High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch In situ Hybridisatie
28 juni 2012
Genoomassemblages gebaseerd op massaal parallelle DNA-sequencingtechnologieën zijn meestal sterk gefragmenteerd. De ontwikkeling van fysieke chromosoomkaarten kan mogelijk genoomassemblages verbeteren. Hier demonstreren we innovatieve benaderingen voor chromosoomvoorbereiding, fluorescente in situ hybridisatie en beeldvorming die de doorvoer van de ontwikkeling van fysieke kaarten aanzienlijk verhogen.
Het algemene doel van deze procedure is om DNA-probes toe te wijzen aan de polytan-chromosomen van muggen met behulp van een chromosoomvoorbereiding onder hoge druk, gevolgd door geautomatiseerde fluorescentie in C twee hybridisatie en geautomatiseerde beeldvorming. Dit wordt bereikt door eerst polytan-chromosoomuitstrekkingen te bereiden met behulp van een hogedrukmethode. De volgende stap van de procedure is om fluorescente proben te bereiden door genomisch back DNA te labelen met de fluorochroom met behulp van een Nick-translatieprotocol.
De derde stap is het uitvoeren van fluorescente in C twee hybridisatie met behulp van geautomatiseerde schuifkleuringssystemen. De laatste stap is om gelabelde chromosomen te scannen en te fotograferen met behulp van een automatisch fluoresceringsbeeldvormingssysteem. Uiteindelijk kunnen afbeeldingen de lokalisatie van een fluorescerend gelabelde DNA-probe op het polychromosoom tonen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek of bestaande methoden, zoals een standaard handmatige in situ hybridisatieprotocol, is dat het hoogste doorvoerfysische mappingprotocol meer consistente resultaten produceert en de hands-on tijd aanzienlijk vermindert. Dit protocol begint met het dissecteren van vrouwtjes bij halve zwaartekracht op ongeveer 25 uur na het bloedvoeden om hun eierstokken te verzamelen wanneer ze zich in Christopher's stadium drie bevinden. In dit stadium zou het transparante gebied met verpleegcellen binnenin de follikels een ronde vorm moeten hebben, verzamel eierstokken van vijf vrouwtjes en fixeer ze in 500 microliter vers gemaakte gemodificeerde car noise-oplossing.
Ze kunnen vervolgens tot 24 uur bij kamertemperatuur worden bewaard of langer bij min 20 graden Celsius. Vervolgens, net voordat je eierstokdissectieschuiven maakt, bereid car noise-oplossing en 50% propionzuur voor. Plaats elk paar eierstokken in een druppel verse car noise-oplossing op een stofvrije schuif onder een dissectiemicroscoop.
Splits de eierstokken met de dissectienaad. Breng alle eierstokstukken over naar zes schone schuiven met 50% propionzuur. Scheid de follikels van elkaar met behulp van dissectienaalden.
Wisch vervolgens eventueel resterend weefsel weg met een papieren handdoek. Voeg nog een druppel van 50% propionzuur toe en wacht drie tot vijf minuten. Legende, de follikels zitten drie tot vijf minuten in 50% Proponisch zuur, wat de chromosoomuitstrekking aanzienlijk verbetert.
Breng vervolgens een dekglas aan en wacht nog een minuut om de kernen te verspreiden. Wikkel de schuif in met filterpapier en plastic. Zet een Dremel in tussen de drie en 5.000 RPM en zwaaide ongeveer een minuut lang een draaiende Dremel-tip lichtjes tegen het dekglas.
Bevestig de uitbreidingskwaliteit met een fasemicroscoop en pas de Dremel langer toe indien nodig om de chromosomen plat te maken. Plaats een tweede dekglas naast de eerste, vervolgens worden de dekglazen met een andere microscoop gesandwicht. Schuif vervolgens, wikkel de schuiVen met een plastic folie en met filterpapier, plaats de wikkelschuiven in een tang om de schuiVen tussen 85 en 120 inch pond te knijpen.
Nadat de chromosomen op alle zes de schuiVen zijn platgemaakt, wikkel je de schuiVen uit en verwijder je de extra schuiVen om de chromosomen verder plat te maken. Incubeer de schuiVen gedurende 10 tot 15 minuten bij 55 graden Celsius op een schuifdenaturatiehybridisatiesysteem. Doop vervolgens een schuif gedurende ten minste 15 seconden in vloeibare stikstof of totdat het borrelen is gestopt.
Verwijder vervolgens snel het dekglas met een scheermes en plaats de schuif onmiddellijk in koud 50% ethanol gedurende vijf minuten. Herhaal dit proces voor elke schuif achter elkaar. Dehydrateer de schuiVen in een 70% en 90% en een 100% ethanolbad.
Dompel ze onder in elk bad gedurende vijf minuten. Ten slotte, nadat de schuiVen zijn uitgedroogd, zijn ze klaar voor vis voor kleuring. Een geautomatiseerd apparaat voert de meeste stappen in de procedure uit, behalve het labelen van de proben. Dus voordat je het apparaat laadt, bereid je de fluorescente probe voor door back DNA te labelen met de fluorochroom met behulp van een commercieel NIC-translatieprotocol met de probe voorbereid, laad de schuiVen en reagentia in de geautomatiseerde schuiVen. Kleuringssysteem en programmeer het systeem om de volgende stappen uit te voeren. Eerst, lever 800 microliter van één XPBS gedurende 20 minuten.
Ten tweede, blaas de schuiVen droog. Ten derde, fixeer de schuiVen met 450 microliter van 4% formaline in één XPBS gedurende één minuut. Was vervolgens de schuiVen met 100% ethanol gedurende één seconde, tweemaal en gedurende twee minuten.
Na de ethanolbad, blaas de schuiVen opnieuw droog. Verwarm nu de schuiVen gedurende twee minuten op 45 graden Celsius om borrelen te voorkomen. Breng vervolgens 20 microliter van de DNA-probe aan, gevolgd door een druppel minerale olie en een dekglas volgende in de natuur, de chromosomen gedurende 10 minuten op 90 graden Celsius.
Stel vervolgens de schuiVen in om te hybridiseren gedurende 14 uur op 42 graden Celsius. Na de hybridisatie stel de strengheidswassen in gedurende twee minuten op 42 graden Celsius, gevolgd door vier opeenvolgende toepassingen van één seconde van twee XSSC en drogen. Breng vervolgens 800 microliter van 0,4 XSSC gedurende 10 minuten twee keer aan bij 42 graden Celsius, gevolgd door één extra was en twee XSSC bij 25 graden Celsius gedurende 10 minuten.
Breng nu de kleurstof 50 microliter yo-yo een aan gevolgd door minerale olie en dekglas. Incubeer de schuiVen gedurende 10 minuten op 25 graden Celsius. Verwijder vervolgens de dekglas.
Was schuiVen in twee XSSC vier keer gedurende één seconde per was en blaas de schuiVen droog. Breng vervolgens 15 microliter van de verlengde goud anti-fade reagens op elke schuif aan en bevestig nieuwe dekglas. Zet het Accord plus geautomatiseerde scansyst
Overzicht
Deze studie presenteert een hoogdoorvoerprotocol voor het toewijzen van DNA-sondes aan polytan-chromosomen van muggen. Door gebruik te maken van chromosoomvoorbereiding onder hoge druk en geautomatiseerde beeldvormingstechnieken, verbetert de methode de efficiëntie en consistentie van de ontwikkeling van fysieke kaarten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genomics
- Chromosoommapping
- Fluorescente in situ hybridisatie
Achtergrond
- Genoomassemblies uit DNA-sequencing zijn vaak gefragmenteerd.
- Fysieke chromosoomkaarten kunnen de kwaliteit van genoomassemblies verbeteren.
- Innovatieve technieken kunnen de doorvoer in fysische mapping verhogen.
- Geautomatiseerde systemen kunnen de hands-on tijd in laboratoriumprocedures verminderen.
Doel van de studie
- Om een hoogdoorvoerprotocol voor chromosoommapping te ontwikkelen.
- Om de effectiviteit van geautomatiseerde beeldvorming in de ontwikkeling van fysieke kaarten te demonstreren.
- Om de consistentie van resultaten te verbeteren in vergelijking met traditionele methoden.
Gebruikte methoden
- Chromosoomvoorbereiding onder hoge druk uit eierstokken van muggen.
- Labeling van fluorescente sondes met behulp van het Nick-translatieprotocol.
- Geautomatiseerde fluorescente in situ hybridisatie.
- Geautomatiseerde beeldvorming voor chromosoomlokalisatie.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol produceert consistente en hoogwaardige chromosoomuitstrijksels.
- Geautomatiseerde systemen verminderen de tijd die nodig is voor fysische mapping aanzienlijk.
- Beeldingen tonen effectief de lokalisatie van fluorescent gelabelde DNA-sondes.
- De methode verbetert de doorvoer in vergelijking met handmatige protocollen.
Conclusies
- Dit hoogdoorvoerprotocol is een significante vooruitgang in chromosoommapping.
- Automatisering verbetert de efficiëntie en consistentie in fysische mapping.
- De gedemonstreerde technieken kunnen worden toegepast op andere genomische studies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput physical chromosome mapping addresses a critical bottleneck in genome assembly quality, directly impacting downstream genomic analyses and evolutionary studies. By enabling rapid, consistent localization of DNA probes, this approach supports de-risking of target validation and improves predictive confidence in comparative genomics workflows. The integration of automation reduces hands-on time and enhances reproducibility, positioning the method as a scalable capability for large-scale sequencing projects.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genomic architecture and clarification of gene localization relative to phenotypic traits.
- Operational Value: Reduces ambiguity in gene annotation by assigning contigs to specific chromosomal locations.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by improving confidence in gene function inference through accurate physical mapping.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-resolution chromosome spreads suitable for reproducible FISH-based assays.
- Operational Value: Automated staining and imaging systems increase throughput and reduce variability in probe localization detection.
- Assay Readiness: Generates quantifiable spatial outputs that enable comparison across genetic variants or experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates evolutionary analysis and phylogenetic reconstruction by assigning orientation and location to sequencing contigs.
- Preclinical Model Relevance: Supports vector competence studies by enabling comparative genomics in disease-transmitting versus non-transmitting species.
- Risk-Adjusted Advancement: Improves genome annotation quality, reducing false positives in target identification pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early genome sequencing through annotation and comparative analysis, particularly when physical map resolution is needed to resolve assembly gaps or misassemblies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding gene order, synteny, and chromosomal evolution in disease-relevant models.
- Screening: Enables standardized, automated FISH workflows for high-throughput probe validation and localization screening.
- Analytics: Generates spatial and intensity-based readouts that allow quantitative comparison of probe binding across chromosomes or samples.
- Translational Research: Connects physical mapping to evolutionary inference and biomarker discovery in comparative genomics studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for physical mapping applicable across multiple species and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene annotation and reduces mechanistic ambiguity in genomic data interpretation.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through automation of staining, hybridization, and imaging steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target selection by enhancing genome assembly reliability and reducing biological false leads.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genomic targets through improved assembly quality and evolutionary insight.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromosome preparation, FISH protocols, and automated imaging systems.
- Dependent on access to high-pressure preparation tools, automated slide stainers, and motorized fluorescence microscopes.
- Necessitates cross-team standardization for probe labeling, hybridization conditions, and image analysis pipelines.
- Adaptation across model systems may require optimization of chromosome spreading and denaturation steps.
- Practical limitations include dependency on high-quality polytene chromosomes and suitability primarily for dipteran genomes with polytene stages.
