Name: High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch In situ Hybridisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Leer een high-throughput protocol voor fysieke chromosoommapping bij muggen met geautomatiseerde fluorescentie-in-situ-hybridisatie. Deze methode verbetert efficiëntie en consistentie in genoomonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de beurs van de National Institutes of Health 1R21AI094289 aan Igor V. Sharakhov. Het Xmatrx Automated Slide Staining System en het ACCORD PLUS Automated Scanning System zijn aangeschaft met behulp van het Equipment Trust Fund-programma, het Fralin Life Science Institute, de Department of Entomology en de Department of Biochemistry van Virginia Tech.

1. Hogedruk-preparatie van polytene chromosomen uit ovariële voederscellen
<ol>
	<li>Disseceer half-gravide Anopheles-vrouwtjes 25 uur na bloedvoeding onder een dissectiemicroscoop en fixeer de ovaria in verse gemodificeerde Carnoy-oplossing met methanol (100% methanol: glaciaal azijnzuur, 3:1). In dit stadium bevinden de ovaria zich in Christophers' stadium III van ontwikkeling, waarbij de follikels een ovale vorm hebben en het transparante gebied met voederscellen binnen de follikels een ronde vorm heeft13. Plaats de ovaria van ongeveer vijf vrouwtjes in 500 μl gemodificeerde Carnoy-oplossing in een 1,5 ml Eppendorf-buisje en bewaar deze 24 uur bij kamertemperatuur. Verplaats de ovaria naar -20 °C voor langdurige bewaring.</li>
	<li>Bereid vlak voor het maken van de preparaten een gemodificeerde Carnoy-oplossing voor met ethanol (100% ethanol: glaciaal azijnzuur, 3:1) en 50% propionzuur. Plaats één paar ovaria in één druppel gemodificeerde Carnoy-oplossing op een stofvrij objectglas. Verdeel de ovaria in ongeveer 6 secties met dissectienaalden en plaats deze in druppels 50% propionzuur op schone objectglazen onder een Leica MZ6 dissectiestereomicroscoop. Gebruik voor elke sectie een apart objectglas.</li>
	<li>Scheid de follikels door te disseceren met naalden en veeg het resterende weefsel weg met filterpapier of keukenpapier onder een dissectiemicroscoop. Voeg een nieuwe druppel 50% propionzuur toe aan de follikels en laat deze 3-5 minuten bij kamertemperatuur rusten. Plaats een dekglas bovenop de druppel 50% propionzuur. Laat het objectglas ongeveer 1 minuut staan.</li>
	<li>Wikkel het objectglas in filterpapier en plastic. Gebruik een Dremel 200 roterend gereedschap met een Flex-Shaft-opzetstuk en een zachte plastic tip, ingesteld tussen 3000-5000 RPM, om de follikels uit te drukken door de tip in cirkels te draaien en licht op het dekglas te drukken om de kernen gelijkmatig te verspreiden. Deze stap duurt ongeveer 1 minuut. Controleer de spreidingskwaliteit met een Olympus CX41 fasemicroscoop met een 20x objectief.</li>
	<li>Maak een 'sandwich' door een extra dekglas naast het dekglas dat de chromosomen bedekt te plaatsen, en dek deze af met een tweede objectglas. Dit vermindert de kans dat het objectglas in de bankschroef wordt verbrijzeld. Wikkel de glazen in een plastic vel (zoals meegeleverd bij objectglashouders) en filterpapier om de sandwich op zijn plaats te houden en het objectglas te beschermen tegen krassen door de bankschroef.</li>
	<li>Oefen druk uit op de objectglazen via een mechanische bankschroef. Een druk van 85-120 inch-lbs is voldoende en wordt bereikt met een momentsleutel. Deze stap is noodzakelijk om de chromosomen zoveel mogelijk af te platten.</li>
	<li>Verwijder het tweede objectglas en het extra dekglas. Verwarm het objectglas met het dekglas dat de chromosomen bedekt tot 55 °C op een denaturatie-/hybridisatiesysteem voor objectglazen gedurende 10-15 minuten om de chromosomen verder af te platten. Dompel het objectglas gedurende ten minste 15 seconden in vloeibare stikstof en verwijder, zodra het bubbelen is gestopt, snel het dekglas met een scheermesje. Plaats de objectglazen onmiddellijk gedurende 5 minuten in koude 50% ethanol. Dehydrateer de objectglazen in 70%, 90% en 100% ethanol gedurende elk 5 minuten. Laat de objectglazen aan de lucht drogen.</li>
</ol>
2. FISH met behulp van een geautomatiseerd systeem voor het kleuren van coupes
Het programma is ingesteld met het Xmatrx geautomatiseerde coupes kleuringssysteem om de volgende stappen uit te voeren, met uitzondering van de sonde-markering. Het gedetailleerde nick-translatie markeringsprotocol is beschreven in de documentatie die wordt geleverd bij de DNA-polymerase van Fermentas.
<ol>
	<li>Bereid vóór de FISH fluorescentie-sondes voor door genomisch BAC-DNA te labelen met een fluorochroom met behulp van een nick-translation-protocol. Meng 1 μg DNA, elk 0,05 mM niet-gelabelde dATP, dCTP en dGTP en 0,015 mM dTTP, 1 μl Cy3- of Cy5-dUTP, 0,05 mg/ml BSA, 5 μl van 10x nick-translation-buffer, 20 units DNA-polymerase I, 0,0012 units DNase I, en nuclease-vrij water tot 25 μl. De ratio DNA-polymerase I/DNase I wordt empirisch gekozen om sondes te verkrijgen met een groottebereik van 300 tot 500 bp. Incubeer het mengsel 1 uur bij 15 °C.</li>
	<li>Plaats de objectglazen en reagentia in het Xmatrx geautomatiseerde slide-kleuringssysteem en start het programma om de volgende stappen uit te voeren. Breng 800 μl 1x PBS aan gedurende 20 min. Blaas de objectglazen droog met lucht. Voer formalinefixatie uit door 450 μl 4% formaline in 1x PBS gedurende 1 min aan te brengen, gevolgd door wasstappen met 100% ethanol tweemaal gedurende 1 sec en eenmaal gedurende 2 min. Blaas de objectglazen droog met lucht.</li>
	<li>Verwarm de objectglazen 2 min bij 45 °C om belletjesvorming bij het aanbrengen van de sondes te voorkomen. Breng 20 μl van de DNA-sondes aan, voeg druppels minerale olie toe om verdamping van de hybridisatieloplossing te voorkomen en plaats een dekglas bovenop. Denatureer de chromosomen en DNA-sondes door de objectglazen 10 min bij 90 °C te verwarmen.</li>
	<li>Incubeer de objectglazen voor hybridisatie 14 uur bij 42 °C met de dekglazen erop. De hybridisatieloplossing bestaat uit 2x SSC, 100 mM natriumfosfaat, 1x Denhardt-oplossing, 100 μg/ml natriumazide en 10% dextraansulfaat in formamide.</li>
	<li>Verwarm de objectglazen voor de stringentiewasstappen 2 min bij 42 °C, verwijder de dekglazen en was de objectglazen 4 keer gedurende 1 sec in 2x SSC. Blaas de objectglazen droog met lucht. Breng tweemaal 800 μl 0,4x SSC aan bij 42 °C gedurende 10 min. Was de objectglazen in 2x SSC bij 25 °C gedurende 10 min.</li>
	<li>Voer chromosomenkleuring uit door 50 μl 1 μM YOYO-1 in 1x PBS aan te brengen. Breng druppels minerale olie aan om verdamping van de kleuringsoplossing te voorkomen, plaats de dekglazen en incubeer 10 min bij 25 °C. Verwijder de dekglazen en was de objectglazen 4 keer gedurende 1 sec in 2x SSC. Blaas de objectglazen droog met lucht. Breng 15 μl ProLong Gold antifade-reagens aan. Plaats de dekglazen.</li>
</ol>
3. Aflezen van slides met een automatisch fluorescent beeldsysteem
Deze sectie beschrijft in detail het gebruik van de Duet-software, die standaard wordt geleverd bij het ACCORD PLUS geautomatiseerde scansysteem. De instructies beginnen na het inschakelen in deze volgorde: de Olympus U-RFL-T voeding voor een halogeenlamp, de computer Dell precision T3500, de microscoop Olympus BX61 met een aangesloten camera Olympus U-CMAD3.
<ol>
	<li>Voor het instellen van de 10x Pre-Scan opent u de Duet-software in het ACCORD PLUS automatische scansysteem. Klik op de knop "Online". Voer een nieuw Case ID in en wijs een Slide ID toe. Klik op de stip met het label "BF". Dit is de optie voor brightfield. Stel de scanoptie in op "10x Prescan". Gebruik "2500x circle", "10000x circle" of "rectangle". Klik op "Set&amp;run" voor de 10x Pre-Scan.</li>
	<li>Klik op de knop "OK" om de 10x Pre-Scan uit te voeren. Volg de aanwijzingen om het scannen correct af te stellen. Klik op "Finish" om de scan te starten. Druk op het tabblad "Main" om terug te keren naar het hoofdscherm. Klik op de knop "Offline". Zoek het toegewezen Case ID en Slide ID en klik op "Offline Scan". Klik in het zwarte vak linksboven op een pijl en selecteer "10x Prescan". Ga met de pijlen (&lt; || Δ &gt;, ook wel de knoppen "terug", "pauze", "afspelen", "vooruit") door de gescande beelden.</li>
	<li>Nadat u een interessant beeld heeft gevonden, dubbelklikt u op het scherm in het midden van het doelgebied en drukt u op "Snap". Hiermee wordt een beeld gemarkeerd voor latere vastlegging. Nadat alle doelen zijn geselecteerd, klikt u op "Classify". Selecteer "10x Prescan". Klik met de rechtermuisknop op een beeld om de beelden te classificeren. Selecteer "Polytene".</li>
	<li>Stel de 40x Pre-Scan in in de Duet-software. Klik op "Main" om terug te keren naar het hoofdmenu. Selecteer opnieuw "Online". Selecteer een slide. Wijzig "BF" in "FL". Wijzig de taaknaam in "Revisit-X40-RG". Wijzig de sectie direct onder de laatste instelling in "Revisit-ALL". Klik op "Set&amp;Run". Druk op "OK". Volg opnieuw de aanwijzingen om de automatisering in te stellen. Klik op de knop "Start matching views" om de 10x en 40x beelden op elkaar af te stemmen. Klik op "Finish" om de scan te starten. Zodra dit is voltooid, klikt u op "Classify" en bekijkt u de beelden.</li>
</ol>
4. Representatieve resultaten
Figuur 1 geeft schemaatisch de preparatie van chromosomen onder hoge druk weer. Deze stap omvat het proces van het platdrukken van chromosomen met behulp van een Dremel-instrument en een mechanische bankschroef, evenals de visualisatie van chromosomen met een fasecontrastmicroscoop. Figuur 2 illustreert de hybridisatie van een fluorescent gelabelde probe aan doel-DNA op de chromosoompreparaten met behulp van een geautomatiseerd slide-kleuringssysteem, het gebruik van een geautomatiseerde scannende microscoop voor het visualiseren en mappen van de probes na het FISH-experiment, en het plaatsen en oriënteren van genomische scaffolds op de chromosomen.
Preparaten van polytene chromosomen uit eierstok-voedingscellen van vrouwtjes van An. gambiae werden gemaakt met behulp van de hogedruktechniek. Deze methode beschadigt of verandert de meeste chromosoomstructuren niet (Figuur 3). Het vlakt gebogen chromosomen af en onthult zo verborgen fijne banden die op reguliere preparaten niet zichtbaar zijn (Figuur 4).
De probes die in dit protocol worden gebruikt, zijn genomische BAC-DNA-klonen verkregen uit een ND-TAM BAC-bibliotheek, gegenereerd uit DNA van de An. gambiae PEST-stam. Het genomische DNA voor deze bibliotheek werd geëxtraheerd uit pas uitgekomen eerste-instar-larven van beide geslachten. Figuur 5 toont de resultaten van FISH met BAC-klonen die zijn gehybridiseerd met polytene chromosomen van An. gambiae. Deze procedure werd uitgevoerd met het Xmatrx geautomatiseerde slide-kleuringssysteem. Met behulp van een cytogenetische fotokaart voor An. gambiae10 werden twee BAC-klonen, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) en BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), respectievelijk gelokaliseerd in de onderverdelingen 16C en 16D van de 2R-arm. De BLAST-zoekopdracht tegen de AgamP3-assemblage van de An. gambiae PEST-stam 14 identificeerde echter de sequenties die homolog zijn aan 102B24 en 142O19 in respectievelijk de onderverdelingen 16B and 17A van de 2R-arm (Tabel 1). Daarom kan de correspondentie tussen de genomische coördinaten en de cytogenetische onderverdelingen nu worden aangepast op basis van onze mappinggegevens. De BLAST-zoekopdracht tegen de genoomassemblages van de An. gambiae M-vorm en S-vorm wees uit dat de twee BAC-klonen zich in verschillende contigs bevinden, maar in dezelfde scaffolds binnen elke vorm (Tabel 1). De geïdentificeerde contigs kunnen nu worden geassocieerd met specifieke chromosomale locaties. Bovendien kunnen de geïdentificeerde scaffolds nu correct worden georiënteerd binnen de cytologische onderverdelingen 16CD. Interessant is dat de afstanden tussen de 102B24- en 142O19-sequenties in de scaffolds respectievelijk 1,892,981 bp, 1,658,391 bp en 1,688,426 bp zijn in de genoomassemblages van de PEST-stam, M-vorm en S-vorm. Omdat de PEST-stam een hybride is tussen de M- en S-vormen, is dit verschil waarschijnlijk te wijten aan een incorrecte assemblage van het PEST-genoom.
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >BAC 
			(toegangsnummer)</td >
			<td >PEST-stam 
			AgamP3 
			 
			Coördinaten</td >
			<td >M-vorm 
			contigs 
			 
			Coördinaten</td >
			<td >M-vorm 
			scaffolds 
			 
			Coördinaten</td >
			<td >S-vorm 
			contigs 
			 
			Coördinaten</td >
			<td >S-vorm 
			scaffolds 
			 
			Coördinaten</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >102B24 
			(BH372694)</td >
			<td >2R:AAAB0100 
			8844_26 (16B) 
			 
			43,681,342- 
			43,681,874</td >
			<td >ABKP020247 
			53.1 
			 
			32,513- 
			33,045</td >
			<td >EQ090167.1 
			 
			1,858,377- 
			1,858,909</td >
			<td >ABKQ010123 
			32.1 
			 
			4,299- 
			4,832</td >
			<td >EQ099711.1 
			 
			215,891- 
			216,424</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >102B24 
			(BH372701)</td >
			<td >2R:AAAB0100 
			8844_28 (16B) 
			 
			43,788,213- 
			43,788,969</td >
			<td >ABKP020247 
			51.1 
			 
			24,816- 
			25,575</td >
			<td >EQ090167.1, 
			 
			1,772,683- 
			1,773,442</td >
			<td >ABKQ010123 
			35.1 
			 
			27,782- 
			28,540</td >
			<td >EQ099711.1, 
			 
			305,514- 
			306,272</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >142O19 
			(BH368698)</td >
			<td >2R:AAAB0100 
			 
			8805_5 (17A) 
			45,428,580- 
			45,429,264</td >
			<td >ABKP020247 
			01.1 
			 
			2,499- 
			3,185</td >
			<td >EQ090167.1 
			 
			315,806- 
			316,492</td >
			<td >ABKQ010123 
			76.1 
			 
			49,242- 
			49,942</td >
			<td >EQ099711.1 
			 
			1,791,625- 
			1,792,325</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >142O19 
			(BH368703)</td >
			<td >2R:AAAB0100 
			8805_8 (17A) 
			 
			45,560,099- 
			45,574,323</td >
			<td >ABKP020220 
			17.1 
			 
			30,971- 
			32,469</td >
			<td >EQ090167.1 
			200,518- 
			202,016</td >
			<td >ABKQ010123 
			79.1 
			 
			27,760- 
			28,508</td >
			<td >EQ099711.1 
			 
			1,903,569- 
			1,904,317</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabel 1. BLAST-resultaten van de BAC-uiteinde-sequenties tegen de genoomassemblages van An. gambiae.
<img alt="Dissectie van mugeneierenstokken; dissectiemicroscoop; chromosoompreparaat; fasecontrastmicroscopie." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1. Schematische weergave van chromosoompreparatie onder hoge druk. De eierenstokken van de mug worden getoond in het juiste ontwikkelingsstadium.
<img alt="Sonde-labeling voor chromosoommapping met geautomatiseerde hybridisatie op objectglaasjes en een scanmicroscoop." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2. Een schema dat geautomatiseerde FISH, het scannen van objectglaasjes en de chromosoommapping van genomische scaffolds weergeeft.
<img alt="Structuur van polytene chromosomen, microscopische afbeelding, analyse van DNA-bandingspatronen, genetisch onderzoek." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 3"> 
Figuur 3. Een preparaat van polyteen chromosoom 3 van An. gambiae, verkregen met de hogedruktechniek. 3L en 3R markeren de linker- en rechterarm bij hun telomeren. PH en IH duiden respectievelijk op pericentrisch en intercalair heterochromatine.
<img alt="Microscopische afbeelding waarin 3R/3L chromosoombandpatronen onder verschillende drukken worden vergeleken." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 4"> 
Figuur 4. Vergelijking van polytene chromosomen van An. gambiae voorbereid met de traditionele (boven) en hogedruktechniek (onder). De afbeeldingen tonen subdivisies 29A-30E van arm 3R (A) en 43D-46D van arm 3L (B).
<img alt="Diagram van chromosoommapping, fluorescente markers en genetische loci op polytene chromosomen van Drosophila." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 5"> 
Figuur 5. FISH van BAC-klonen op polytene chromosomen van An. gambiae. A) Hybridisatie van 102B24 (rood signaal) met de 2R-arm. B) Duaalkleur-FISH van 102B24 (rood signaal) en 142O19 (blauw signaal) op respectievelijk de onderverdelingen 16C en 16D van de uitgerekte 2R-arm. Pijlen geven de hybridisatiesignalen aan van BAC-klonen gelabeld met Cy3 (rood) en Cy5 (blauw). C-de centromere regio. a/+ toont de heterozygote 2La inversie. Chromosomen werden tegengekleurd met de fluorofoor YOYO-1.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+10K%3A+a+proposal+to+obtain+whole-genome+sequence+for+10%2C000+vertebrate+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hered%22%5BJournal%5D)">Genome 10K: a proposal to obtain whole-genome sequence for 10,000 vertebrate species.</a> J. Hered. 100, 659-674 (2009).</li>
<li>Robinson, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+Buzz+About+Insect+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Creating a Buzz About Insect Genomes.</a> Science. 331, 1386-1386 (2011).</li>
<li>Project description at Broad Institute [Internet]. , The Eli and Edythe L. Broad Institute of Harvard and MIT. Cambridge, MA. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/anopheles/">http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/anopheles/</a> (2012).</li>
<li>Besansky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Analysis+Of+Vectorial+Capacity+In+Major+Anopheles+Vectors+Of+Malaria+Parasites%5BTitle%5D)+AND+%22White+Paper%22%5BJournal%5D)">Genome Analysis Of Vectorial Capacity In Major Anopheles Vectors Of Malaria Parasites.</a> White Paper. , 1-15 (2008).</li>
<li>Alkan, C., Sajjadian, S., Eichler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+next-generation+genome+sequence+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Limitations of next-generation genome sequence assembly.</a> Nature. 8, 61-65 (2011).</li>
<li>Sharakhova, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+the+Anopheles+gambiae+PEST+genome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly.</a> Genome Biol. 8, R5(2007).</li>
<li>Lewin, H. A., Larkin, D. M., Pontius, J., O'Brien, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Every+genome+sequence+needs+a+good+map%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Every genome sequence needs a good map.</a> Genome Res. 19, 1925-1928 (2009).</li>
<li>Bhutkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+rearrangement+inferred+from+comparisons+of+12+Drosophila+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosomal rearrangement inferred from comparisons of 12 Drosophila genomes.</a> Genetics. 179, 1657-1680 (2008).</li>
<li>Novikov, D., Kireev, I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+treatment+of+polytene+chromosomes+improves+structural+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-pressure treatment of polytene chromosomes improves structural resolution.</a> Nature. 4, 483-485 (2007).</li>
<li>George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+cytogenetic+map+for+the+African+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution cytogenetic map for the African malaria vector Anopheles gambiae.</a> Insect Mol. Biol. 19, 675-682 (2010).</li>
<li>FISH Complete Automation [Internet]. , Abbott Laboratories. Abbott Park, IL. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.abbottmolecular.com/products/instrumentation-automation/fish/fish-automation.html">http://www.abbottmolecular.com/products/instrumentation-automation/fish/fish-automation.html</a> (2012).</li>
<li>The ACCORD system [Internet]. , BioView Ltd. Billerica, MA. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.bioview.co.il/htmls/article.aspx?c0=12510&bsp=12332&bss53=12332">http://www.bioview.co.il/htmls/article.aspx?c0=12510&bsp=12332&bss53=12332</a> (2012).</li>
<li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClements%2C+AN+%22The+Biology+of+Mosquitoes%3A+Development%2C+Nutrition+and+Reproduction%22">The Biology of Mosquitoes: Development, Nutrition and Reproduction</a>. , Chapman & Hall. (1992).</li>
<li>BLAST @ VectorBase.org [Internet]. , VectorBase.org. Notre Dame, IN. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://agambiae.vectorbase.org/Tools/BLAST/">http://agambiae.vectorbase.org/Tools/BLAST/</a> (2012).</li>
<li>Sharakhova, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaginal+discs--a+new+source+of+chromosomes+for+genome+mapping+of+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">Imaginal discs--a new source of chromosomes for genome mapping of the yellow fever mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e10(2011).</li>
<li>Scriven, P. N., Kirby, T. L., Ogilvie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+for+Pre-implantation+Genetic+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis.</a> J. Vis. Exp. (48), e2570(2011).</li>
<li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Drosophila+Polytene+Chromosome+Squashes+for+Antibody+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling.</a> J. Vis. Exp. (36), e1748(2010).</li>
<li>Vatolina, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Identical+Functional+Organization+of+Nonpolytene+and+Polytene+Chromosomes+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Correction: Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li>
</ol>

Geen belangenverstrengelingen gemeld.

De meest kritische stap van de hogedrukprocedure is het correct platdrukken van ovariële voedercellen die zijn geïsoleerd in het Christophers' III-stadium van de ovariële ontwikkeling13. Onjuist platdrukken kan leiden tot onvoldoende uitgespreide chromosomen, wat problemen kan veroorzaken bij het bepalen van de locaties van probes na FISH. Als de chromosomen te veel worden platgedrukt, kunnen ze breken of zodanig worden uitgerekt dat bandingspatronen verloren gaan. Het maken van meerdere preparaten zou moeten leiden tot consistentie bij het platdrukken van de slides met het Dremel-instrument, wat de algemene efficiëntie van de slideproductie zal verhogen. De hogedruktechniek werd oorspronkelijk ontwikkeld voor vers geïsoleerde speekselklieren van D. melanogaster9. Echter, eierstokken van muggen worden routinematig bewaard in een gemodificeerde Carnoy-fixatieoplossing (3 methanol: 1 glaciaal azijnzuur op volume) voordat ze worden gebruikt voor chromosomale preparaten. Daarom hebben we het bestaande hogedrukprotocol aangepast om het geschikt te maken voor de gefixeerde polytene chromosomen van de ovariële voedercellen van de malariamug An. gambiae. Omdat de hoge druk wordt uitgeoefend met een precisievise die over een zeer parallel werkoppervlak voor de gehele slide beschikt, kost het bereiden van de chromosoom-squash aanzienlijk minder tijd dan bij het gebruik van een traditionele tiktechniek met een potloodgum.
Andere belangrijke stappen zijn het voldoende weken van de follikels in 50% propionzuur en het verhitten van het objectglas. Beide stappen zijn essentieel om te helpen de chromosomen plat te maken. Als deze worden verwaarloosd, kunnen de chromosomen na dehydratie glanzend lijken, wat potentieel leidt tot een overmaat aan achtergrondruis die voor een signaal bij FISH kan worden aangezien. De techniek van het squashen onder hoge druk werkt ook goed met dezelfde oplossingen bij het maken van mitotische chromosoompreparaten. Het aanvullende spreiden en platmaken helpt om de chromosomen beter uit hun kernen te brengen. Het aanbrengen van gelijkmatige druk zou ze dienovereenkomstig plat moeten maken om metingen mogelijk te maken en potentieel een betere resolutie van de door kleuring zichtbare banden te verkrijgen. De details over het isoleren van mitotische chromosomen uit muggen worden elders beschreven15. Hoewel reguliere squash-preparaten voldoende zijn voor veel doeleinden, waaronder FISH 16 en immunokleuring17, verlaagt de methode onder hoge druk niet alleen de potentiële variantie van het ene objectglas naar het andere, maar verhoogt het ook de algemene chromosoomkwaliteit, wat leidt tot meer detail bij het in kaart brengen van chromosomen. Deze procedure kan ook worden gebruikt voor het prepareren van membraanpreparaten van polytene chromosomen voor laser-capture microdissectie.
Beperkingen van de hogedrukmethode omvatten het breken van het objectglas en het overmatig uitrekken van de chromosomen. Het breken van het objectglas als gevolg van een te hoge spanning op het glas via de bankschroef is mogelijk, maar wordt beperkt door het gebruik van de in het artikel vermelde drukken. Wat betreft het overmatig uitrekken van de chromosomen: als het Dremel-gereedschap gedurende een langere periode op het objectglas wordt toegepast, bestaat de mogelijkheid dat de chromosomen te veel worden uitgerekt en aan resolutie verliezen. Dit kan worden verholpen door het gereedschap gedurende een korte periode toe te passen, dit onder de microscoop te controleren en het Dremel-gereedschap langer te gebruiken als de chromosomen onvoldoende gespreid zijn.
Een traditioneel FISH-protocol omvat een reeks was- en incubatiestappen, die gewoonlijk 5-20 min duren en gedurende de gehele experimentduur bijna de volledige aandacht van een onderzoeker vereisen. Bovendien is het aantal preparaten dat handmatig kan worden verwerkt in een bepaald experiment meestal beperkt tot slechts enkele slides. In tegenstelling hiertoe voert een geautomatiseerd systeem voor het kleuren van preparaten alle stappen (inclusief wassen, incubatie, aanbrengen van de probe, denaturatie, hybridisatie, aanbrengen en verwijderen van het dekglas) automatisch uit. Dit bespaart een onderzoeker tot 6-8 werkuren tijdens een FISH-experiment. Daarnaast kan een geautomatiseerd FISH-systeem de doorvoersnelheid aanzienlijk verhogen. Zo is het Xmatrx-systeem in staat om gelijktijdig tot 40 assays op enkelvoudige preparaten en tot 80 assays op dubbele preparaten te verwerken. Een beperking van dit systeem is dat het niet efficiënt is voor een klein aantal FISH-experimenten, aangezien het het bereiden van grote volumes oplossingen vereist. Bovendien kan het in het systeem geprogrammeerde FISH-protocol aanpassingen en correcties vereisen voor nieuwe toepassingen.
Een slide-scanningsysteem is een geautomatiseerde versie van een fluorescentiemicroscoop. Geautomatiseerde tafelverplaatsing en een eenvoudig bedieningspaneel voor de microscoop besparen de onderzoeker tijd en maken het bedienen van de microscoop uiterst eenvoudig. Zo maakt de software in het ACCORD PLUS-scanningsysteem het eenvoudig om meerdere fluorescentiekanalen vast te leggen en de beeldacquisitie gemakkelijk te beheren. Een voorbeeld hiervan is de mogelijkheid om z-stacks vast te leggen in plaats van één enkele afbeelding; de software legt een configureerbare z-stack van beelden vast om te garanderen dat ten minste één beeld scherp blijft. Hoewel dit systeem primair is ontwikkeld voor de acquisitie van meerdere beelden (veel cellen op één objectglas), maakt het het vinden van chromosomen op het objectglas nog steeds veel eenvoudiger dan wanneer men handmatig over het objectglas navigeert.
Zowel het geautomatiseerde systeem voor het kleuren van coupes als het scansysteem worden routinematig door cytogenetica-klinieken gebruikt voor FISH-diagnostiek van chromosomale afwijkingen in menselijke cellen. In deze studie hebben we een protocol ontwikkeld dat deze geautomatiseerde systemen benut voor een fundamentele onderzoekstoepassing. Het geautomatiseerde high-throughput protocol voor fysieke mapping kan de snelle ontwikkeling van fysieke chromosoomkaarten voor elke gewenste soort vergemakkelijken. Hoewel we in dit rapport polytene chromosomen hebben gebruikt voor fysieke mapping, kunnen mitotische chromosomen ook met deze systemen worden gebruikt. Het zou nuttig zijn om het protocol aan te passen voor mitotische chromosomen, aangezien de meeste organismen geen leesbare polytene chromosomen ontwikkelen. Echter kunnen polytene chromosomen, wanneer beschikbaar, nuttige informatie verschaffen over de correspondentie van functionele genoomdomeinen met de chromosoomstructuur op de hoogste resolutie. De organisatorische principes van polytene chromosomen, zoals patronen van banden en interbanden, zijn onlangs vergeleken met die van reguliere niet-polytene (interfase) chromosomen18. Daarom heeft de gedetailleerde fysieke mapping die is uitgevoerd op chromosoompreparaten onder hoge druk het potentieel om DNA-sequenties te koppelen aan specifieke chromosomale structuren zoals banden, interbanden, puffs, centromeren, telomeren en heterochromatine; waardoor chromosoomgebaseerde genoomassemblages kunnen worden gecreëerd.

<table><tbody><tr><td>22x22 mm microscoopdekglaasjes</td><td>Fisher</td><td>12-544-10</td><td></td></tr><tr><td>18x18 mm microscoopdekglaasjes</td><td>Fisher</td><td>12-553-402</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Fisher</td><td>A491-212</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Propionzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 200 rotary tool met een Flex-Shaft opzetstuk</td><td>Rand</td><td></td><td>3&quot; multifunctionele mini-bankslijper (met toerentalbegrenzer)</td></tr><tr><td>Speciaal ontworpen 200 &amp;mu;l plastic tips (met gekraalde plastic randen) voor Dremel tool</td><td>Pipetman</td><td>F171300</td><td>Snijd en verhit het dikke uiteinde van de pipetpunten</td></tr><tr><td>Vertinde snelsluitende bankschroef</td><td>Avenger Gold Toolmaker</td><td>MTC-200-1</td><td>Precisieslepen haaks en parallel tot binnen 0.00025</td></tr><tr><td>Koppelmoersleutel</td><td>Craftsman</td><td>44593</td><td></td></tr><tr><td>ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td><td>Abbott Molecular</td><td>30-144110</td><td></td></tr><tr><td>25 mm barrière-objectglazen</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT108-SL</td><td></td></tr><tr><td>25 mm dekglaasjes</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT122-90X</td><td></td></tr><tr><td>Xmatrx Automated Slide Staining System</td><td>Abbott Molecular</td><td>08L46-001</td><td></td></tr><tr><td>MZ6 Leica stereomicroscoop</td><td>Leica</td><td>VA-OM-E194-354</td><td>Een andere stereomicroscoop kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Olympus CX41 fasecontrastmicroscoop</td><td>Olympus</td><td>CX41RF-5</td><td>Een andere fasecontrastmicroscoop kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>ACCORD PLUS Automated Scanning System</td><td>BioView (USA)</td><td>BV-5000-ACCP</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>10% NBF (neutraal gebufferde formaline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>99% formamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP227500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrantsulfaat natriumzout</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC-buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9765</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt-oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>1 mM YOYO-1 jodiumide (491/509) oplossing in DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade-reagens</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Fermentas</td><td>R0141, R0151, R0161, R0171</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53022, PA55022</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>DNA polymerase I</td><td>Fermentas</td><td>EP0041</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput fysische in kaart brengen van chromosomen met automatisch<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projecten om volledige genoomsequenties te verkrijgen voor 10.000 gewervelde diersoorten1 en voor 5.000 insecten- en verwante arthropodensoorten2 zullen naar verwachting de komende 5 jaar plaatsvinden. Zo wordt bijvoorbeeld de sequencing van de genomen van 15 malariamuggensoorten momenteel uitgevoerd met een Illumina-platform3,4. Deze Anopheles-soortencluster omvat zowel vectoren als niet-vectoren van malaria. Wanneer de genoomassemblages beschikbaar komen, krijgen onderzoekers de unieke kans om comparatieve analyses uit te voeren om evolutionaire veranderingen af te leiden die relevant zijn voor het vermogen als vector. Het is echter moeilijk gebleken om next-generation sequencing reads te gebruiken voor het genereren van hoogwaardige de novo genoomassemblages5. Bovendien zijn de bestaande genoomassemblages voor Anopheles gambiae, hoewel verkregen via de Sanger-methode, incompleet of gefragmenteerd4,6.
Het succes van comparatieve genomische analyses zal beperkt zijn als onderzoekers te maken hebben met talrijke sequencing contigs in plaats van chromosoomgebaseerde genoomassemblages. Gefragmenteerde, niet-toegewezen sequenties veroorzaken problemen voor genomische analyses omdat: (i) niet-geïdentificeerde gaten leiden tot een onjuiste of onvolledige annotatie van genomische sequenties; (ii) niet-toegewezen sequenties leiden tot verwarring tussen paraloge genen en genen van verschillende haplotypes; en (iii) het gebrek aan chromosoomtoewijzing en oriëntatie van de sequencing contigs het onmogelijk maakt om de fylogenie van herschikkingen te reconstrueren en de evolutie van chromosomen te bestuderen. Het ontwikkelen van fysische kaarten met een hoge resolutie voor soorten met recent gesequenced genomen is een tijdige en kosteneffectieve investering die de genoomannotatie, evolutionaire analyse en re-sequencing van individuele genomen uit natuurlijke populaties zal vergemakkelijken7,8.
Hier presenteren wij innovatieve benaderingen voor chromosoompreparatie, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en beeldvorming die de snelle ontwikkeling van fysieke kaarten faciliteren. Met An. gambiae als voorbeeld tonen we aan dat de ontwikkeling van fysieke chromosoomkaarten potentieel genoomassemblages en daarmee de kwaliteit van genomische analyses kan verbeteren. Ten eerste gebruiken we een hogedrukmethode om polytene chromosoompreparaten te maken. Deze methode, oorspronkelijk ontwikkeld voor Drosophila9, stelt de gebruiker in staat om meer details op chromosomen te visualiseren dan met de reguliere squashing-techniek10. Ten tweede wordt een volledig geautomatiseerd front-endsysteem voor FISH gebruikt voor high-throughput fysieke genoommapping. Het geautomatiseerde systeem voor het kleuren van preparaten voert meerdere assays gelijktijdig uit en vermindert de actieve werktijd aanzienlijk11. Ten derde scant en fotografeert een automatisch fluorescent beeldvormingssysteem, inclusief een gemotoriseerde objecttafel, automatisch de gelabelde chromosomen na FISH12. Dit systeem is bijzonder nuttig voor het identificeren en visualiseren van meerdere chromosomale platen op hetzelfde preparaat. Bovendien levert het scanproces een uniformer FISH-resultaat op. Over het algemeen is het geautomatiseerde high-throughput protocol voor fysieke mapping efficiënter dan een standaard handmatig protocol.

Genoomassemblages op basis van massaal parallelle DNA-sequencingtechnologieën zijn doorgaans sterk gefragmenteerd. De ontwikkeling van fysieke chromosoomkaarten kan genoomassemblages potentieel verbeteren. Hier demonstreren we innovatieve benaderingen voor chromosoompreparatie, fluorescentie in situ hybridisatie en imaging die de doorvoer van de ontwikkeling van de fysieke kaart aanzienlijk verhogen.

High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Projecten om genoomsequenties van het volledige genoom te verkrijgen voor 10.000 gewervelde diersoorten1 en voor 5.000 insecten- en verwante arthropodensoorten2 zullen naar verwachting plaatsvinden ...

Het algemene doel van deze procedure is om DNA-probes in kaart te brengen op polytane chromosomen van muggen met behulp van een chromosoompreparaat onder hoge druk, gevolgd door geautomatiseerde fluorescentie in situ hybridisatie en geautomatiseerde beeldvorming. Dit wordt bereikt door eerst polytane chromosoomspreidingen te maken met een methode onder hoge druk. De volgende stap van de procedure is het bereiden van fluorescente probes door genomisch DNA te labelen met het fluorochroom via een nick-translatieprotocol.De derde stap is het uitvoeren van fluorescentie-in-situ-hybridisatie met behulp van geautomatiseerde systeem voor het kleuren van coupes. De laatste stap is het scannen en fotograferen van de gelabelde chromosomen met een automatisch fluorescentie-beeldvormingssysteem. Uiteindelijk kunnen de beelden de lokalisatie van een fluorescent gelabelde DNA-sonde op het polychrome chromosoom tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals een standaard handmatig in situ hybridisatieprotocol, is dat dit fysieke mappingprotocol met de hoogste doorvoer consistenter resultaten oplevert en de actieve werktijd drastcznie vermindert. Dit protocol begint bij het dissecteren van vrouwtjes van half gravity en oly ongeveer 25 uur na het bloedvoedsel om hun eierstokken te verzamelen wanneer deze zich in Christopher's stadium drie bevinden. In dit stadium moet het transparante gebied met voedercellen binnen de follikels een ronde vorm hebben; verzamel de eierstokken van vijf vrouwtjes en fixeer deze in 500 µL vers bereide gemodificeerde carnoise-oplossing.Deze kunnen vervolgens tot 24 uur bij kamertemperatuur worden bewaard, of langer bij -20 °C. Bereid vervolgens, vlak voordat de preparaten voor de dissectie van de eierstokken worden gemaakt, een carnoise-oplossing en 50% propionzuur. Plaats elk paar eierstokken in een druppel verse carnoise-oplossing op een stofvrije objectglas onder een dissectiemicroscoop.Splits de eierstokken met de dissectenaald. Breng alle stukjes eierstok over naar zes schone objectglazen met 50% propionzuur. Scheid de follikels van elkaar met behulp van dissectenaalden.Veeg vervolgens eventuele resterende weefsels weg met een papieren handdoek. Voeg nog een druppel 50% propionzuur toe en wacht drie tot vijf minuten. Legenda: het laten rusten van de follikels in 50% propionzuur gedurende drie tot vijf minuten verbetert de chromosoomspreiding aanzienlijk.Breng vervolgens een dekglas aan en wacht nog een minuut om de kernen te laten verspreiden. Wikkel de objectglas in filterpapier en plastic. Stel een Dremel in op een snelheid tussen de 3.000 en 5.000 RPM en draai gedurende ongeveer één minuut voorzichtig met een draaiende Dremel-top over het dekglas.Bevestig de kwaliteit van de verspreiding met een fascontrastmicroscoop en gebruik de dremel indien nodig langer om de chromosomen af te platten. Plaats een tweede dekglas naast het eerste en klem de dekglazen vervolgens tussen twee microscopen. Wikkel de objectglazen daarna in een plastic vel en filterpapier; plaats de ingepakte glazen in een bankschroef om ze samen te persen met een kracht tussen 85 en 120 inch-pounds.Nadat de chromosomen op alle zes de objectglaasjes zijn platgemaakt, worden de glaasjes uitgewikkeld en worden de extra glaasjes verwijderd om de chromosomen verder plat te maken. Incubeer de glaasjes 10 tot 15 minuten bij 55 °C in een denaturatie-hybridisatiesysteem voor objectglaasjes. Doop vervolgens een objectglas gedurende ten minste 15 seconden in vloeibare stikstof of totdat het borrelen is gestopt.Verwijder vervolgens snel het dekglas met een scheermesje en plaats het preparaat onmiddellijk gedurende vijf minuten in koud 50% ethanol. Herhaal dit proces opeenvolgend voor elk preparaat. Dehydrateer de preparaten in baden van 70%, 90% en 100% ethanol.Dompel ze vijf minuten in elk bad. Ten slotte, nadat de coupes aan de lucht zijn gedroogd, zijn ze klaar voor de kleuring. Een geautomatiseerd apparaat voert de meeste stappen van de procedure uit, behalve de labeling van de probe.Bereid dus, voorafgaand aan het laden van het apparaat, de fluorescente probe voor door het back-DNA te labelen met het fluorochroom met behulp van een commercieel NIC-translatieprotocol. Nadat de probe is voorbereid, worden de dia's en reagentia in het geautomatiseerde dia-kleuringssysteem geladen en wordt het systeem geprogrammeerd om de volgende stappen uit te voeren. Lever eerst 800 µL 1x PBS voor 20 minuten.Ten tweede worden de objectglazen drooggeblazen. Ten derde worden de objectglazen één minuut gefixeerd met 450 µL 4% formaline in 1x PBS. Was de objectglazen vervolgens twee keer gedurende één seconde en daarna gedurende twee minuten met 100% ethanol.Blaas de slides na het ethanolbad opnieuw droog. Verwarm de slides vervolgens gedurende twee minuten op 45 °C om bellenvorming te voorkomen. Breng daarna 20 µL van de DNA-sonde aan, gevolgd door een druppel minerale olie en een dekglas; denatureer vervolgens de chromosomen gedurende 10 minuten op 90 °C.Laat de coupes vervolgens hybridiseren bij 42 °C gedurende 14 uur. Voer na de hybridisatie stringenswasbeurten uit van twee minuten bij 42 °C, gevolgd door vier opeenvolgende applicaties van 2X SSC gedurende één seconde en droging. Breng daarna twee keer 800 µL 0,4X SSC aan bij 42 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door nog één wasbeurt en 2X SSC bij 25 °C gedurende 10 minuten.Breng nu de kleurstof aan: 50 µL YO-YO-1, gevolgd door minerale olie en dekglasjes. Incubeer de preparaten gedurende 10 minuten bij 25 °C. Verwijder vervolgens de dekglasjes.Was de preparaten vier keer gedurende één seconde per wasbeurt in twee XSSC en blaas de preparaten droog. Breng tot slot 15 µL prolonged gold anti fade-reagens aan op elk preparaat en bevestig nieuwe dekglasjes. Zet het Accord plus automatische scansysteem aan, beginnend met de Olympus U-R-F-L-T voeding voor een halogeenlamp.Vervolgens de computer en tot slot de microscoop met camera-accessoire. Open nu eerst het duet-softwarepakket en stel een 10 x pre-scan in. Klik op de online-knop, voer een nieuw case-ID in en wijs een slide-ID toe.Klik op het punt met het label bf. Dit is de optie voor helderveldmicroscopie. Selecteer als scanoptie de 10 x pre-scan.Selecteer 2.500 x cirkel, 10.000 x cirkel of rechthoek. Klik op 'set' en 'run'. Volg vervolgens de aanwijzingen om het scannen correct af te stellen en klik daarna op 'finish'.Druk om de scan te starten op het hoofdtabblad om terug te gaan naar het hoofdscherm. Klik nu op de knop voor offline modus, zoek het toegewezen case-ID en slide-ID, en klik op offline.Scan het zwarte kader in het gebied linksboven. Klik op een pijl en selecteer 10 x pre-scan. Gebruik de pijlen om door de gescande beelden te navigeren nadat een interessant beeld is gevonden.Dubbelklik op het scherm in het midden van het doelgebied en druk op 'snap'. Hiermee wordt een afbeelding gemarkeerd voor latere vastlegging, nadat alle doelgebieden zijn geselecteerd. Klik met de rechtermuisknop op elke afbeelding, klik op 'classify', selecteer '10 x pre-scan' en selecteer 'polytan'.Keer terug naar het hoofdmenu en stel de 40 x pre-scan in. Selecteer opnieuw online en selecteer een objectglas. Wijzig BF naar ffl en wijzig de taaknaam naar revisit dash X 40 dash rg.Wijzig de sectie direct onder de laatste instelling om dash all opnieuw te bezoeken. Voer vervolgens het programma uit en volg de aanwijzingen. Om de automatisering in te stellen, klikt u op de knop start matching views om de 10 x en 40 x afbeeldingen te matchen.Klik op finish om de scan te starten. Klik na voltooiing op classify en bekijk de afbeeldingen. Preparaten van polytane chromosomen uit nurse-cellen van de eierstok van vrouwelijke anomaly Gambia werden gemaakt met behulp van de hogedruktechniek.Deze methode beschadigt of verandert de meeste chromosoomstructuren niet. Het vlakt gebogen chromosomen af en onthult zo verborgen fijne banden die op reguliere preparaten niet zichtbaar zijn. Het chromosoom werd gesondeerd met DNA-klonen verkregen uit de anomaly S Gambia nd Tam back-bibliotheek.De bibliotheek werd gegenereerd uit mannelijke en vrouwelijke eerste-stadium larven van de anomaly S Gambia-plaagstam. Na deze procedure kan een geautomatiseerde high-throughput fysieke mapping worden uitgevoerd om de snelle ontwikkeling van chromosoomgebaseerde genoomassemblages te vergemakkelijken.

high-throughput-physical-mapping-chromosomes-using-automated-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hele Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van E8.5 aan E11.5 muis embryo&#39;s

Chromosomics: Detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman OctoChrome FISH-test

Een kwantitatieve methode voor de analyse van chromosoom replicatie timing beschreven. De werkwijze gebruikt BrdU opname in combinatie met...

Chromosoom repliceren Timing In combinatie met TL-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) maakt de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving binnen cellen. We beschrijven hier een protocol voor gecombineerde, gelijktijdige detectie van RNA en DNA door middel van FISH, die kan worden gebruikt om X-chromosoom inactivatie in muis embryonale stamcellen.

Gecombineerde DNA-RNA-TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) aan X-chromosoom inactivatie studeren in Gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen

Methoden voor het in kaart brengen van in vivo eiwit-DNA-interacties worden cruciaal voor elk aspect van genomisch onderzoek, maar ze zijn arbeidsintensief, duur en tijdrovend. Hier wordt een commercieel verkrijgbaar robotsysteem voor vloeistofbehartiging gepresenteerd dat chromatine-immunoprecipitatie automatiseert voor het in kaart brengen van in vivo eiwit-DNA-interacties met beperkte hoeveelheden cellen.

Automatiseren van ChIP-seq Experimenten om Genereer Epigenetische Profielen op 10.000 HeLa-cellen

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het uitvoeren van fluorescentie DNA in situ hybridisatie (DNA ISH) om repetitieve heterochromatische sequenties op op glaasjes gemonteerde chromosomen te visualiseren. De methode vereist minimale reagentia en is veelzijdig voor gebruik met korte of lange sondes, verschillende weefsels en detectie met fluorescentie of niet-fluorescentie gebaseerde signalen.

Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie aan Geplette Chromosomen

Dit manuscript presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van X-chromosoom arm sondes en presterende fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te onderzoeken van de Braziliaanse deelstaat zus chromatide cohesie in prometaphase en metafase ik gearresteerd  Drosophila eicellen. Dit protocol is geschikt om te bepalen of cohesie Meiotische arm intact of verstoord in verschillende genotypen is.

Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het identificeren van homologe recombinatie gebeurtenissen die hebben plaatsgevonden in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern blotting en/of PCR. Deze methode wordt geïllustreerd door de generatie van nonmuscle myosin II genetische vervanging Muismodellen met behulp van traditionele embryonale stamcel gebaseerde homologe recombinatie-gemedieerde targeting technologie.

Identificatie van homologe recombinatie gebeurtenissen in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern Blotting en de Kettingreactie van de Polymerase

Dit artikel beschrijft een semiautomatiseerd, microschaal ChIP-Seq-protocol van DNA-regio's geassocieerd met een specifieke histonmodificatie (H3K27ac) met behulp van een ChIP-vloeistofhandlerplatform, gevolgd door bibliotheekvoorbereiding met behulp van tagmentatie. De procedure omvat controlebeoordeling voor kwaliteits- en kwantiteitsdoeleinden en kan worden toegepast op andere histonmodificaties of transcriptiefactoren.

Een semiautomatiseerde ChIP-Seq-procedure voor grootschalige epigenetische studies

Dit protocol presenteert een techniek voor het in kaart brengen van replicatielocaties met hoge resolutie in structureel geconserveerd chromatine in situ die een combinatie van pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold-labeling en ChromEMT gebruikt.

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin door Electron Tomography

Leer een high-throughput protocol voor fysieke chromosoommapping bij muggen met geautomatiseerde fluorescentie-in-situ-hybridisatie. Deze methode verbetert efficiëntie en consistentie in genoomonderzoek.

High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch

Meer video's verkennen