Aanpassing van Aspergillus niger Morfologie door toevoeging van talk micro-deeltjes

Deze methode genereert en karakteriseert microdeeltjesafhankelijke morfologische structuren van filamenteuze schimmel, aspergillus, Niger, om schimmelmorfologie te correleren met productiviteit. Kweek acht Niger met of zonder microdeeltjes in een geroerde tank van drie liter, bioreactor gedurende 72 uur om de specifieke productiviteit te berekenen. Neem op gedefinieerde tijdstippen monsters en bepaal biomassa, droge stof en veto fructo sase-activiteit.

Na 72 uur onderzoekt u de schimmelmorfologie door middel van microscopie en karakteriseert u deze door digitale beeldanalyse. Combineer vervolgens relevante parameters van beeldanalyse tot een morfologienummer dat wiskundig gecorreleerd is met de specifieke productiviteit. Uiteindelijk kan deze methode de morfologie van aspergillus Niger nauwkeurig genereren en volledig karakteriseren voor een beter begrip van de morfogenese van filamenteuze micro-organismen.

Aspergillus Nigel is al vele decennia een belangrijk industrieel werkpaard in de biotechnologie. Een van de meest intrigerende en vaak oncontroleerbare kenmerken van aspers, Nigel en verwante soorten is hun complexe morfologie, variërend van dichte sferische korrels tot viskeuze mycelia, afhankelijk van de kweekomstandigheden. Het grote voordeel van onze procedure is dat we door het toevoegen van microdeeltjes nu de schimmelmorfologie specifiek kunnen afstemmen op de behoeften van het proces.

Tot nu toe is er geen andere methode beschreven voor een dergelijke aanpassing van schimmelmorfologie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken over de kweek van filamenteuze micro-organismen. Omdat het voor industriële toepassingen cruciaal is om schimmelmorfologie te beheersen en ook om onderscheid te maken tussen een goed en een slecht producerende schimmelmorfologie.

Ons protocol biedt de middelen voor wenselijke aanpassing en karakterisering van schimmelmorfologie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de morfologie van aspergillus Nigel, kan deze ook worden toegepast op andere filamenteuze micro-organismen zoals penicillium of strepto-stammen. Stel vier bioreactoren op voor steriele culturen zoals beschreven in het bijbehorende protocol.

Tekst gebaseerd op Toevoeging van microdeeltjes, kweek aspergillus Niger met verschillende morfologie. Na 72 uur brengt u 50 milliliter over. Cultuurvloeistofmonsters in een Falcon-buis.

Biomassamonsters moeten worden genomen in ieder geval in duplicaat na het drogen in de droogkast, weeg een cellulosefilter met de microschalen. Plaats het filter in een Büchner-trechter met een aangesloten waterstraalvacuümpomp. Filter 10 milliliter monster gevolgd door 10 milliliter. Gedeïoniseerd water om mediumverbindingen van de biomassa te verwijderen, kreuk de filter eenmaal in het midden.

Plaats het in een glazen petrischaal en in een compartimentdroger tot gewichtsconstantie. Breng het filter over in een droogkast en laat het afkoelen. Meet vervolgens het gewicht.

Bereken het droge gewicht van de biomassa per liter door berekening van het gewicht, verschil van filters en vervolgens delen door het monstervolume voor de glucose-oxidase en peroxidase-enzymassays. Bewaar monsters op ijs met behulp van een spuitpassage, 1,5 milliliter. Cultuursuspensie door een celluloseacetaatfilter in een reactiebuis Voert de beta-fructo SASE-assay uit.

Zorg voor succes met twee drievoud monsters voor statistische robuustheid. Om de assay te starten, voegt u 20 microliter monster toe aan het testbuisje om te controleren op de pH en temperatuur afhankelijke splitsing van sucrose in glucose, gebruik 20 microliter gedeïoniseerd water in plaats van 20 microliter monster. Bereid ook voor elk monster een negatieve controle voor restglucose in het kweekmedium door middel van assay.

20 microliter verwarmd geïnactiveerd monster Om de reactie van sucrose naar glucose te initiëren, voegt u 200 microliter van een 1,65 molaire sucrose-oplossing toe. Bij pH 5,4 tot 20 microliter monster, incubeer alle reactiebuisjes in een verwarmingsblok van 40 graden Celsius gedurende 20 minuten. Stop de reactie door te verwarmen bij 95 graden Celsius gedurende 10 minuten na afkoeling van de buisjes op ijs.

Centrifugeer monsters indien nodig, verdun monsters voor de assay zodat de gemeten absorptie in het gekalibreerde waardegebied ligt. Voeg nu voor elke reactie twee microliter monster toe aan een microtiterplaat. Voer monstermetingen in drievoud uit.

Bereid ook een standaardcurve voor 10 glucose-oplossingen voor variërend van een millimolair tot 15 millimolair. Gebruik voor de nulpuntskalibratie twee microliter gedeïoniseerd water. Voeg vervolgens 200 microliter van de reagentioplossing toe aan elk.

Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur. Meet de absorptie bij 450 nanometer met behulp van een 96-well sunrise Microplate reader en de Magellan data retrieval software. Open de resultatengrafiek met een spreadsheet en construeer een standaardcurve-kalibratielijn.

Bereken de activiteit voor elk monster. Bereken vervolgens de beta-fructo tase-activiteit door de waarden van de juiste negatieve controle af te trekken van de monsteractiviteit. Bereken ten slotte de specifieke productiviteit door het droge gewicht van de biomassa en de beta-fructo sase-activiteit in te vullen.

Plaats drie milliliter cultuursuspensie in een plastic petrischaal en verdun met fysiologische natriumchloride-oplossing om morfologische structuren te scheiden. De kwaliteit van de microscopische foto's is van uitzonderlijk belang. Voor de daaropvolgende beeldanalyse moet er tijdens de verdunningsstap zorgvuldig worden omgegaan.

Plaats de petrischaal onder een microscoop met een geïntegreerde camera. Verwerf en sla ongeveer 100 afbeeldingen van morfologische structuren per monster op, waarbij ervoor wordt gezorgd dat op elke afbeelding ten minste één object volledig is afgebeeld. Ga op dezelfde manier verder met schalen met monsters van verschillende reactoren, waarbij elke keer nieuwe afbeeldingen worden verworven.

Let op de verschillende morfologische groeivormen van monsters van verschillende reactoren die zijn gekweekt met verschillende hoeveelheden toegevoegd talkpoeder. Open vervolgens alle afbeeldingen van hetzelfde monster in het beeldverwerkingsprogramma. Image J.Gebruik het procesgereed