Een kwantitatieve analyse Fitness Workflow

Het doel van deze procedure is om kwantitatieve microbiële kweekfitnesssen parallel op genoombreed niveau op een nauwkeurige en hoogdoorvoerige manier vast te leggen. Dit wordt bereikt door eerst een Turing-arraybibliotheek van microbiële kolonies in 96-well platen te maken en de kweek tot verzadiging te laten groeien. Vervolgens worden de verzadigde kweeks in water verdund en dan op vaste agarplaten gespot.

Vervolgens worden de vaste agarplaten periodiek gefotografeerd en tot verzadiging van de groei van de microbiële kolonie. Ten slotte worden de tijdsafhankelijke foto's van de groei van elke kweek omgezet in kwantitatieve maten van celdichtheid en worden de waargenomen groeicurven met groeimodellen en kwantitatieve maten van microbiële fitness samengevat. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die bewijs leveren voor genetische interacties door aan te tonen dat microbiële stammen verschillende fitnesssen hebben, hetzij wanneer ze worden gecombineerd met verschillende mutaties of onder verschillende omstandigheden worden gekweekt.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals high-density pinning-methoden zoals SGA of barcode-concurrentie-experimenten, is dat fitnessmetingen nauwkeuriger zijn. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van kankergeneesmiddelontwikkeling, zoals welke genen en processen belangrijk zijn in de respons op DNA-schade en celcycluscontrole, het begrijpen en vertalen van dergelijk onderzoek en basismicro-organismen in de vorm van potentiële geneesmiddeldoelen in menselijke kankercellen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de functie van telomeren en visi.

Het kan ook worden toegepast op andere gebieden van gistbiologie of inderdaad elk gebied waar fitnessfenotypen inzicht kunnen geven in microbiële biologie. We hopen dat QFA kan worden toegepast op veel andere microbiële organismen waarvoor arraybibliotheek bestaat. Bijvoorbeeld, povi e coli, orilla surplus Uitgaande van verzadigde overnachtkweeks tot 96 onafhankelijke giststammen in 200 microliter volumes van rijk vloeibaar medium.

In een 96-well cultuurschaal steriliseer een 96-pin, een achtste van een inch diameter handmatige replicaplaat door deze eerst in 100% ethanol te dompelen, vervolgens te flammen en te laten afkoelen array, 200 microliters steriel water in de putjes van een 96 Well-plaat vortex heeft verzadigde gistkweeks en verdun door de gesteriliseerde pintool drie keer in de stammen te dompelen. Dan eenmaal in de plaat met het water, steriliseer de pintool, en laat het afkoelen voordat u het drie keer in de verdunde kweeks dompelt. Breng vervolgens de pintle over naar een vaste agarplaat.

Na incubatie van de agarplaten, gebruik een s en p robotics SP imager om ze handmatig te beeld voor geautomatiseerde kweek. Begin met een rechthoekige array van onafhankelijke giststammen gekweekt op vaste agar. In dit voorbeeld zijn de startstammen het resultaat van het kruisen van een temperatuurgevoelige querymutatie met de gistdeletiecollectie.

1.536 kweeks die vier replica's van 384 onafhankelijke giststammen vertegenwoordigen, worden op SGA-platen gekweekt met behulp van een robot met een 96-pin, één millimeter pindiameter steriele pintool overbreng 384 van de 1.536 stammen in 4 96. Well-cultuurplaten die 200 microliters selectiemedium bevatten, groei de kweeks bij 20 graden Celsius tot verzadiging. Om de verzadigde gistkweeks te spot, begint u met het overbrengen naar een vloeistofrobot en Resus en ze op een magnetische shaker te suspenderen, verdun de kweeks tot ongeveer een op 70 door een steriele 96-pin robotpintool te gebruiken om in 200 microliters steriel water te dompelen.

Na het schoonmaken en steriliseren van de pintool, spot de verdunde kweeks op agarplaten. In 384-well formaat breng de platen over naar een temperatuurgecontroleerde bevochtigde incubator met een automatisch carrousel en toegangsluik. Om de kweeks te beeld, gebruik een robotachtige geautomatiseerde imager, die de platen herhaaldelijk uit de incubator verwijdert, de deksels verwijdert, ze overbrengt naar een uniform verlichte ruimte onder een 35 millimeter camera, en een beeld vastlegt op 5.184 bij 3.456.

Pixelresolutie vervangt het deksel, en brengt ze vervolgens terug naar de incubator carrousel om kweeklocaties op platen en toepassingen van behandelingen te volgen. Platen worden automatisch gebarcodet volgens de incubatornaam, temperatuur, unieke sequentiële batchnummer en positie in de incubator. Beelddennamen zijn een concatenering van de plaatnaam en tijdstempel en worden automatisch gegenereerd bij het vastleggen van het beeld.

Platen worden vaak ook handmatig gelabeld om ervoor te zorgen dat ze in dezelfde volgorde blijven bij het overbrengen tussen robotcarrousels. De metadatabestanden zijn tabgescheiden tekstbestanden, die handmatig worden gegenereerd. Het experimentele beschrijvingsbestand FT twee.

Tabel een is uniek voor elk experiment, maar de bibliotheekbeschrijving FT drie, tabel een kan uitgebreid worden hergebruikt. Eenmaal geconstrueerd, wordt het experiment beschreven in het experimentele beschrijvingsbestand FT twee, tabel een met kolommen voor barcode of automatisch gegenereerde plaatnaam, experimentstarttijdstempel, plaatbehandeling, inhoud van vast agarmedium, schermnaam, bibliotheekplaatnummer voor bibliotheken met meerdere platen, en een herhaald kwadrantnummer voor het opschalen van 1.536, well-formaat naar 384. Well formaat de e-stambibliotheek wordt beschreven met een bibliotheekbeschrijvingsbestand FT drie, tabel een met vermelding van het genotype dat in elke kweeklocatie is gekweekt.

In elke plaat van een bibliotheek bevat het kolommen vier, bibliotheeknaam, ORF, plaatnummer plaat, rijplaatkolom, en een optionele notitiekolom. Een optioneel standaardgennaambestand kan worden geleverd FT vier, tabel een dat de standaardgennaam beschrijft die geassocieerd is met elk systematisch ORFY-nummer, waarmee stammen worden geïdentificeerd die worden gescreend. Dit bestand bevat twee kolommen, ORF en gennaam voor het analyseren van de gegevens.

De QFA computationele workflow vereist toegang tot een redelijk krachtige multi-core computerwerkstation waarop is geïnstalleerd. De colonizer-beeldanalysesoftwaretool en het QFAR-pakket