High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch In situ Hybridisatie
28 juni 2012
Genoomassemblages gebaseerd op massaal parallelle DNA-sequencingtechnologieën zijn meestal sterk gefragmenteerd. De ontwikkeling van fysieke chromosoomkaarten kan mogelijk genoomassemblages verbeteren. Hier demonstreren we innovatieve benaderingen voor chromosoomvoorbereiding, fluorescente in situ hybridisatie en beeldvorming die de doorvoer van de ontwikkeling van fysieke kaarten aanzienlijk verhogen.
Het algemene doel van deze procedure is om DNA-probes toe te wijzen aan de polytan-chromosomen van muggen met behulp van een chromosoomvoorbereiding onder hoge druk, gevolgd door geautomatiseerde fluorescentie in C twee hybridisatie en geautomatiseerde beeldvorming. Dit wordt bereikt door eerst polytan-chromosoomuitstrekkingen te bereiden met behulp van een hogedrukmethode. De volgende stap van de procedure is om fluorescente proben te bereiden door genomisch back DNA te labelen met de fluorochroom met behulp van een Nick-translatieprotocol.
De derde stap is het uitvoeren van fluorescente in C twee hybridisatie met behulp van geautomatiseerde schuifkleuringssystemen. De laatste stap is om gelabelde chromosomen te scannen en te fotograferen met behulp van een automatisch fluoresceringsbeeldvormingssysteem. Uiteindelijk kunnen afbeeldingen de lokalisatie van een fluorescerend gelabelde DNA-probe op het polychromosoom tonen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek of bestaande methoden, zoals een standaard handmatige in situ hybridisatieprotocol, is dat het hoogste doorvoerfysische mappingprotocol meer consistente resultaten produceert en de hands-on tijd aanzienlijk vermindert. Dit protocol begint met het dissecteren van vrouwtjes bij halve zwaartekracht op ongeveer 25 uur na het bloedvoeden om hun eierstokken te verzamelen wanneer ze zich in Christopher's stadium drie bevinden. In dit stadium zou het transparante gebied met verpleegcellen binnenin de follikels een ronde vorm moeten hebben, verzamel eierstokken van vijf vrouwtjes en fixeer ze in 500 microliter vers gemaakte gemodificeerde car noise-oplossing.
Ze kunnen vervolgens tot 24 uur bij kamertemperatuur worden bewaard of langer bij min 20 graden Celsius. Vervolgens, net voordat je eierstokdissectieschuiven maakt, bereid car noise-oplossing en 50% propionzuur voor. Plaats elk paar eierstokken in een druppel verse car noise-oplossing op een stofvrije schuif onder een dissectiemicroscoop.
Splits de eierstokken met de dissectienaad. Breng alle eierstokstukken over naar zes schone schuiven met 50% propionzuur. Scheid de follikels van elkaar met behulp van dissectienaalden.
Wisch vervolgens eventueel resterend weefsel weg met een papieren handdoek. Voeg nog een druppel van 50% propionzuur toe en wacht drie tot vijf minuten. Legende, de follikels zitten drie tot vijf minuten in 50% Proponisch zuur, wat de chromosoomuitstrekking aanzienlijk verbetert.
Breng vervolgens een dekglas aan en wacht nog een minuut om de kernen te verspreiden. Wikkel de schuif in met filterpapier en plastic. Zet een Dremel in tussen de drie en 5.000 RPM en zwaaide ongeveer een minuut lang een draaiende Dremel-tip lichtjes tegen het dekglas.
Bevestig de uitbreidingskwaliteit met een fasemicroscoop en pas de Dremel langer toe indien nodig om de chromosomen plat te maken. Plaats een tweede dekglas naast de eerste, vervolgens worden de dekglazen met een andere microscoop gesandwicht. Schuif vervolgens, wikkel de schuiVen met een plastic folie en met filterpapier, plaats de wikkelschuiven in een tang om de schuiVen tussen 85 en 120 inch pond te knijpen.
Nadat de chromosomen op alle zes de schuiVen zijn platgemaakt, wikkel je de schuiVen uit en verwijder je de extra schuiVen om de chromosomen verder plat te maken. Incubeer de schuiVen gedurende 10 tot 15 minuten bij 55 graden Celsius op een schuifdenaturatiehybridisatiesysteem. Doop vervolgens een schuif gedurende ten minste 15 seconden in vloeibare stikstof of totdat het borrelen is gestopt.
Verwijder vervolgens snel het dekglas met een scheermes en plaats de schuif onmiddellijk in koud 50% ethanol gedurende vijf minuten. Herhaal dit proces voor elke schuif achter elkaar. Dehydrateer de schuiVen in een 70% en 90% en een 100% ethanolbad.
Dompel ze onder in elk bad gedurende vijf minuten. Ten slotte, nadat de schuiVen zijn uitgedroogd, zijn ze klaar voor vis voor kleuring. Een geautomatiseerd apparaat voert de meeste stappen in de procedure uit, behalve het labelen van de proben. Dus voordat je het apparaat laadt, bereid je de fluorescente probe voor door back DNA te labelen met de fluorochroom met behulp van een commercieel NIC-translatieprotocol met de probe voorbereid, laad de schuiVen en reagentia in de geautomatiseerde schuiVen. Kleuringssysteem en programmeer het systeem om de volgende stappen uit te voeren. Eerst, lever 800 microliter van één XPBS gedurende 20 minuten.
Ten tweede, blaas de schuiVen droog. Ten derde, fixeer de schuiVen met 450 microliter van 4% formaline in één XPBS gedurende één minuut. Was vervolgens de schuiVen met 100% ethanol gedurende één seconde, tweemaal en gedurende twee minuten.
Na de ethanolbad, blaas de schuiVen opnieuw droog. Verwarm nu de schuiVen gedurende twee minuten op 45 graden Celsius om borrelen te voorkomen. Breng vervolgens 20 microliter van de DNA-probe aan, gevolgd door een druppel minerale olie en een dekglas volgende in de natuur, de chromosomen gedurende 10 minuten op 90 graden Celsius.
Stel vervolgens de schuiVen in om te hybridiseren gedurende 14 uur op 42 graden Celsius. Na de hybridisatie stel de strengheidswassen in gedurende twee minuten op 42 graden Celsius, gevolgd door vier opeenvolgende toepassingen van één seconde van twee XSSC en drogen. Breng vervolgens 800 microliter van 0,4 XSSC gedurende 10 minuten twee keer aan bij 42 graden Celsius, gevolgd door één extra was en twee XSSC bij 25 graden Celsius gedurende 10 minuten.
Breng nu de kleurstof 50 microliter yo-yo een aan gevolgd door minerale olie en dekglas. Incubeer de schuiVen gedurende 10 minuten op 25 graden Celsius. Verwijder vervolgens de dekglas.
Was schuiVen in twee XSSC vier keer gedurende één seconde per was en blaas de schuiVen droog. Breng vervolgens 15 microliter van de verlengde goud anti-fade reagens op elke schuif aan en bevestig nieuwe dekglas. Zet het Accord plus geautomatiseerde scansyst
Overzicht
Deze studie presenteert een high-throughput protocol voor het mappen van DNA-probes op polytene chromosomen van muggen. Door gebruik te maken van chromosoompreparatie onder hoge druk en geautomatiseerde imagingtechnieken, verhoogt de methode de efficiëntie en consistentie van de ontwikkeling van fysieke kaarten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genomics
- Chromosoommapping
- Fluorescentie in situ hybridisatie
Achtergrond
- Genoomassemblages uit DNA-sequencing zijn vaak gefragmenteerd.
- Fysieke chromosoomkaarten kunnen de kwaliteit van genoomassemblages verbeteren.
- Innovatieve technieken kunnen de doorvoer bij fysieke mapping verhogen.
- Geautomatiseerde systemen kunnen de handmatige tijd bij laboratoriumprocedures verminderen.
Doel van de studie
- Om een high-throughput protocol te ontwikkelen voor chromosoommapping.
- Om de effectiviteit van geautomatiseerde beeldvorming aan te tonen bij de ontwikkeling van fysieke kaarten.
- Om de consistentie van de resultaten te verbeteren in vergelijking met traditionele methoden.
Gebruikte methoden
- Chromosoompreparatie onder hoge druk vanuit eierstokken van muggen.
- Labeling van fluorescente probes met behulp van het Nick-translatieprotocol.
- Geautomatiseerde fluorescentie in situ hybridisatie.
- Geautomatiseerde beeldvorming voor chromosoomlokalisatie.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol levert consistente en hoogwaardige chromosoompreparaten op.
- Geautomatiseerde systemen verminderen de benodigde tijd voor fysieke mapping aanzienlijk.
- De afbeeldingen tonen effectief de lokalisatie van fluorescentielabelled DNA-probes.
- De methode verhoogt de doorvoer in vergelijking met handmatige protocollen.
Conclusies
- Dit high-throughput protocol vormt een aanzienlijke vooruitgang in chromosoommapping.
- Automatisering verbetert de efficiëntie en consistentie bij fysieke mapping.
- De gedemonstreerde technieken kunnen worden toegepast op andere genomische studies.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Physical chromosoommapping met een hoge doorvoersnelheid pakt een kritiek knelpunt in de kwaliteit van genoomassemblage aan, wat een directe impact heeft op downstream genomische analyses en evolutionaire studies. Door een snelle, consistente lokalisatie van DNA-probes mogelijk te maken, ondersteunt deze aanpak het verminderen van risico's bij targetvalidatie en verbetert het het voorspellende vertrouwen in workflows voor vergelijkende genomica. De integratie van automatisering vermindert de handmatige werktijd en verhoogt de reproduceerbaarheid, waardoor de methode wordt gepositioneerd als een schaalbare capaciteit voor grootschalige sequenteringsprojecten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de genomische architectuur mogelijk en verduidelijkt de genlokalisatie in relatie tot fenotypische kenmerken.
- Operationele waarde: Vermindert ambiguïteit bij genannotatie door contigs toe te wijzen aan specifieke chromosomale locaties.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanische risicoreductie door het vertrouwen in de inferentie van genfuncties te vergroten via nauwkeurige fysieke mapping.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde chromosoompreparaten met een hoge resolutie die geschikt zijn voor reproduceerbare FISH-gebaseerde assays.
- Operationele waarde: Geautomatiseerde kleurings- en beeldvormingssystemen verhogen de doorvoer en verminderen de variabiliteit bij de detectie van probe-lokalisatie.
- Assay-gereedheid: Genereert kwantificeerbare ruimtelijke output die vergelijkingen tussen genetische varianten of experimentele condities mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Faciliteert evolutionaire analyse en fylogenetische reconstructie door oriëntatie en locatie toe te wijzen aan sequencing-contigs.
- Relevantie voor Preklinische Modellen: Ondersteunt studies naar vectorcompetentie door vergelijkende genomica mogelijk te maken tussen ziekte-overdragende en niet-overdragende soorten.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Verbetert de kwaliteit van genoomannotatie, waardoor het aantal fout-positieven in pipelines voor targetidentificatie wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van vroege genoomsequencing via annotatie en comparatieve analyse, in het bijzonder wanneer een fysieke kaartresolutie nodig is om gaten in de assemblage of foutieve assemblages op te lossen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot genvolgorde, syntenie en chromosomale evolutie in ziekterelevante modellen.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde, geautomatiseerde FISH-workflows mogelijk voor high-throughput probe-validatie en lokalisatiescreening.
- Analytics: Genereert ruimtelijke en op intensiteit gebaseerde read-outs die een kwantitatieve vergelijking van probe-binding tussen chromosomen of monsters mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt fysieke mapping met evolutionaire gevolgtrekking en biomarker-ontdekking in vergelijkende genomische studies.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar, geautomatiseerd platform voor fysieke mapping dat toepasbaar is over meerdere soorten en projecten.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in genannotatie en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de interpretatie van genomische gegevens.
- Operationele waarde: Biedt standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door automatisering van de kleurings-, hybridisatie- en beeldvormingsstappen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij targetselectie door de betrouwbaarheid van de genoomassemblage te verhogen en biologische vals-positieven te verminderen.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van genomische targets mogelijk door verbeterde assemblagekwaliteit en evolutionair inzicht.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in chromosoompreparatie, FISH-protocollen en geautomatiseerde beeldvormingssystemen.
- Afhankelijk van toegang tot instrumenten voor preparatie onder hoge druk, geautomatiseerde slide-kleurders en gemotoriseerde fluorescentiemicroscopen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor sonde-labeling, hybridisatiecondities en image-analyse-pipelines.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen kan optimalisatie van de chromosoomspreiding en denaturatiestappen vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van hoogwaardige polytene chromosomen en de geschiktheid primair voor dipteren-genomen met polytene stadia.
