bereid zoals beschreven in Jo of Artikel 1 7 1 2 en ondergebracht in een Hamilton-spuit, gesiliconiseerde basisplaten met spaties en bijbehorend dekglas, een waterfles en tissues, en de in miso robot.

Het eerste beeld toont de robot met een leeg dek. Het volgende beeld toont de robot compleet met het parkeerstation voor de bevochtiger, de kristallisatiebasisplaat en het deep-well blok met precipitante oplossingen. We beginnen de installatie door de basisplaat op het dek van de robot te plaatsen.

Het heeft een eigen platform, duidelijk gemarkeerd met putposities voor de uitlijning van de basisplaat. De plaat moet duidelijk worden gelabeld voor identificatiedoeleinden. Het 96-putsblok met precipitantoplossingen is bevestigd in een eigen platform op het dek van de robot, naast de kristallisatieplaat.

Het blok wordt geopend door de plastic afdekking voorzichtig af te pellen. De luchtvochtigheidsstroom van de bevochtiger wordt zo gericht dat deze over en langs de basisplaat op het dek van de robot stroomt. De robot wordt geïnitialiseerd volgens de instructies van de fabrikant.

We zullen dit hier niet in detail demonstreren omdat de exacte protocollen na verloop van tijd zullen veranderen. In essentie houdt de initialisatie in dat de doseerarm van de robot wordt voorzien van referentieposities in drie orthogonale richtingen: x, Y en Z. Vervolgens wordt de proteïne-geladen meza-fase in een Hamilton-spuit, compleet met doseernaald, bevestigd aan arm één van de robot; volledige details over het voorbereiden van de meza-fase en de spuit worden beschreven in JoVE-artikel 1 7 1 2 en in referentie één. De naaldpunt van de doseerspuit moet nu worden uitgelijnd met de bodem en het centrum van de bovenste well in de linkerhoek van de kristallisatieplaat. Dit komt overeen met well-identificatie A1, waarbij de eerste stap het uitlijnen met de bodem van well A1 is.

Dit wordt gedaan door de hoogte of de Z-coördinaat van de doseerarm aan te passen, terwijl wordt geobserveerd hoe dicht de naaldpunt bij de bodem van de well komt. Of de punt de bodem van de well net raakt, kan worden beoordeeld door de plaat met de hand van links naar rechts op het platform te bewegen terwijl de hoogte van de doseerarm zeer voorzichtig wordt bijgesteld; de Z-coördinaat van de doseerarm waarbij de punt de plaat raakt, wordt in de computer ingevoerd. De dosering wordt geprogrammeerd om plaats te vinden met de naaldpunt enkele micrometers boven deze referentie-Z-positie, wat overeenkomt met het oppervlak van de bodemplaat. Vervolgens wordt de robot geactiveerd om een reeks door de gebruiker aangestuurde stappen te doorlopen om de punt van de naald in het centrum van well A1 te positioneren.

De referentie-XY-coördinaat van de doseerarm waar de tip gecentreerd is, wordt opgeslagen in de computer die de robot aanstuurt. Deze wordt gebruikt om het centrum van de overige putjes op de plaat te bepalen. Nadat deze referentiecoördinaten in de computer zijn ingesteld, krijgt de doseerarm de instructie om terug te keren naar de startpositie om de spuit te ontluchten.

De doseerspuit moet nu worden voorbereid. Dit wordt gedaan om ervoor te zorgen dat verse mease de doseernaald vult en dat de eerste well op de plaat de volledige hoeveelheid mease ontvangt. In het programma dat de robot aanstuurt, bevindt zich een commando voor de voorbereiding.

Dit zorgt ervoor dat de zuiger in de spuit stapsgewijs onder controle van de gebruiker naar voren beweegt. Terwijl dit gebeurt, wordt de punt van de naald gecontroleerd op de aanwezigheid van uitgestoten vloeistof; eventuele vloeistof wordt met een tissue verwijderd. Hiermee is het priming-proces voor het starten van de robot voltooid.

De robot is nu klaar om in automatische modus de run te starten. Het Robot XAP-programma start een reeks spoelstappen waarbij de tips voor het dispenseren van het precipitant op arm twee van de robot worden gewassen en worden voorbereid om precipitant-oplossingen uit het deep-well blok te aspireren. Het activeren van de dispense-functie op de robot zet de sequentiële vulling van de wells in gang, waarbij eerst acht wells tegelijk met eiwitgeladen mease worden gevuld, gevolgd door precipitant-oplossingen tussen de leveringen door. De mease-doseerarm keert terug naar een parkeerpositie waar de naaldpunt in een bevochtigte spons wordt geplaatst om te voorkomen dat de mease aan de tip uitdroogt.

Meest gebruikelijk zijn de waarden die worden gehanteerd bij kristallisatie-experimenten uitgevoerd in de groep Structurele en Functionele Biologie, namelijk 50 nanoliters eiwit en 800 nanoliters precipitante-oplossing. Het programma dat de robot in deze demonstratie aanstuurt, is zo ingesteld dat de twee armen gelijktijdig bewegen.

Op deze manier is het mogelijk om het vullen van een 96-wells plaat met mease en precipitant binnen vijf minuten te voltooien. Zodra de plaat is gevuld en de robotarmen zijn teruggekeerd naar hun parkeerposities, wordt de plaat van het robotdek verwijderd en op een vlakke, stevige ondergrond geplaatst.

Een dekglas wordt voorzichtig op de basisplaat gelegd, in contact met het bovenste kleverige oppervlak van de spacer. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat alle 96 wells volledig bedekt zijn, dat het dekglas recht is uitgelijnd met de basisplaat en dat geen enkel deel van het dekglas buiten de contouren van de basisplaat uitsteekt. Een roller of brayer wordt gebruikt om een strakke en uniforme afsluiting tussen het dekglas en de spacer te creëren.

De plaat moet in dit stadium worden geïnspecteerd om er zeker van te zijn dat de opzet correct is verlopen. Men zoekt naar een uiterlijk dat lijkt op een gebakken ei in een pan. In elke put komt de eidooier overeen met de meza-fase.

Het eiwit is de precipitant-oplossing en de rand van de pan is de omtrek van de kristallisatie. Idealiter zijn deze drie concentrisch. De plaat is nu klaar om in een temperatuurgecontroleerde bewaarruimte te worden geplaatst voor kristalgroei.

Als er geen platen meer worden klaargezet, moet het precipitantblok van het robotdeck worden verwijderd, zorgvuldig worden afgesloten en terug in de opslag worden geplaatst. De spuit die de mease bevat, wordt uit de doseerarm van de robot verwijderd en in zijn verschillende onderdelen gedemonteerd, inclusief de doseernaald en de ferrule. Deze worden zorgvuldig gewassen met methanol en gedroogd ter voorbereiding op het volgende gebruik in de Meso robot twee mosquito LCP.

Dit volgende videoclip toont de mosquito LCP-robot die kan worden gebruikt bij het opzetten van in meso crystallisatie-experimenten. Deze maakt gebruik van een meph-fase dispensersysteem dat vergelijkbaar is met het systeem dat eerder in dit artikel is beschreven. Voor robot één wordt het precipitant echter gedispenseerd met behulp van wegwerptips.

Het instrument zelf wordt hier getoond. Het bevat een platform waarop de crystallisatieplaat en het precipitantblok zijn geplaatst, een kamer met vensters voor de beheersing van de luchtvochtigheid. In dit aanzicht zijn de vensters van de vochtigheidskamer geopend; er is een spoel met doseertips, een doseerarm voor de meph-fase en een lasersensor om de positie van de doseernaald voor de meph-fase vast te stellen.

Een verhoogd platform waarop de kristallisatieplaat rust en een verzonken platform voor het vasthouden van het blok met de precipitant-screening. In deze sequentie heeft de robot een initialiseringsreeks van acties doorlopen nadat het instrument is ingeschakeld. Programmasoftware wordt gebruikt om het instrument in te stellen voor het werken met specifieke kristallisatieplaten en precipitant-blokken, en om ingestelde volumes van de oplossing en precipitant in een gespecificeerde volgorde te dispenseren.

Dergelijke details worden verstrekt door de fabrikant en worden hier niet getoond. Het gebruik van de robot voor het opstellen van een crystallisatieplaat begint als volgt: een Hamilton-spuit, compleet met naald en gevuld met proteïne-houdend medium, wordt voorbereid zoals hierboven beschreven onder in meso robot one en in JoVE 1 7 1 2. De spuit wordt in positie geklemd onder de doseerarm van de robot.

De x- en y-coördinaten van de naald van de doseerspuit worden vastgesteld met behulp van de op het deck gemonteerde lasersensor. Dit is een cruciale stap die nodig is om te garanderen dat de mease nauwkeurig in het centrum van elke put op de crystallisatieplaat wordt gedoseerd. Met een druk op de knop op het bedieningspaneel wordt de spuit klaargezet om mease uit de naaldpunt te brengen.

Uitgestoten vet wordt vervolgens met een papieren tissues verwijderd ter voorbereiding op het gebruik van de robot om de wells te vullen, voordat de kristallisatieplaat op het deck van de robot wordt geplaatst. Het oppervlak van het platform wordt bevochtigd met een paar druppels water om de plaat op zijn plaats te houden. Met behulp van een capillair wordt de beschermkap van de plaat verwijderd en wordt de plaat stevig op het platform geplaatst om een goede hechting te garanderen.

Er bevinden zich drie referentiepunten op het platform waarboven de drie hoekputjes zijn gecentreerd om een juiste positionering van de plaat ten opzichte van de tip van de doseernaald te garanderen; het instrument is nu klaar om een setup-cyclus te starten. Dit begint met een tweede priming-stap waarbij Mease op een klein glazen plaatje wordt gedoseerd, vlak voordat de plaat met verse mease wordt geladen. In deze reeks zien we hoe de robot eerst mease laadt in een verticale kolom van acht putjes op de plaat, en vervolgens de wegwerptips gebruikt om precipitant-oplossing bovenop de mease-bolus te doseren.

Dit proces wordt 11 keer herhaald over de lengte van de plaat tot alle wells zijn gevuld. Het gehele proces duurt ongeveer vijf minuten. In deze specifieke video werden 50 nanoliters Mease en 800 nanoliters precipitantoplossing in elke well gedoseerd.

De gevulde plaat wordt verwijderd van het platform van de robot die op een bench is geplaatst. Het dekglas wordt aangebracht en de plaat wordt verzegeld met een bra, zoals hierboven beschreven onder in miso robot one. De correct gelabelde plaat kan nu in een temperatuurgecontroleerde omgeving worden geplaatst voor kristalgroei in Meso robot three, de Griffin LCP.

Dit laatste videoclip laat de Griffin LCP-robot zien tijdens het opzetten van in meso kristallisatieproeven. De Griffin bevat een meph-fase doseersysteem dat vergelijkbaar is met het systeem dat hierboven voor robot één is beschreven. In dit geval worden echter alle 96 precipitantoplossingen gelijktijdig gedoseerd.

Het instrument zelf wordt hier getoond. Het omvat een platform waarop de kristallisatieplaat en het precipitantenblok rusten, een arm voor het dispenseren van reagentia en een Phoenix 96 tiphead. In deze laatste videosequentie wordt de robot in actie getoond bij het dispenseren van precipitantenoplossingen.

De 96-punt kop wordt eerst gevuld met de precipitantoplossing. Er is een door de gebruiker instelbare vertraging voorzien om het aspireren van viskeuze precipitanten te vergemakkelijken. De MEA-fase wordt sequentieel gedispenseerd in de 96 wells via een proces dat ongeveer één minuut duurt.

Ten slotte dispenseert de 96-tip kop alle 96 precipitant-oplossingen gelijktijdig bovenop de MEA-fasestoppen in de crystallisatieputjes. Het gehele proces van het vullen van de plaat is binnen twee minuten voltooid. De gevulde plaat wordt van het robotdek verwijderd, afgesloten met een dekglas en opgeslagen onder gecontroleerde temperatuuromstandigheden voor kristalgroei.

De volgende stappen in het algemene proces van structurele bepaling via macromoleculaire kristallografie zijn het oogsten en cryogeen koelen van de kristallen, en het registreren en verwerken van de röntgendiffractie daarvan. Deze onderwerpen worden behandeld in afzonderlijke artikelen in deze serie.I.