Name: Een kwantitatieve analyse Fitness Workflow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Leer Quantitative Fitness Analysis (QFA) voor het schatten van microbiële fitness met behulp van geautomatiseerde beeldanalyse en computationele modellen. Deze methode ondersteunt genetische interactiestudies en drugontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We dankbaar erkennen alle leden van ons laboratorium en het Centrum voor Integrated System Biologie van Ageing and Nutrition (CISBAN) voor de ondersteuning en behulpzaam discussies. Deze studie werd ondersteund door biotechnologie en biologische wetenschappen Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) en de Wellcome Trust (075.294, 093.088).

<ol><li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362(2011).</li>
<li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li>
<li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonyzer%3A+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li>
<li>Colonyzer - Image analysis software [Internet]. , Newcastle University. Newcastle, UK. Available from:
 <a target="_blank" href="http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/">http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/</a> (2012).</li>
<li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>qfa - An R Package for Quantiative Fitness Analysis [Internet]. , University of Vienna. Vienna, Austria. Available from:
 <a target="_blank" href="http://qfa.r-forge.r-project.org/">http://qfa.r-forge.r-project.org/</a> (2012).</li>
<li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li>
<li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70%CE%94mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Dev%22%5BJournal%5D)">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70Δmutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li>
<li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li>
<li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li>
<li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864(2011).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li>
<li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+ecology%3A+The+social+side+of+wild+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

QFA is in vele opzichten een directe afstammeling van drie gevestigde bench-schaal microbiologische technieken: cultuur verdunningsreeks ter plekke testen 9, groeicurve bepaling in beluchte vloeistof, culturen 9 en replica plating 13. Deze drie methoden worden samengevat en vergeleken met QFA en high-throughput technieken in tabel 2. Overwegende dat de verdunningsreeks plek testen van een stam van de fitness te definiëren als het vermogen om kolonies in een reeks van culturen uitgegroeid van een scala aan inoculum verdunningen te vormen, om QFA maatregelen stam fitness door herhaalde waarnemingen van een enkele cultuur de bouw van een groeicurve. Het kwantificeren van fitness van een enkele cultuur kunnen veel meer stammen tegelijk worden onderzocht, onder identieke omstandigheden. Repliceren arrays van culturen maakt herhaalde testen van stam collecties, het meest nuttig bij het testen voor cultuur fitness verschillen in de verschillende omgevingen of genetische achtergronden. De QFA protocol gepresenteerdhier maakt gebruik van dure robot apparatuur te vermenigvuldigen, te enten, incubeer en beeld agar platen, geschikt voor het observeren van de groei van duizenden onafhankelijke culturen (robot QFA, tabel 2). Aangezien QFA gebaseerd op vaste, traditionele laboratoriumtechnieken kan ook worden uitgevoerd veel goedkoper te vervangen door robot bijstand handmatige stappen (handmatige QFA tabel 2). Handmatig QFA gaat replicatie en enten van culturen op agar platen met behulp van een handleiding pin gereedschap en handmatige overdracht van platen van en naar een incubator voor de fotografie. Dezelfde computationele analyse workflow kan worden toegepast om de groei curves van zowel experimenteel ontwerp te genereren. QFA fitness schattingen lijken relatief precies te zijn. In figuur 4 zijn de gemiddelde fitnesses vier clusters voorbeeld van functioneel verwante gendeleties gemarkeerd. De nabijheid van de leden van elke functioneel verwante gen klasse in twee onafhankelijkENT genetische achtergronden (ura3Δ en cdc13-1) geeft de reproduceerbaarheid van QFA fitness schattingen. Bijvoorbeeld, op slechts 3 gendeleties (op een totaal van 4300) te scheiden van de drie leden van de geconserveerde MRX complex. High-throughput alternatieven QFA voor het testen groeikarakteristieken van bacteriestammen omvatten SGA 5,6 concurrentie schermen barcode bibliotheken 11,12 en schermen vastleggen extinctie kinetiek spectrofotometrische plaat lezer 10 zijn samengevat in tabel 2 nader beschreven elders 8 . QFA en SGA platen, waar culturen groeien op vaste agar oppervlakken (agar based methoden, tabel 2) kunnen snel en eenvoudig worden verholpen door robot. Solid agar oppervlak culturen zijn goed belucht in de groei en de cellen kunnen groeien in vaste culturen, waardoor gezellige microben om te groeien in een gemeenschap 14. Intact gelaten, microbiële gemeenschappen eenffect eigen micro-omgevingen afscheidende toxinen zoals ethanol, en eventueel signalering tussen cellen. Echter, continu mengen van vloeibare culturen, die nodig zijn om voldoende beluchting te bereiken, kunstmatig verstoort microbiële gemeenschappen en hun micro-omgeving die van invloed kunnen hun manieren van groei. Kruisbesmetting is minder groot probleem in vaste agar methode, omdat er minder kans op spatten de uitvoering cellen tussen culturen. Mocht contaminatie optreden door buitenlandse lucht verspreide micro-organismen in vaste agar testen, kan het vaak worden gedetecteerd door visuele inspectie van vaste agarplaten en verantwoord of verwijderd. QFA doorvoer aanzienlijk hoger dan parallel vloeistof methoden op twee manieren. In de eerste plaats op de QFA (en SGA) platen, geënt culturen elkaar gepakt dichter, waardoor meer onafhankelijke culturen per plaat. In QFA zijn er doorgaans 308 culturen, niet meegerekend niet-experimentele edge culturen (figuur 1) comVergeleken met vloeibare kweken parallel met 96 of 100 culturen per plaat. Ten tweede kan QFA experimenten worden geschaald met een veel groter aantal platen. Hoewel het aantal platen geanalyseerd in een enkele QFA experiment wordt alleen beperkt door de beschikbare ruimte in een broedstoof of warme kamer, de minimum toegestane beeldregistratie frequentie en de maximaal haalbare vangen frequentie van het aantal platen in een vloeistof groei experiment sterk beperkt de capaciteit de plaatlezer (gewoonlijk een of twee platen) of van de stapelaar aan de plaatlezer (gewoonlijk 25 tot 50 platen). We hebben onlangs een volledig geautomatiseerde QFA experiment op 123 platen, elk met 308 experimentele culturen, het geven van 37.884 gelijktijdige culturen. We schatten dat het maximaal haalbare aantal onafhankelijke culturen groeien in vloeistof is 96 (culturen / plaat) x 50 (platen / stapelaar) = 4800, dat is ongeveer tien keer minder dan onze QFA doorvoer. Een alternatief voor vloeibare cultuur schermen is het gebruik van vele geautomatiseerde growth apparaten parallel (tabel 1 van het onderzoek van Blomberg 8), elk met een capaciteit van een of twee platen. Temperatuurregeling in elk apparaat onafhankelijk is, en dus voorwaarden zijn niet identiek, maar in de veronderstelling dat ze zijn, zouden deze workflow moet ten minste 190 dergelijke apparaten QFA doorvoer (ervan uitgaande dat 200 vloeibare culturen per apparaat) te passen. Samengevat QFA een hoogwaardige workflow, die kunnen worden toegepast kwantitatieve groei fenotypen verzamelen zowel kleinschalige gericht experimenten en hoog-schermen. Het is flexibel genoeg om effectief te worden toegepast met verschillende eisen voor de robot apparatuur. De computationele component van de QFA workflow is gebaseerd op de vrij beschikbare, open source code.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens / apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> 96 pins handleiding pintool met 1/8 &quot;diameter pinnen </td></tr><tr><td> Meng Mate </td><td> Eppendorf </td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td> Beckman </td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td> Thermo Scientific </td><td> 50095890 </td><td> Geïnstalleerd op Biomek FX </td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> BM3-SC </td><td> 192 plank draaiende carrousel </td></tr><tr><td> spImager </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> spImager </td><td> Hoge resolutie handleiding beeldvorming </td></tr><tr><td> spImager met Cytomop </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Gewoonte </td><td> Temperatuur gecontroleerd geautomatiseerde hoge resolutie imaging </td></tr><tr><td> Cytomat 6001 met warmtewisselaar </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51022222 </td><td> Gehecht aan spImager </td></tr><tr><td> Ecoline RE207 </td><td> Lauda </td><td> RE207 </td><td> Gehecht aan Cytomat </td></tr><tr><td> spImager met carrousel </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Gewoonte </td><td> Geautomatiseerde hoge resolutie imaging </td></tr><tr><td> Robot pin Gereedschapsopname voor FP12pins </td><td> V &amp; P Wetenschappelijk </td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 x FP12 pinnen </td><td> V &amp; P Wetenschappelijk </td><td> FP12 </td><td> 50,4 mm lang, 17 mm blootgesteld pin lengte </td></tr><tr><td> Docking Station voor Pin Tool </td><td> V &amp; P Wetenschappelijk </td><td> VP425 </td><td> Docking station basis verwijderd om fan drogen van pinnen mogelijk </td></tr><tr><td>Pin Reinigingsborstel </td><td> V &amp; P Wetenschappelijk </td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> Handmatig pin hulpmiddel </td></tr><tr><td> Nunc OmniTray met deksel </td><td> Nunc </td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 well steriele polystyreen platen </td><td> Greiner BioOne </td><td> 655161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 well steriele polystyreen deksels </td><td> Greiner BioOne </td><td> 656171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Specifieke reagentia en materialen.

een kwantitatieve analyse fitness workflow

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Kwantitatieve Fitness Analyse (QFA) is een experimentele en computationele workflow voor het vergelijken van fitnesses van microbiële culturen gekweekt in parallel 1,2,3,4. QFA kan worden toegepast op gerichte waarnemingen van enkele culturen, maar is vooral handig voor genoom-brede genetische interactie of drugs schermen onderzoeken tot duizenden onafhankelijke culturen. De centrale experimentele methode is de inenting van onafhankelijke, verdunde vloeibare microbiële culturen op vaste agar platen die worden geïncubeerd en regelmatig gefotografeerd. Foto van elk tijdstip van levensbeëindiging geanalyseerd, van kwantitatieve celdichtheid schattingen, die worden gebruikt om groeicurves bouwen, waardoor kwantitatieve geschiktheid maatregelen worden afgeleid. Cultuur fitnesses kan vergeleken worden met te kwantificeren en te rangschikken genetische interactie sterke of overgevoeligheid voor medicijnen. Het effect op de cultuur geschiktheid van eventuele behandelingen toegevoegd in de ondergrond agar (bijvoorbeeld kleine moleculen, antibiotica of voedingsstoffen) of toegepast op platen externely (bijvoorbeeld UV-straling, temperatuur) kan worden gekwantificeerd door QFA. De QFA workflow produceert groei schat analoog aan die verkregen door spectrofotometrische meting van parallelle vloeibare culturen in 96-wells of 200-wells plaat lezers. Belangrijk QFA heeft aanzienlijk hogere doorvoer vergeleken met deze methoden. QFA culturen groeien op een stevige agaroppervlak en daardoor goed belucht tijdens de groei zonder roeren of schudden. QFA doorvoer is niet zo hoog als die van sommige synthetische Genetische Array (SGA) screeningsmethoden 5,6. Echter, aangezien QFA culturen zijn sterk verdund alvorens te worden ingeënt op agar, kan QFA vastleggen completer groeicurves, met inbegrip van exponentiële en verzadiging fase 3. Bijvoorbeeld groeicurve waarnemingen kunnen cultuur verdubbelingstijden rechtstreeks worden bepaald met hoge precisie, zoals eerder besproken 1. Hier presenteren wij eenspecifieke QFA protocol toegepast op duizenden S. cerevisiae culturen die automatisch door robots behandeld tijdens de inoculatie, incubatie en beeldvorming. Elk van deze automatische stappen kunnen worden vervangen door een equivalente, handmatig procedure met een bijbehorende afname van de doorvoer en ook een geringer throughput hand protocol. Dezelfde QFA software tools kunnen worden toegepast op beelden die zijn vastgelegd in een van beide workflow. We hebben uitgebreide ervaring toe te passen QFA aan culturen van de gist S. cerevisiae, maar we verwachten dat QFA zal blijken ook nuttig voor de behandeling van culturen van de kernsplijting gist S. pombe en bacteriële culturen.

Kwantitatieve Fitness Analyse (QFA) is een complementaire reeks van experimentele en computationele methoden voor het schatten van microbiële cultuur fitnesses. QFA schat het effect van genetische mutaties, drugs of andere toegepaste behandelingen microbe groei. Experimenten scaling van gerichte analyse van de afzonderlijke culturen tot duizenden parallelle culturen kan worden ontworpen.

Een kwantitatieve analyse Fitness Workflow

Kwantitatieve fitnessanalyse (QFA) is een experimentele en computationele workflow voor het vergelijken van de fitness van microbiële culturen die parallel zijn gekweekt1,2,3,4. ...

Het doel van deze procedure is om kwantitatieve microbiële kweekfitnessen parallel op genoombrede schaal op een nauwkeurige en high-throughput manier vast te leggen. Dit wordt bereikt door eerst een array-bibliotheek van microbiële kolonies in 96-wells platen op te zetten en de kweek tot verzadiging te laten groeien. Vervolgens worden de verzadigde kweken verdund in water en daarna op vaste agaplaatjes gespot.Vervolgens worden de vaste agarplaten periodiek gefotografeerd totdat de groei van de microbiële kolonie is verzadigd. Ten slotte worden de tijdreeksfoto's van de groei van elke cultuur omgezet in kwantitatieve maten van de celdichtheid, en worden de waargenomen groeicurves samen met groeimodellen en kwantitatieve maten van de microbiële fitness samengevat. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die bewijs leveren voor genetische interacties door aan te tonen dat microbiële stammen verschillende fitnesses vertonen, hetzij wanneer ze worden gecombineerd met verschillende mutaties, of wanneer ze onder verschillende condities worden gekweekt.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals methoden voor pinning met een hoge dichtheid zoals SGA of barcode-competitie-experimenten, is dat fitnessmetingen nauwkeuriger zijn. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de ontwikkeling van kankermedicijnen, zoals welke genen en processen belangrijk zijn bij de respons op DNA-schade en celcycluscontrole, en het begrijpen en vertalen van dergelijk onderzoek naar basismicroorganismen in de vorm van potentiële drugstargets in menselijke kankercellen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in telomeerfunctie en visi.Het kan ook worden toegepast op andere gebieden binnen de gistbiologie of op elk gebied waar fitnessfenotypes inzicht kunnen bieden in de microbiële biologie. We hopen dat QFA kan worden toegepast op veel andere microbiële organismen waarvoor array-bibliotheken bestaan. Bijvoorbeeld, povi e coli, orilla surplus. Beginnend met verzadigde overnight-culturen werden tot 96 onafhankelijke giststammen uitgeplaat in volumes van 200 µL rijk vloeibaar medium.Steriliseer in een 96-well kweekplaat een handmatige replica-plater met 96 pinnen en een diameter van een achtste inch door deze eerst in 100% ethanol te dopen, vervolgens te vlammen en te laten afkoelen. Breng 200 µL steriel water aan in de wells van een 96-well plaat. Vortex de verzadigde gistculturen en verdun deze door de gesteriliseerde pin-tool drie keer in de stammen te dopen. Doop de tool vervolgens één keer in de plaat met water. Steriliseer de pin-tool opnieuw en laat deze afkoelen voordat u deze drie keer in de verdunde culturen doopt. Draag de pinnen vervolgens over naar een vaste agarplaat.Gebruik na incubatie van de agarplaten een s and p robotics SP imager om deze handmatig te fotograferen voor geautomatiseerde cultuur. Begin met een rechthoekig raster van onafhankelijke giststammen die zijn gegroeid op vaste agar. In dit voorbeeld zijn de startstammen het resultaat van een kruising tussen een temperatuurgevoelige query-mutatie en de yeast deletion collection.1.536 culturen, die vier replica's van 384 onafhankelijke giststammen vertegenwoordigen, worden gekweekt op SGA-platen met behulp van een robot met een steriel 96-pins instrument met een pin diameter van één millimeter. Draag 384 van de 1.536 stammen over naar 4 culturenplaten van 96 wells die 200 µL selectief medium bevatten en kweek de culturen bij 20 °C tot verzadiging. Om de verzadigde gistculturen te spotten, begint u met het overbrengen ervan naar een liquid-handling robot en het resuspenderen op een magnetische schudplaat. Verdun de culturen tot ongeveer 1:70 door met een steriel robotisch 96-pins instrument te pinnen in 200 µL steriel water.Spot na het reinigen en steriliseren van het pin-instrument de verdunde culturen op agarplaten. Breng de platen in een 384-well formaat over naar een temperatuurgecontroleerde, bevochtigde incubator met een automatische carrousel en toegangsluik. Gebruik voor het afbeelden van de culturen een robotische automatische imager, die de platen herhaaldelijk uit de incubator haalt, de deksels verwijdert, ze overbrengt naar een uniform verlichte ruimte onder een 35 millimeter camera en een afbeelding vastlegt met een resolutie van 5.184 bij 3.456.Pixel resolution plaatst het deksel terug en zet de platen vervolgens terug in het carrousel van de incubator om de locaties van de culturen op de platen en de toegepaste behandelingen bij te houden. Platen worden automatisch voorzien van een streepjescode op basis van de naam van de incubator, de temperatuur, een uniek opeenvolgend batchnummer en de positie in de incubator. De namen van de afbeeldingen zijn een samenvoeging van de plaatnaam en het tijdstip en worden automatisch gegenereerd bij het vastleggen van de afbeelding.Platen worden vaak ook handmatig gelabeld om er zeker van te zijn dat ze in dezelfde volgorde blijven bij het overbrengen tussen robotcarrousels. De metadatabestanden zijn tabgescheiden tekstbestanden, die handmatig worden gegenereerd. Het bestand met de experimentele beschrijving FT twee.Tabel één is uniek voor elk experiment, maar de bibliotheekbeschrijving FT drie, tabel één kan uitgebreid worden hergebruikt. Eenmaal geconstrueerd, wordt het experiment beschreven in het bestand met de experimentele beschrijving FT twee tabel één, dat kolommen bevat voor de barcode of automatisch gegenereerde plaatnaam, het starttijdstip van het experiment, de plaatbehandeling, de inhoud van het vaste agarmedium, de schermnaam, het bibliotheekplaatnummer voor bibliotheken met meerdere platen, en een herhalingskwadrantnummer voor het schalen van een 1.536-well formaat naar een 384-well formaat. De e-stammenbibliotheek wordt beschreven met een bibliotheekbeschrijvingsbestand FT drie, tabel één, waarin het genotype wordt vermeld dat in elke cultuurlocatie is gekweekt.Elke plaat in een bibliotheek bevat vier kolommen: bibliotheeknaam, ORF, plaatnummer, rij en kolom van de plaat, en een optionele kolom voor opmerkingen. Een optioneel bestand met standaard gennamen kan worden verstrekt (tabel 1), waarin de standaard gennaam wordt beschreven die geassocieerd is met elk systematisch ORF-nummer, ter identificatie van de gescreende stammen. Voor de analyse van de gegevens bevat dit bestand twee kolommen: ORF en gennaam.De computationele workflow voor QFA vereist toegang tot een redelijk krachtig multi-core computerworkstation waarop de software is geïnstalleerd. De softwaretool Colonizer voor beeldanalyse en het QFAR-pakket, die beide online gedocumenteerd zijn, zijn gratis beschikbaar en werken op diverse besturingssystemen. Voer Colonizer uit met elke vastgelegde plaatafbeelding als input, waarbij één Colonizer-outputbestand (FT five, tabel 1) per vastgelegde afbeelding wordt gegenereerd. De Colonizer-outputbestanden specificeren schattingen van de culturedichtheid, het cultuuroppervlak, de vorm en de kleur.Voor elk van de 384 locaties op de beeldplaat wordt een outputbestandsnaam automatisch gekopieerd van de bestandsnaam van het bronbeeld. Het QFAR-pakket bevat functies om tijdreeksen voor elke cultuur te selecteren om gegeneraliseerde logistische populatiemodellen op waarnemingen aan te passen en te plotten. Zie voorbeelden in figuur twee en drie.De gefitte parameterwaarden worden weggeschreven naar QFA-logistische parameterbestanden. Het QFAR-pakket bevat tevens functies voor kwaliteitscontrole. Randkolonies worden verworpen vanwege de grotere beschikbaarheid van voedingsstoffen aan de randen van de plaat en moeilijkheden bij de beeldanalyse.Kweken nabij de wanden van de plaat, kweken die niet voldeden aan de SGA en genotypen die koppeling vertoonden met screenspecifieke markergenen worden uit de analyse verwijderd. Voor elke kweek worden verschillende kwantitatieve fitnessmaten afgeleid uit parameters van het logistische populatiemodel. Deze omvatten de maximale populatieverdubbelingssnelheden en het aantal delingen van inoculatie tot verzadiging voor elke set van herhaalde kweken en voor elke definitie van fitness.Verschillende samenvattende statistieken van de fitnessschattingen worden berekend: de gemiddelde en mediane fitness, de standaardafwijking van de fitness en het aantal waargenomen replica's. De samenvattende statistieken worden geëxporteerd naar QFA-fitnesssamenvattingsbestanden FT acht, tabel 1 voor verdere analyse. Voorbeelden hiervan zijn berekeningen van genetische interactiescores FT negen tabel 1.Deze figuur toont één typische groeicurve op een logaritmische schaal uit 384 QFA. Culturen die groeien bij 20 °C op vaste agar, zoals gekwantificeerd door colonizer, waarbij een toename in celdichtheid voor het eerst detecteerbaar is na ongeveer twee dagen. Deze vertraging is waarschijnlijk een gecombineerd effect van een lag-fase van de cultuur na inoculatie op een vast medium en een lagere detectielimiet voor celdichtheid.Hier zijn 308 vergelijkbare groeicurves vastgelegd van één enkele plaat. Let erop dat stammen die een vlakke lijn produceerden, zeer ziek of dood waren. Deze figuur toont de vergelijking van twee genoombrede QFA-screens om genetische interactiesterktes af te leiden.Het QFAR-pakket bevat ook functies om de voorgaande groeicurve-figuur te genereren en om gerangschikte lijsten van onderzochte genotypen en schattingen van de sterkte van de genetische interactie uit te voeren. Samen met een Q-waarde voor de significantie van de waargenomen GIS kan, zodra men de methode beheerst, een volledig genoombreed QF.A-experiment met vier replica's binnen drie weken worden voltooid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om georganiseerd te blijven bij het bijhouden en benoemen van alle platen en afbeeldingen.Alle platen moeten worden geïnoculeerd en in de juiste oriëntatie en volgorde worden gespot. De data-analyse is afhankelijk van de correctheid van de aanvullende tekstbestanden die door de experimenteel wetenschapper zijn opgesteld. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de fitness van duizenden onafhankelijke microbiële culturen kan worden geschat.De fitness wordt geschat door herhaaldelijk foto's te maken van gespotte culturen die groeien op vaste agarplaten, waarbij de vastgelegde beelden worden omgezet in schattingen van de celdichtheid en groeicurves worden gegenereerd. Mathematische modellering van groeicurves levert kwantitatieve fitnessschattingen op, die vervolgens kunnen worden gebruikt om functionele relaties tussen genproducten op genoombrede schaal af te leiden.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We presenteren een protocol voor de functionele beoordeling van de uitgebreide single-site verzadigingsmutagenese bibliotheken van eiwitten met behulp van high-throughput sequencing. Belangrijk is dat deze aanpak maakt gebruik van orthogonale primer paren bibliotheek bouw en sequencing multiplexen. Representatieve resultaten met behulp van TEM-1 β-lactamase gekozen klinisch relevante dosering van ampicilline wordt verschaft.

Een protocol voor Functionele Evaluatie van Whole-Protein verzadigingsmutagenese Bibliotheken Met behulp van High-throughput sequencing

Een efficiënte en eenvoudige methode voor het computer-gebaseerde analyse van nematode zwemmen gedrag in de vloeistof wordt beschreven. De methode vereist weinig tot geen investering voor C. elegans laboratoria. De gebruikte hardware is standaard, en de computer software voor de gedragsanalyse (celest) is een open source is.

Geautomatiseerde analyse van<em&gt; C. elegans</em&gt; Swim Gedrag Met behulp van Celest Software

Deze moleculair gebaseerde aanpak voor het bepalen van bacteriële fitness vergemakkelijkt nauwkeurige en nauwkeurige detectie van micro-organismen met behulp van unieke genomische DNA-barcodes die worden gekwantificeerd via digitale PCR. Het protocol beschrijft de berekening van de concurrerende index voor salmonella stammen; de technologie is echter gemakkelijk aan te passen aan protocollen die absolute kwantificering van enig genetisch-smeedbaar organisme vereisen.

Digitale PCR-gebaseerde competitieve index voor high-throughput analyse van de geschiktheid in salmonella

Het evolver Framework maakt een continue microbiële cultuur met hoge resolutie en dynamische controle over experimentele parameters mogelijk. Dit protocol laat zien hoe het systeem toe te passen om een complex fitness-experiment, begeleiden gebruikers op de programmering geautomatiseerde controle over vele individuele culturen, meten, verzamelen en interactie met experimentele gegevens in real-time.

Het ontwerpen van geautomatiseerde, high-throughput, continue celgroei experimenten met behulp van evolver

Dit protocol beschrijft hoe het Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) kan worden gehandhaafd door de dagelijkse overdrachten en periodieke bevriezingen uit te voeren en hoe wedstrijdtests kunnen worden uitgevoerd om fitnessverbeteringen in geëvolueerde bacteriën te meten. Deze procedures kunnen dienen als een sjabloon voor onderzoekers die hun eigen microbiële evolutie-experimenten starten.

Dagelijkse overdrachten, archivering van populaties en het meten van fitness in het langetermijnevolutie-experiment met Escherichia coli

Hier introduceren we een protocol voor het converteren van transcriptomische gegevens naar een mqTrans-weergave, waardoor de identificatie van donkere biomarkers mogelijk wordt. Hoewel deze biomarkers niet differentieel tot expressie worden gebracht in conventionele transcriptomische analyses, vertonen ze differentiële expressie in de mqTrans-weergave. De aanpak dient als een aanvullende techniek op traditionele methoden en onthult eerder over het hoofd geziene biomarkers.

Genereren van de transcriptionele regulatieweergave van transcriptomische kenmerken voor voorspellingstaak en detectie van donkere biomarkers op kleine datasets

We presenteren een flexibele, uitbreidbare Jupyter-lab-gebaseerde workflow voor de niet-gesuperviseerde analyse van complexe multi-omics-datasets die verschillende voorverwerkingsstappen, schatting van het multi-omics-factoranalysemodel en verschillende stroomafwaartse analyses combineert.

Toepassing van ongecontroleerde multi-omische factoranalyse om patronen van variatie en moleculaire processen die verband houden met hart- en vaatziekten bloot te leggen

Draagbare technologie heeft lage kosten en biedt gemakkelijke monitoring van fysiologische gegevens. De nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van deze apparaten vereisen echter een zorgvuldige beoordeling om hun effectiviteit en veiligheid voor gebruikers te garanderen. Dit rapport beschrijft het validatieproces van een commerciële smartwatch bij het monitoren van fysiologische gegevens en fysieke activiteit.

Beoordeling van de nauwkeurigheid van fitness-smartwatchgegevens voor het monitoren van cardiovasculaire en fysieke activiteit: een validatieonderzoek naar digitale gezondheid

Xenopus embryonale epitheel is een ideaal modelsysteem om cel gedrag, zoals polariteit ontwikkeling en vorm veranderen tijdens epitheliale morfogenese bestuderen. Traditionele histologie van vaste monsters wordt in toenemende mate aangevuld door live-cell imaging confocale. Hier laten we zien methoden om de kikker weefsel te isoleren en te visualiseren live-epitheliale cellen en hun cytoskelet met behulp van live-cell confocale microscopie.

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Leer Quantitative Fitness Analysis (QFA) voor het schatten van microbiële fitness met behulp van geautomatiseerde beeldanalyse en computationele modellen. Deze methode ondersteunt genetische interactiestudies en drugontwikkeling.

Een kwantitatieve analyse Fitness Workflow

Meer video's verkennen