Name: Aanpassing van Aspergillus niger Morfologie door toevoeging van talk micro-deeltjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Leer hoe u de morfologie van Aspergillus niger aanpast met talk micro-deeltjes in bioreactoren. Deze methode correleert schimmelmorfologie met productiviteit via digitale beeldanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zeer erkentelijk voor de financiële steun van de Duitse Research Foundation (DFG) door de gezamenlijke onderzoekscentrum SFB 578 &quot;Van gen tot Product&quot; aan de Technische Universität Braunschweig, Duitsland.

1. Reactor Setup en start van de teelt 4 bioreactor teelten in totaal worden uitgevoerd. <ol><li> Een 3 L geroerde tank bioreactor met een werkvolume van 2,2 L voor de teelt van A. niger SKAn1015. </li><li> Giet 72,6 g glucose monohydraat in de reactor en vul het op met 1,9 L gedeïoniseerd water. </li><li> Installeer de reactor apparatuur zoals 3 schotten, een twee zes-bladige schijf turbine waaier, een pH-elektrode, een gas inlaat met lucht filter, een koel-vinger, een uitlaat luchtkoeler met lucht filter, een dompelbuis voor steriele bemonstering met luchtfilter en de inlaat slangen voor medium, inoculum, zuren en basen. </li><li> Autoclave de reactor bij 121 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Sluit de reactor met het zuur-base reservoir (2 M HCl, 2 M NaOH) en de overeenkomstige pompen en het opzetten van een pH-waarde van 5,0 ± 0,05 met pH regeling. </li><li> Link de reactor met het koelwater systeem en zet de verwarmingsmantelin het reactorvat. </li><li> Installeer de temperatuursensor met bijbehorende controle-eenheid en tot een temperatuur van 37 ingesteld ± 0,1 ° C bij de temperatuur regeling. </li><li> Plaats de agitatie motor op de hoogte van de reactor en breng het in gebruik met een agitatie snelheid van 200 min -1. </li><li> Voeg de steriele minimale groeimedium 11 door een van de steriele toevoerslangen (250 ml). Voor gemiddelde bereiding alle componenten waren autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min en gemengd. Drie teelten componenten omvatten talkpoeder (3MgO • 4SiO 2 • H 2 O) in concentraties van 1 g / L (reactor 2), 3 g / L (reactor 3) en 10 g / L (reactor 4). Voor gebruik van de micro-deeltjes opnieuw in suspensie in 50 mM natriumacetaat buffer (pH 6,5) en de steriele medium toevoegen. In controlekweken (zonder deeltjes) vervangen micro deeltjes suspensie met 50 mM natriumacetaat buffer (pH 6,5). </li><li> Voeg de sporensuspensie (aantal kiemen) eens bereid Wucherpfennig et. al (2011) 11 door een van de steriele toevoerslangen (50 ml), zodat de concentratie van sporen bedraagt ​​1X10 ml 6 -1. De enting markeert het begin van de teelt (h = 0 h). </li><li> Start de beluchting met een snelheid van 1,0 L min -1. </li></ol> 2. Steriele Sampling na 24, 48 en 72 uur van de teelt <ol><li> Neem 50 ml steriele cultuur bouillon in een flacon buis. </li><li> Gebruik monster voor het bepalen van biomassa droog gewicht, β-fructofuranosidase activiteit en microscopische analyse. </li></ol> 3. Bepaling van de Biomassa Gewicht na 24, 48 en 72 uur van de teelt <ol><li> Biomassa monsters worden genomen ten minste in tweevoud. </li><li> Gewicht een cellulose filter met een microschaal na drogen in een exsiccator en plaats filter in een Büchner trechter aangesloten waterstraal vacuümpomp. </li><li> Filtreer een bepaald monster volume (bv. 10 ml) eennd Spoel het filter met 10 ml gedeïoniseerd water tot medium verbindingen te verwijderen uit de biomassa. </li><li> Rimpel het filter een keer in het midden, plaats hem in een glazen petrischaal en zet hem in een ruimte droger tot gewicht standvastigheid (minimaal 24 uur). </li><li> Koel het filter in een exsiccator en meet het gewicht. </li><li> Bereken de biomassa droge als het verschil tussen het gewicht van het filter met en zonder droge biomassa gedeeld door de gebruikte monstervolume. </li></ol> 4. Bepaling van de extracellulaire enzymatische activiteit van β-fructofuranosidase door GOD / POD-essay na 24, 48 en 72 uur van de teelt Bewaar de monsters op het ijs voortdurend tijdens het werken met hen. <ol><li> Filter 1,5 ml cultuur suspensie via een celluloseacetaat filter door de kweek suspensie met een injectiespuit door het filter in een reactiebuis. Bewaar de reactiebuis bij -20 ° C tot gebruik. </li><li> Voor het reactiemengsel gebruik 20il monster en voeg 200 ul 1,65 M sucrose opgelost in 0,05 M fosfaatbuffer (pH 5,4) de reactie van sucrose met glucose leiden. Cary de reactie ten minste in duplo. </li><li> Incubeer het reactiemengsel bij 40 ° C gedurende 20 min in een verwarmingsblok. Stop de reactie incuberen bij 95 ° C gedurende 10 min in een verwarmingsblok. Koel het reactiemengsel door slaan op ijs en draaien beneden het gecondenseerde water door centrifugeren bij 13.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Om de pH en temperatuur afhankelijke splitsing van sucrose aan glucose rekeningnummer verrichten blanco met 20 pi gedeïoniseerd water in plaats van 20 pi monster. </li><li> Om rekening te houden resterende glucose in de cultuur bouillon, het uitvoeren van een negatieve controle voor elk monster. Daartoe gebruik 20 pi van het monster en inactiveren β-fructofuranosidase door verwarming bij 95 ° C gedurende 10 min voorafgaand aan de sucrose voegen en incubeer zoals beschreven in stap 4.3. </li><li> Verdun de monsters zodanig dat de volgende maatrefigureerde adsorptie in de gekalibreerde waardebereik. </li><li> Voer alle enzymatische assays in drievoud. Breng 2 pl verdunde monster in een micro-titer plaat goed. Breng een standaard assortiment voor de kalibratie van de micro-titer plaat door elk met 2 pl van tien glucose-oplossingen met tien verschillende kennis-concentraties (van 1 mm tot 15 mm) in plaats van 2 pl monster. Voor nulpunt kalibratie gebruik maken van 2 pl gedeïoniseerd water in plaats van 2 pl monster. </li><li> Voeg 200 pi van het reagens oplossing in elk putje met een multi pipet. </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Bewaar de micro-titer plaat op 6 ° C tot meting (een paar uur bij de meeste). </li><li> Meet de absorptie bij 450 nm met behulp van een 96-wells plaat Sunrise micro-lezer en de Magellan data retrieval software. Stel de mengtijd tot 5 sec. en de rest periode tot 1 sec. </li><li> Open het resultaat grafiek met een spreadsheet en de bouw van een ijklijn met behulp van de standaard assortiment: glucose concentratie = a X + b absorptie </li><li> Bereken de activiteit: activiteit = (absorptie X verdunningsfactor-lege waarde) X a + b </li><li> Figuur uit de β-fructofuranosidase activiteit door het verschil te berekenen tussen de activiteiten van het monster en de juiste negatieve controle. </li><li> Bereken de specifieke productiviteit voor volgende gebruik door rekening te houden met biomassa droog gewicht en de β-fructofuranosidase activiteit 11. </li></ol> 5. Microscopie en Automated Image Analysis na 72 uur van de teelt <ol><li> Plaats ongeveer 3 ml cultuur suspensie in een plastic petrischaal enhen verdunnen fysiologische zoutoplossing tot morfologische structuren worden gescheiden. </li><li> Situeer de petrischaal onder de microscoop, die een geïntegreerde of aangesloten camera beschikt. Verwerven en op te slaan ongeveer 100 beelden (figuur 2) van morfologische structuren per monster. Let erop dat op elke afbeelding tenminste een object volledig is afgebeeld. </li><li> Open alle afbeeldingen van hetzelfde monster met de beeldverwerking programma ImageJ 12. Zet de foto&#39;s naar zwart-wit met behulp van het process tool &quot;Make Binary&quot; (Figuur 2). Voor het aanbrengen van de opdracht voor de hele serie foto&#39;s gebruik maken van een macro-code als volgt. lopen (,, Make Binary &quot;) </li><li> Open verwerkte binaire beelden ImageJ weer. Bereken de vormfactoren Feret de diameter, geprojecteerd oppervlakte, omtrek, circulariteit, aspect ratio, rondheid und degelijkheid voor elk beeld met de analyse tool &quot;Set waardering&quot;. Voor het aanbrengen van de opdracht om een ​​series van beelden gebruik maken van een macro-code als volgt. draaien (&quot;8-bit&quot;); draaien (&quot;Maak Binary&quot;); draaien (&quot;Set Schaal ...&quot;, &quot;afstand = X = 1000 bekend pixel = 1 eenheid = um global&quot;); draaien (&quot;Set Afmetingen ...&quot;, &quot;gebied omtrek vorm van Feret de limiet scherm redirect = Geen decimaal = 3&quot;); draaien (&quot;Analyseer deeltjes ...&quot;, &quot;size = 10000-Infinity circulariteit = 0.00-1.00 show = Contouren display&quot;); Bepaal X het aantal pixels die tot 1000 pm correleert met de bouw van een rechte lijn in een schaal bar. Correleren aantal pixels van de rechte lijn met de lengte van de schaal bar pm. </li><li> Open het resultaat bundel waarin vormfactor waarden voor elk beeld met een spreadsheet. Bereken een Morfologie aantal als volgt over de afbeelding. <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" /></li><li> Bereken de gemiddelde waarde en standaarddeviatie voor de morfologie aantal, rekening houdend met alle afbeeldingen van een monster. </li&gt; <li> Gebruik een grafische en data-analyse programma voor grafische correlatie van de morfologie nummer met de specifieke productiviteit en bepalen de mathematische relatie door wiskundige regressie. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Door toevoeging van talk micro deeltjes A. niger Skan 1015 morfologie is veranderd van een echte pellet morfologie van een gedispergeerd of zelfs mycelium morfologie. Overwegende dat de pellet morfologie is te zien in normale omstandigheden een mycelium morfologie wordt gecreëerd door suppletie van medium met 10 g / L van talk micro-deeltjes (figuur 4.). Tegelijkertijd de activiteit van β-fructofuranosidase verhoogt ongeveer 3 maal 3-5. Een suppletie van 1 of 3 g / L van talkpoeder tot gedispergeerde morfologie, met een dubbele fructofuranosidase activiteit (figuur 4.). De micro-deeltje afhankelijk morfologie volledig kan worden beschreven door de Morphology getal dat kan worden berekend met behulp van parameters bepaald door de automatische beeldanalyse. Perfect rond en glad pellets zal in microscopische beelden verschijnen als perfecte cirkels. Voor dergelijke deeltjes de morfologie getal met de waarde 1. De kleinste fragment van mycelium morfologie kan worden vereenvoudigd als eendimensionale lijn waarbij een morfologie aantal 0. Alle tussenliggende morfologische vormen, zoals langgerekte onregelmatige korrels of klompjes zal dus waarden tussen 0 en 1. Vrij grote deeltjes resulteren in een hoge schimmel deeltjes met een groot oppervlak of langwerpige deeltjes in een betrekkelijk laag morfologie nummer 11. Bij normale omstandigheden de morfologie in reactor 1 vertoont een Morfologie aantal rond de 0,8. De morfologie in reactor 4 met 10 g / L talkpoeder is voorzien van een Mn ongeveer 0,1. De morfologie nummer reactoren 2 en 3, met talkpoeder concentraties van 1 en 3 g / l ligt tussen deze uitersten, waaruit een gedispergeerd morfologie. Aangezien micro deeltjes afhankelijk morfologie is nauw verwant met de β-fructofuranosidase productiviteit wordt een mathematisch verband tussen morfologie aantal en productiviteit soortgelijke figuur 5 verkregen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" /> Figuur 1. Algemeen schema van de proefopzet en de analytische procedure. A. niger geteeld (met of zonder microdeeltjes) in een 3 L geroerde tank bioreactor gedurende 72 uur. Na 24 tot 48 en 72 ha monster voor het bepalen van biomassa drooggewicht en β-fructofuranosidase activiteit, die weer gebruikt voor de berekening van de specifieke productiviteit. Na 48 uur de schimmel morfologie wordt onderzocht onder de microscoop en wordt gekenmerkt door digitale beeldanalyse. Relevante parameters van beeldanalyse worden gecombineerd om een ​​morfologie getal, dat mathematische verband met de specifieke productiviteit. <imgalt = &quot;Figuur 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg&quot; /&gt; Figuur 2. Stappen van beeldverwerking voor microscopische-gegenereerde beelden van morfologische structuren van A. niger. Stap 1: image overname door microscoop. Stap 2: image verbeteren indien nodig. Stap 3: beeld binarisatie, zwart-wit (binaire) beeld gegenereerd in ImageJ. Stap 4: het binaire beeld wordt verwerkt door en ongewenste object worden gewist. Stap 5: morfologische analyse wordt uitgevoerd met de &quot;Analyseer deeltjes&quot; functie van het open source programma ImageJ. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" /> Figuur 3. Verschillende vormen van morfologische A. niger afhankelijk van de concentratie van toegevoegd microdeeltjes. Met de toenemende concentratie van micro-deeltjes toegevoegd de korrelgrootte nauwkeurig kan worden verlaagd tot kleine kern-schil pellets, kleine groepen en zelfs vrij verspreid mycelium. Morfologie techniek van Aspergillus niger SKAn1015 door micro deeltje suppletie in submerse cultuur. Zonder microdeeltjes (A), 10 mg / L (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / L (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / L (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / L (M ), 4,5 g / L (N), 5,0 g / L (O) 10 g / L (P), 15 g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) en 40-50 g / L (T). Afbeeldingen zijn gemaakt door lichtmicroscopie na 72 uur van de teelt. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" /> Figuur 4. Fructofuranosidase activiteit in afhankelijkheid van talk micro deeltjesconcentratie 1 g / L (reactor 2), 3 g / L (reactor 3) en 10 g / L (reactor 4). Reactor 1 is niet aangevuld met micro-deeltjes, hier de teelt wordt uitgevoerd onder normale omstandigheden. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" /> Figuur 5. Representatieve goede correlatie (R2 = 0,91) van de morfologienummer en de specifieke productiviteit. De morfologie aantal uitgezet (abscis) tegen de specifieke productiviteit (ordinaat). Lineaire regressie levert de exponentiële relatie.

<ol><li>Wucherpfennig, T., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWucherpfennig%2C+T+%22Advances+in+Applied+Microbiology%22">Advances in Applied Microbiology</a>. 72, Academic Press. 89-136 (2010).</li>
<li>Driouch, H., Hänsch, R., Wucherpfennig, T., Krull, R., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+enzyme+production+by+bio-pellets+of+Aspergillus+niger%3A+Targeted+morphology+engineering+using+titanate+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Improved enzyme production by bio-pellets of Aspergillus niger: Targeted morphology engineering using titanate microparticles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 462-471 (2012).</li>
<li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+bioprocess+for+production+of+fructofuranosidase+by+recombinant+Aspergillus+niger%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 2011-2024 (2010).</li>
<li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+fungi+in+good+shape%3A+Microparticles+for+tailor-made+fungal+morphology+and+enhanced+enzyme+production%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered+Bugs%22%5BJournal%5D)">Filamentous fungi in good shape: Microparticles for tailor-made fungal morphology and enhanced enzyme production.</a> Bioengineered Bugs. 2, 100-104 (2011).</li>
<li>Driouch, H., Sommer, B., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+engineering+of+Aspergillus+niger+for+improved+enzyme+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 1058-1068 (2010).</li>
<li>Kaup, B. -A., Ehrich, K., Pescheck, M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticle-enhanced+cultivation+of+filamentous+microorganisms%3A+Increased+chloroperoxidase+formation+by+Caldariomyces+fumago+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microparticle-enhanced cultivation of filamentous microorganisms: Increased chloroperoxidase formation by Caldariomyces fumago as an example.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 491-498 (2008).</li>
<li>Hirayama, M., Sumi, N., Hidaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+fructooligosaccharide-producing+beta-fructofuranosidase+from+Aspergillus+niger+ATCC+20611%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a fructooligosaccharide-producing beta-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC 20611.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 53, 667-673 (2006).</li>
<li>Rajoka, M. I., Yasmeen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+productivity+of+beta-fructofuranosidase+by+a+derepressed+mutant+of+Aspergillus+niger+form+conventional+and+non-conventional+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved productivity of beta-fructofuranosidase by a derepressed mutant of Aspergillus niger form conventional and non-conventional substrates.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 21, 471-478 (2005).</li>
<li>Zuccaro, A., GÃ¶tze, S., Kneip, S., Dersch, P., Seibel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+fructooligosaccharides+by+a+combination+of+substrate+and+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Tailor-made fructooligosaccharides by a combination of substrate and genetic engineering.</a> ChemBioChem. 9, 143-149 (2008).</li>
<li>Huggett, A. S. G., Nixon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+glucose+oxidase%2C+peroxidase%2C+and+o-dianisidin+in+determination+of+blood+and+urinary+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Use of glucose oxidase, peroxidase, and o-dianisidin in determination of blood and urinary glucose.</a> The Lancet. , 270-368 (1957).</li>
<li>Wucherpfenning, T., Hestler, T., Krull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+engineering+-+Osmolality+and+its+effect+on+Aspergillus+niger+morphology+and+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Morphology engineering - Osmolality and its effect on Aspergillus niger morphology and productivity.</a> Microb. Cell Fact. 10, (2011).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Papagianni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+fractal+nature+of+mycelial+aggregation+in+Aspergillus+niger+submerged+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Quantification of the fractal nature of mycelial aggregation in Aspergillus niger submerged cultures.</a> Microbial Cell Factories. 5, 5(2006).</li>
</ol>

Ik heb niets te onthullen.

De wijziging van schimmel morfologie interesse heeft gewekt in de biotechnologie sinds vele decennia. Verschillende studies hebben geprobeerd om gekozen procesparameters zoals de pH-waarde, het vermogen, temperatuur, medium voedingsstoffen of inoculum concentratie 1 variëren, maar last hebben van eerder onnauwkeurig en onvolledig controle van de morfologie, hoge energiekosten, remming effecten of product instabiliteit, daarentegen, de suppletie van microdeeltjes kan een nauwkeurige techniek door middel van fungale morfologie afgestemd variatie van de deeltjesgrootte en-concentratie. Dit opent nieuwe mogelijkheden om micro-deeltjes te gebruiken voor optimalisatie en voor op maat gemaakte ontwerp van een hoog producerende morfologie in de biotechnologische productie met A. niger en draadvormige micro-organismen. De digitale beeldanalyse is een makkelijk reproduceerbare methode om schimmel macro morfologie karakteriseren. Echter, de verscheidenheid van parameters voor grootte, vorm en oppervlakte kenmerkenter van morfologische structuren in de literatuur beschreven maakt snelle beoordeling van ingewikkelde schimmel morfologie. Het weergegeven aantal morfologie als een combinatie van de relevante parameters, voorkomt dit tekort en kan niet alleen worden gebruikt voor een volledige typering van morfologische structuren, maar ook voor directe correlatie met wiskundige productiviteit. Dit maakt opnieuw een inschatting van de productiviteit door gegeven morfologie en dus een aanpassing van de morfologie voor het proces moet mogelijk zijn. De morfologie getal is het mogelijk onderscheid te maken tussen verschillende pellet en pol morfologie 4,5. Voor de verdere ontwikkeling van de morfologie aantal de behandeling van de fractale dimensie lijkt te zijn veelbelovend. Een fractale dimensie geeft een meting van de complexiteit en de massa te vullen eigenschappen van een object 13 en is daarom voorbestemd voor holistische karakterisering van mycelium morfologie. De creation van een hoge producerende mycelium morfologie, echter kan leiden tot problemen met het proces prestaties vooral in grootschalige teelt, omdat de myceliumgroei formulier is eerder aangetoond dat het vertonen een veel grotere cultuur bouillon viscositeiten 2. Dit leidt tot problemen met warmte-en massaoverdracht en vorming van stilstaand niet gemengde gebieden, die een hoog vermogen en om de teelt duurder een Inherent. Daarom tussen schimmel morfologie en kweekvloeistof viscositeit moet worden gehouden bij het veranderen van de morfologie en worden opgenomen in andere modellen.

aanpassing van aspergillus niger morfologie door toevoeging van talk micro-deeltjes

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

De filamenteuze schimmel A. niger is een veel gebruikte stam in een groot aantal industriële processen voedsel farmaceutische industrie. Een van de meest interessante vaak ongecontroleerde eigenschappen van deze draadvormige organisme is het complex morfologie. Het varieert van dichte bolvormige pellets viskeuze mycelia (figuur 1). Verschillende procesparameters en ingrediënten bekend schimmel morfologie een beïnvloeden. Sinds optimale productiviteit hangt sterk samen met een specifieke morfologische vorm, de schimmel morfologie is vaak de bottleneck van de productiviteit in de industriële productie. Een eenvoudig en elegante aanpak om precies morfologische vorm is de toevoeging van anorganische onoplosbare microdeeltjes (zoals waterhoudend magnesiumsilicaat, aluminium-oxide of titaansilicaat oxide) aan het kweekmedium bijdragen tot toegenomen enzymproductie 2-6. Aangezien er een obvious correlatie tussen micro-deeltjes afhankelijk van de morfologie en de productie van enzymen is het wenselijk om wiskundig te koppelen van de productiviteit en morfologische uitstraling. Daarom is een nauwkeurige kwantitatieve en holistische morfologische beschrijving is gericht. Zo we een methode voor het genereren en karakteriseren micro deeltjes afhankelijk morfologische structuren en schimmels morfologie correleren met productiviteit (figuur 1) die mogelijk bijdraagt ​​tot een beter begrip van de morfogenese van organismen draadvormige. De recombinante stam A. niger SKAn1015 wordt gekweekt gedurende 72 uur in een 3 L geroerde tank bioreactor. Door toevoeging van talk microdeeltjes in concentraties van 1 g / L, 3 g / l en 10 g / L vóór de inoculatie verschillende morfologische structuren is reproduceerbaar gegenereerd. Steriele monsters genomen na 24, 48 en 72 uur voor de bepaling van de groei vooruitgang en activiteit van de geproduceerde enzym. Degevormde product is de hoge waarde enzym β-fructofuranosidase, een belangrijke biokatalysator voor de neo-suiker vorming in voedings-en farmaceutische industrie, die katalyseert onder andere de reactie van sucrose in glucose 7-9. Daarom is de kwantificering van glucose na toevoeging sucrose houdt de hoeveelheid geproduceerd β-fructofuranosidase. Glucose kwantificering van een GOD / POD-test 10, die is aangepast voor hoge doorvoer analyse in 96-well micro titer platen. Schimmel morfologie na 72 uur wordt onderzocht onder de microscoop en wordt gekenmerkt door digitale beeldanalyse. Daarbij worden deeltjesvorm factoren voor schimmelinfecties macro-morfologie, zoals een diameter van Feret&#39;s, geprojecteerde oppervlakte, omtrek, circulariteit, aspect ratio, rondheid und stevigheid berekend met de open source beeldbewerkingsprogramma ImageJ. Relevante parameters worden gecombineerd om een dimensieloos getal Morfologie (Mn) 11 die een uitgebreid karakterisering van steltfungale morfologie. De nauwe correlatie van de morfologie aantal en de productiviteit worden gemarkeerd door wiskundige regressie.

Een methode om nauwkeurig te genereren en om volledig te karakteriseren morfologie van filamenteuze schimmel<em&gt; Aspergillus niger</em&gt; Beschreven, waardoor de mathematische verband morfologische uiterlijk en productiviteit.

Aanpassing van Aspergillus niger Morfologie door toevoeging van talk micro-deeltjes

De filamenteuze schimmel A. niger is een veelgebruikte stam in een breed scala aan industriële processen, van de voedingsmiddelenindustrie tot de farmaceutische industrie. Een van de meest ...

Deze methode genereert en karakteriseert microdeeltjesafhankelijke morfologische structuren van de draadschimmel Aspergillus niger om de schimmelmorfologie te correleren met de productiviteit. Kweek A. niger gedurende 72 uur met of zonder microdeeltjes in een geroerde tankbioreactor van drie liter om de specifieke productiviteit te berekenen. Neem monsters op vastgestelde tijdstippen en bepaal het biomassa-drooggewicht en de betafructosidase-activiteit.Onderzoek na 72 uur de schimmelmorfologie via microscopie en karakteriseer deze door middel van digitale beeldanalyse. Combineer vervolgens relevante parameters van de beeldanalyse tot een morfologiegetal dat mathematisch correleert met de specifieke productiviteit. Uiteindelijk kan deze methode de morfologie van Aspergillus niger nauwkeurig genereren en uitgebreid karakteriseren voor een beter begrip van de morfogenese van filamenteuze micro-organismen.Aspergillus niger is al vele decennia een belangrijk industrieel werkpaard in de biotechnologie. Een van de meest intrigerende en vaak onbeheersbare kenmerken van A. niger en verwante soorten is hun complexe morfologie, die varieert van dichte sferische pellets tot viskeuze mycelia, afhankelijk van de kweekcondities. Het belangrijkste voordeel van onze procedure is dat we door de toevoeging van microdeeltjes nu in staat zijn om de schimmelmorfologie specifiek af te stemmen op de procesbehoeften.Tot nu toe is er geen andere methode beschreven voor een dergelijke aanpassing van de schimmelmorfologie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de kweek van filamenteuze micro-organismen. Voor industriële toepassingen is het immers cruciaal om de schimmelmorfologie te beheersen en daarnaast onderscheid te kunnen maken tussen een goed producerende en een slecht producerende schimmelmorfologie.Ons protocol biedt de mogelijkheid voor gewenste aanpassing en karakterisering van de schimmelmorfologie. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de morfologie van Aspergillus niger, kan deze ook worden toegepast op andere filamenteuze micro-organismen, zoals Penicillium- of Streptomyces-stammen. Stel vier bioreactoren in voor steriele culturen, zoals beschreven in het bijbehorende protocol.Tekst gebaseerd op de toevoeging van micropartikels, kweek aspergillus Niger met verschillende morfologie. Breng na 72 uur monsters van 50 milliliter kweekbouillon over in een Falcon-buis.Biomassa-monsters dienen ten minste in dubbeltoestelling te worden genomen; weeg na droging in de desiccator een cellulosefilter met de microbalans. Plaats het filter in een Büchner-trechter die is aangesloten op een vacuumpomp met waterstraal; filter 10 milliliter monster, gevolgd door 10 milliliter gedeïoniseerd water om mediumcomponenten uit de biomassa te verwijderen. Vouw het filter eenmaal in het midden.Plaats het in een glazen petrischaal en in een vacuümdroger tot een constant gewicht is bereikt. Verplaats het filter naar een exsiccaat en laat het afkoelen. Meet vervolgens het gewicht.Bereken het droge biomassagewicht per liter door bepaling van het gewicht, het verschil tussen de filters en de daaropvolgende deling door het monstervolume voor de glucose-oxidase- en peroxidase-enzymassays. Bewaar monsters op ijs met behulp van een spuit, 1,5 milliliters. Leid de cultuursuspensie door een celluloseacetaatfilter in een reactiebuis voor het uitvoeren van de bèta-fructose-SASE-assay.Om de statistische robuustheid te waarborgen, voeren we de meting zorgvuldig uit met twee triplicaten. Voeg om de assay te starten 20 µL monster toe aan de reageerbuis; om te controleren op de pH- en temperatuurafhankelijke splitsing van sucrose tot glucose, gebruikt u 20 µL gedeïoniseerd water in plaats van 20 µL monster. Bereid daarnaast voor elk monster een negatieve controle voor residuele glucose in het kweekmedium door middel van de assay.20 µL hitte-geïnactiveerd monster. Voeg 200 µL sucrose-oplossing 1,65 M toe om de reactie van sucrose naar glucose te initiëren. Bij pH 5,4 en 20 µL monster worden alle reactiebuisjes 20 minuten geïncubeerd in een warmteblok van 40 °C. Stop de reactie door de buisjes eerst op ijs te koelen en vervolgens 10 minuten te verhitten op 95 °C.Centrifugeer de monsters indien nodig en verdun deze voor de assay zodanig dat de gemeten absorptie binnen het gekalibreerde waardebereik valt. Voeg nu voor elke reactie twee microliters monster toe aan een microtiterplaat. Voer de monstermetingen in triplikaat uit.Bereid daarnaast een standaardcurve voor met 10 glucose-oplossingen variërend van 1 millimolar tot 15 millimolar. Gebruik voor de nulpuntskalibratie 2 µL gedeïoniseerd water. Voeg vervolgens aan elk van deze 200 µL van de reagensoplossing toe.Incubeer de plaat 10 minuten bij kamertemperatuur. Meet de absorptie bij 450 nanometer met een 96-well sunrise Microplate reader en de Magellan data retrieval software. Open de resultatentabel in een spreadsheet en stel een kalibratielijn voor de standaardcurve op.Bereken de activiteit voor elk monster. Bereken vervolgens de bèta-fructosidase-activiteit door de waarden van de bijbehorende negatieve controle van de monsteractiviteit af te trekken. Bereken tenslotte de specifieke productiviteit door het drooggewicht van de biomassa en de bèta-fructosidase-activiteit mee te wegen.Plaats drie milliliters van de cultuursuspensie in een plastic Petrischaal en verdun deze met een fysiologische natriumchlorideoplossing om de morfologische structuren te scheiden. De kwaliteit van de microscopische beelden is van uitzonderlijk belang. Voor de daaropvolgende beeldanalyse moet tijdens de verdunningsstap zorgvuldig te werk worden gegaan.Plaats de Petrischaal onder een microscoop die is uitgerust met een geïntegreerde camera. Leg ongeveer 100 beelden van morfologische structuren per monster vast en sla deze op, waarbij wordt gewaarborgd dat op elk beeld ten minste één object volledig in beeld is. Ga op dezelfde wijze te werk met schalen die monsters van verschillende reactoren bevatten, waarbij telkens nieuwe beelden worden vastgelegd.Let op de verschillende morfologische groeivorm van monsters uit verschillende reactoren die zijn gekweekt met variërende hoeveelheden toegevoegd talkpoeder. Open vervolgens alle afbeeldingen van hetzelfde monster in het beeldverwerkingsprogramma Image J. Gebruik de proces-tool om de afbeeldingen binair te maken.Zet de afbeeldingen om naar zwart-wit om het commando toe te passen op een volledige reeks afbeeldingen. Gebruik vervolgens een macrocode en open een van de afbeeldingen die een schaalbalk bevatten. Trek een rechte lijn over de schaalbalk om het aantal pixels te bepalen dat overeenkomt met 2000 microns.Selecteer de analysetool, stel de meting in en kies de vormfactoren: ferrets, diameter area en perimeter. Gebruik een macrocode om een reeks afbeeldingen te verwerken. Open nu het spreadsheet waarin de resultaten van de vormfactorwaarden zijn weergegeven.Bereken voor elke afbeelding een morfologiegetal voor alle afbeeldingen van één monster. Bereken de gemiddelde waarde voor het morfologiegetal. Gebruik een grafisch en data-analyseprogramma om het morfologiegetal uit te zetten tegen de specifieke productiviteit.Bepaal de wiskundige relatie via wiskundige regressie door de toevoeging van toenemende concentraties talkmicropartikels. Acht Niger SKAN 10 15. De morfologie verandert van een ware pelletmorfologie naar een gedispergeerde of zelfs my-morfologie, terwijl onder standaardcondities de verwachte pelletmorfologie wordt vertoond.Interessant is dat de myceliale morfologie wordt bepaald door het medium aan te vullen met 10 gram per liter talkmicrodeeltjes. Tegelijkertijd neemt de activiteit van Beto Fructotase ongeveer drie keer toe; aanvulling met één of drie gram per liter talkpoeder leidt tot een gedispergeerde morfologie met een verdubbelde fructose-activiteit, gebruikmakend van parameters bepaald door automatische beeldanalyse. De microdeeltjesafhankelijke morfologie kan uitgebreid worden beschreven door morfologie.Let op: perfect ronde, gladde pellets zullen op microscopische beelden als perfecte cirkels verschijnen voor dergelijke deeltjes. Het morfologiegetal heeft een waarde die onder standaardomstandigheden één benadert. De morfologie in reactor één vertoont een morfologiegetal van rond de 0,8.De morfologie in reactor vier met 10 g/L talkpoeder vertoont een morfologiegetal van rond de 0,1. Het morfologiegetal voor de reactoren twee en drie met talkpoederconcentraties van 1 en 3 g/L ligt tussen deze uitersten, wat wijst op een gedispergeerde morfologie.Aangezien de morfologie die afhankelijk is van microdeeltjes nauw verbonden is met de productiviteit van bèta-fructosytacellen, bestaat er na de ontwikkeling een goede wiskundige correlatie tussen morfologie, aantal en productiviteit. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de biotechnologie om de schimmelmorfologie verder te onderzoeken, en in het bijzonder de relatie daarvan met de productiviteit. Door deze procedure voor de gedetailleerde creatie van specifieke morfologische schimmelkruistypen te volgen, kunnen andere belangrijke aspecten van kweek van filamenteuze micro-organismen worden verkend.Myceliale morfologie is bijvoorbeeld bekend als veel viskeuzer dan pelletmorfologie. Daarom wordt de algehele productiviteit van het proces belemmerd door problemen bij de zuivering van het gewenste product. Ons morfologiegetal zal helpen bij het opstellen van modellen met betrekking tot de kweek en protologie, en ons begrip van schimmelmorfologie in het algemeen verder vergroten.

customization-aspergillus-niger-morphology-through-addition-talc

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Cryo elektronenmicroscopen, ofwel Scanning (SEM) of Transmission (TEM), worden op grote schaal gebruikt voor de karakterisering van biologische monsters of andere materialen met een hoog watergehalte 1. Een SEM / focused ion beam (FIB) wordt gebruikt om kenmerken van belang in monsters identificeren en extract een dun, elektron-transparante lamellen overbrenging op een cryo-TEM.

Cryo-elektron microscopie Specimen Voorbereiding door middel van een Focused Ion Beam

Problemen bij de verwerking van biologische monsters voor waarneming door middel van rasterelektronenmicroscopie omvatten celimplosie, behandeling van monsters uit natte micro-omgevingen en celvernietiging. Goedkope en relatief snelle protocollen die geschikt zijn voor het voorbereiden van uitdagende monsters zoals bloemtoppen, oömyceten cysten en schimmels (Agaricales) zijn hier samengesteld en gedetailleerd.

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocollen voor Problematisch Plant, oömyceet en Fungal Samples

Hier presenteren we een protocol om Aspergillus flavus groei en productie van aflatoxine in maïs kernels uiting van een antischimmel eiwit te analyseren.  Met behulp van een stam GFP-uiten A. flavus bewaakt we de infectie en de verspreiding van de schimmel in volwassen kernels in real-time. De bepaling is snel, betrouwbaar en reproduceerbaar.

Remming van de groei van de Aspergillus flavus en aflatoxine productie in transgene maïs uiten van de α-amylase Inhibitor van Lablab purpureus L.

Klasse 1 histone deacetylases (HDACs), zoals RpdA hebben opgedaan belang als potentiële doelstellingen voor de behandeling van schimmelinfecties. Hier presenteren we een protocol voor de specifieke verrijking van TAP-Tagged RpdA gecombineerd met een HDAC activiteit assay die het mogelijk maakt in vitro effectiviteit testen van histone deacetylase remmers.

Enkele stap verrijking van een TAP-Tagged histone deacetylase van de gloeiende schimmel Aspergillus nidulans voor enzymatische activiteit assay

Hier presenteren we gedetailleerde verwerkingsprotocollen voor Imaging delicate weefselmonsters met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Drie verschillende verwerkingsmethoden, namelijk hexamethyl disilazana (HMDS) chemisch drogen, eenvoudige lucht drogen en het drogen van kritische punten worden beschreven voor het bereiden van stijve eierschalen, embryo's in vroege ontwikkelingsstadia en schimmel culturen respectievelijk.

Verwerking van embryo-, eierschaal-en schimmel cultuur voor het scannen van elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft een Aspergillus infectiemodel in zebravislarven. Aspergillus sporen worden micro-geïnjecteerd in de hindbrain van larven, en chemische behandeling wordt gebruikt om immunosuppressie induceren. Infectieprogressie wordt gecontroleerd via een dagelijkse beeldvormingsopstelling om schimmelgroei en immuunresponsen te monitoren, evenals inventarisatie van levende sporen per kolonievormende eenheidsplating.

Infectie van zebravislarven met Aspergillus-sporen voor analyse van gastheer-pathogene interacties

Het CRISPR-Cas9 genoombewerkingssysteem is een gebruiksvriendelijke genoomeditor die is gebruikt in model- en niet-modelsoorten. Hier presenteren we een eiwit-gebaseerde versie van dit systeem dat werd gebruikt om een voortijdige stop codon te introduceren in een paring gen van een niet-model filamenteuze ascomycete schimmel.

CRISPR-Cas9-Gemedieerd Genoombewerking in de filamenteuze Ascomycete Huntiella omanensis

Dit protocol is een effectieve, snelle methode om gisten en de schimmel Aspergillus fumigatus uit grote sets bodemmonsters te kweken in slechts 7 dagen. De methoden kunnen eenvoudig worden aangepast om een reeks incubatiemedia en temperaturen te accommoderen als dat nodig is voor experimenten.

Isolatie van kweekbare gisten en schimmels uit bodems om de structuur van schimmelpopulaties te onderzoeken

Dit protocol is bedoeld om gedetailleerde procedures te bieden voor het verzamelen, fixeren en onderhouden van mycoheterotrofe plantenmonsters, waarbij verschillende microscopietechnieken worden toegepast, zoals scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie, licht-, confocale en fluorescentiemicroscopie om schimmelkolonisatie te bestuderen in plantenweefsels en zaden ontkiemd met mycorrhizaschimmels.

Microscopietechnieken voor het interpreteren van schimmelkolonisatie in mycoheterotrofe plantenweefsels en symbiotische kieming van zaden

Hier beschrijven we een eenvoudige en goedkope techniek voor het inoculeren en observeren van arbusculaire mycorrhiza-schimmels in superabsorberende autotrofe systemen op basis van polymeren.

Inoculeren en observeren van arbusculaire mycorrhizaculturen op superabsorberende autotrofe systemen op basis van polymeren

Dit protocol presenteert een praktische methode met Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) als voorbeeld om ongelijke deeltjesverdeling aan te pakken door optimalisatie van de monstervoorbereiding, en biedt een referentie voor onderzoekers om macromoleculaire structuren efficiënt op te helderen met behulp van cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM).

Optimalisatie van monstervoorbereiding voor cryogene elektronenmicroscopie

Leer hoe u de morfologie van Aspergillus niger aanpast met talk micro-deeltjes in bioreactoren. Deze methode correleert schimmelmorfologie met productiviteit via digitale beeldanalyse.

Aanpassing van Aspergillus niger Morfologie door toevoeging van talk micro-deeltjes

Meer video's verkennen