Name: Een semi-kwantitatieve benadering van biofilmvorming Met behulp van Gerimpelde Colony ontwikkeling te beoordelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Leer een semi-kwantitatieve methode om biofilmvorming te bestuderen via gerimpelde koloniemorfologie. Deze techniek maakt het mogelijk om bacteriële fenotypen te vergelijken onder verschillende omstandigheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NHI R01 subsidie ​​GM59690 toegekend aan KLV.

1. Eerste karakterisering en overwegingen <ol><li> Biofilmvorming wordt over het algemeen beïnvloed door celdichtheid en groeisnelheid. Daarom moet de groei (toename van de optische dichtheid (OD) tijd) en opbrengst (laatste cel nummer) van de stam (s) van belang bij het uitvoeren van eenvoudige groeicurve en cellen plating assays bepalen. Gebreken in de groei, of een gebrek aan correlatie tussen OD en mobiele nummer, moet rekening worden gehouden bij het interpreteren van de resultaten van het spotten van experimenten. </li><li> Inclusief de positieve en negatieve controles op dezelfde plaat bij de beoordeling van gerimpelde kolonievorming, als kleine plaat-to-plate variatie kan biofilm ontwikkeling beïnvloeden. </li><li> Identificeer de beste voorwaarden voor het spotten van, dat wil zeggen, degenen die de meest duidelijke verschillen tussen de controle en mutant (s) van belang zichtbaar te maken. Grow stammen in vloeibare cultuur onder verschillende omstandigheden, zoals verschillende media of temperaturen, en verschillende podiums van de groei (exponentiële of stationaire fase) voorafgaand aan het spotten. Spot 10 ul cultuur verschillende celdichtheden op de geschikte media, en incuberen bij de gewenste temperatuur tot kolonie morfologie gebleken. </li><li> Het eindpunt test impliceert beoordeling van gerimpelde kolonievorming op een vooraf bepaald tijdstip na het spotten (dat wil zeggen, 48 uur). Deze beoordeling is handig voor stammen die vertonen (of worden voorgesteld om te exposeren) ernstige defecten in biofilmvorming. </li><li> Het tijdsverloop test beoordeelt gerimpelde kolonievorming over een periode van tijd (dat wil zeggen, elk uur) na te spotten. Deze assay maakt een semi-kwantitatieve bepaling van biofilmvorming doordat de bepaling van de start van gerimpelde kolonievorming en het patroon ontwikkeling over een periode. De duur van het experiment en het aantal inzamelpunten voor een bepaalde tijd gevolgd, dient te worden vastgesteld in voorlopige experimenten. </li><li> Gemakkelijk te volgen is de tijd na het spotten, vastgesteld opdimeer op te tellen. </li></ol> 2. Microscopische beoordeling van Gerimpelde Kolonie morfologie in V. fischeri <ol><li> Inoculeer V. fischeri cellen in 5 ml LB-zout (LBS) medium 13 (1% [w / v] trypton, 0,5% [w / v] gistextract, 2% [w / v] natriumchloride, 50 mM Tris-HCl [ pH 7,5]) die de nodige antibiotica en incubeer onder schudden gedurende de nacht bij 28 ° C. In de ochtend, de cellen met een 1:100 verdunning subcultuur in 5 ml vers LBS medium en incubeer onder dezelfde voorwaarden tot de cellen hebben bereikt de gewenste OD 600 (bijv. OD 600 = 0,2 of 0,5). </li><li> Pipet 1 ml van de cultuur in een microfugebuis en centrifuge in een microcentrifuge bij maximale snelheid gedurende een minuut. Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie. Was de cellen resterende media en extracellulaire componenten verwijderen resuspenderen de pellet in 1 ml steriel 70% kunstmatig zeewater (ASW) (35 mM MgSO 4-7H 2 O 7 mM CaCb2-2H 2 O, 210 mM NaCl, 7 mM KCl) en het herhalen van de centrifugeren. Resuspendeer de gewassen pellet in 1 ml van 70% ASW. </li><li> Zorg ervoor dat elk monster hetzelfde aantal cellen, zoals geraamd door de OD bij 600 nm bevat. Maak de nodige aanpassingen door verdunning van meer geconcentreerde monsters met een extra 70% ASW. In inleidende experimenten, te herkennen culturen op verschillende eerste OD-waarden te bepalen van een optimale start OD voor een bepaalde set van stammen of voorwaarden. De beste resultaten worden verkregen V. fischeri wanneer spots worden gegenereerd uit culturen met een buitendiameter van ongeveer 0,2. </li><li> Spot 10 ul van de gewassen cellen op platen met LBS nodige antibiotica. Bij het spotten van een cultuur op een bord, zorg ervoor dat stabilisatie van de pipet (met uw vinger) net boven de agar oppervlak. Spot verticaal niet onder een hoek, en langzaam uitwerpen de vloeistof gelijkmatige verdeling van de vlek. Typisch elke stam een ​​keer gespot per plaat (tot 6 plaatsen per plaat), with meerdere platen (2-3) per experiment. </li><li> Om ervoor te zorgen dat de gevlekte cultuur blijft gelijkmatig verdeeld, zodat de plek om te drogen voordat het verplaatsen van de plaat naar de incubator. Keer de platen en incubeer ze op 28 ° C. </li><li> Bewaken van de morfologie van de groeiende spot per uur vanaf 12-15 uur na inenting. We maken gebruik van een dissectie scope (Zeiss STEMI 2000-C) met een camera bijlage (Progres C10 PLUS) en de Progres CapturePro en ImageJ software programma&#39;s om te observeren en te documenteren kolonie morfologie en de start en de progressie van gerimpelde kolonievorming te beoordelen. </li><li> Voor de specifieke setup in stap 2.5 komen de vlekken verlicht vanaf de onderkant door middel van een transparante glazen podium met een CL-1500 EG koud licht bron, terwijl de beelden worden opgenomen van boven. Deze opstelling is optimaal voor de beeldvorming gerimpelde kolonie ontwikkeling omdat V. fischeri kolonies (spots) zijn doorzichtig. </li><li> Aangezien de specifieke apparatuur in step 2,5, monitor gerimpelde kolonie morfologie van het gebruik van een stereomicroscoop die het mogelijk maakt voor de volledige kolonie weer te geven en heeft een verstelbare lichtbron en, idealiter, een aangesloten camera. Indien nodig kan een digitale camera worden gebruikt in afwezigheid van een aangesloten camera, maar dit is niet optimaal. </li><li> Om optimaal zichtbaar gerimpeld kolonie ontwikkeling is het noodzakelijk zowel de lichtintensiteit en hoek van terugkaatsing passen onder de bacteriële kolonies, dat de driedimensionale morfologie van de ontwikkeling biofilm kan worden waargenomen. De optimale belichting dat de sterkste contrast tussen de gevlekte kolonie en de omringende achtergrond agar, zodat de architectuur (rimpels) van de kolonie duidelijk onderscheiden voorzien. </li><li> In sommige gevallen dient de kleur van het gevlekte kolonie worden gehouden, zoals veranderingen in kleur kolonie tijdens biofilmvorming. Stel de intensiteit en de hoek van de lichtbron te onthullenDeze kleine veranderingen in kleur. Zodra de juiste instellingen worden bereikt, handhaven voor de duur van het experiment. </li><li> Merk hoeveel tijd vanaf het moment van inoculatie op het tijdstip waarop gerimpeld kolonievorming initieert per stam of aandoening. Definieer de start van gerimpelde kolonievorming het tijdstip waarop de vorming van patronen en 3D structuren (zoals strepen vormt aan de buitenrand of &quot;ribbels &#39;zich in het midden) eerst duidelijk. Mutant cellen vertonen verlaagd of verhoogd tijd aan het begin van gerimpelde kolonievorming (bijv. Fig. 2). </li><li> Documenteer de start en ontwikkeling van de gerimpelde kolonievorming door het vastleggen van geschikte digitale beelden. Het is belangrijk om dezelfde vergroting gebruiken bij het verzamelen beelden gedurende het experiment. Schakel het uitzicht vanaf het oculair van de microscoop op de computer scherm met behulp van de hendel aan de achterkant van de camera. Bij het schakelen tussen oculairen computerscherm bekijken, aanpassen van het uitzicht en zich dienovereenkomstig. </li><li> Voordat beeldvorming gevlekte culturen, wordt het deksel van de Petri plaat meestal verwijderd om het duidelijkste beeld te bieden. Dit is echter een optionele stap, zoals gevlekte culturen worden afgebeeld door het deksel met de installatie beschreven in stap 2.5 en 2.6. </li><li> Op elk tijdstip na de start van gerimpelde kolonievorming, let op het patroon van de gerimpelde kolonie ontwikkeling. De architectuur kan zich ontwikkelen van binnen naar buiten, of het buiten naar binnen Deze evaluatie biedt een mechanisme om de biofilms gevormd door verschillende stammen of onder verschillende omstandigheden te onderscheiden. </li><li> De diameter van de derde kolonie op elk tijdstip. Dit kan handmatig worden gedaan, of digitaal met behulp van een bijbehorende software programma. Als digitaal gedaan, gebruik maken van de Progres CapturePro software programma en de eerste de schaal bar afstemmen op de specifieke vergroting gebruikt in het experiment. Neem de schaal bar in gevangen elk beeld. </li><li> Om de kolonie diameter met behulp van de ImageJ softwareprogramma berekent, opent u elk beeld bestand. Standaardiseren van de schaalbalk als volgt: Selecteer de &quot;Rechte lijn optie&quot; op de werkbalk. Bedekken de geïntegreerde schaalbalk een rechte lijn van dezelfde lengte en breedte. Selecteer &quot;Set Scale&quot; van het tabblad &quot;te analyseren.&quot; In de &quot;bekende afstand&quot; vak, plaatst u de overeenkomstige lengte (bepaald door de oorspronkelijke schaal bar, dat wil zeggen, 2 mm) en selecteer &quot;OK&quot;. </li><li> Gebruik de &quot;rechte lijn&quot; optie om een ​​horizontale regel in te voegen over de plek. Onder het analyseren tab, selecteer &quot;maatregel&quot;. In de nieuwe resultaten venster zal de berekende lengte worden. Zorg voor een tweede meting door het invoegen van een loodrechte lijn over de plek. Herberekenen de diameter. Neem het gemiddelde van de twee metingen. De grafiek van de gemiddelde diameter van elke plek op elk tijdstip met behulp van een software programma, zoals Excel. </li><li> Het einde van het experiment wordt hetzij op een bepaald tijdstip of wanneer er geen verdereontwikkeling van de biofilm. Nadat het einde bereikt, consolideert de beelden in een cijfer (s) met het patroon ontwikkeling visualiseren tijd met een programma zoals Powerpoint. </li></ol> 3. Representatieve resultaten In deze experimenten gebruikt V. fischeri als een model organisme om biofilmvorming te bestuderen door het evalueren van de ontwikkeling van gerimpelde kolonies op een stevige agar oppervlak. Biofilm-producerende stammen van V. fischeri vorm kolonies met een uitgebreide 3D-architectuur binnen 40 uur (afb. 1) 8,9,14. Bij onderzoek gedurende een tijdsverloop, blijkt dat gerimpelde kolonievorming de controlestam initieert al ongeveer 12 uur na enting (afhankelijk van de specifieke omstandigheden) (Fig. 2) 9. Daarentegen wordt biofilmvorming door een vertegenwoordiger mutant vertraagd met ongeveer 4 uur, niet starten tot ongeveer 16 uur na de inoculatie 9. Repeats van deze experimenten suggereerde dat de timing relatief constant, waardoor de beoordeling semi-kwantitatieve 9. Een tweede semi-kwantitatieve maat biofilmvorming maakt gebruik van de verandering in diameter van de derde kolonie tijd. Zoals getoond in Fig. 3A, een vertegenwoordiger biofilm-bevoegde stam vormt kolonies die toenemen in complexiteit en de diameter ten opzichte van een representatieve stam die niet tot biofilms. Nauwkeurige metingen in de tijd van de diameters van de kolonies gevormd door de twee stammen gebleken dat de grootte van de biofilm-competent kolonies verhoogd op een grotere snelheid dan de biofilm negatieve kolonies en aan het einde tijdstip de twee verschillen van bijna 2 - vouw (Figuur 3B). Hoewel dus beelden van representatieve late tijd of &quot;eindpunt &#39;kolonie morfologie vaak in de literatuur kan extra semi-kwantitatieve gegevens worden verzameld die een beter begrip van de biofilm defect mogelijk.<img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig1.jpg" /> Figuur 1. Eindpunt assay. Deze figuur is een voorbeeld van een eindpunt assay met representatieve niet biofilm-vormende (links) en biofilm-vormende (rechts) stammen van V. fischeri. Deze beelden werden verzameld bij 40 uur na te spotten. Deze beelden werden gegenereerd met wild-type V. fischeri met een controle van vectoren (niet-biofilm-vormende) of een rscS tot overexpressie plasmide (biofilm-vormende) en maakten deel uit van de dataset verzameld voor Morris et al.., 2011. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig2.jpg" /> Figuur 2. Time-gangen-test. Het bovenste paneel bevat representatieve beelden van biofilmvorming door een biofilm-bevoegde controle-stam van V. fischeri over een geselecteerde tijd natuurlijk. Inleiding van biofilmvorming is duidelijk om 12 uur. Het onderste paneel bevat vertegenwoordiger images van een mutante stam van V. fischeri dat een vertraging (4 uur) in het begin van de gerimpelde kolonievorming loop van de tijd, met biofilmvorming initiëren op 16 uur na inoculatie vertoont. Merk op dat de 40 uren stammen lijken in de intensiteit en patronen van biofilmvorming, terwijl kleine verschillen tussen deze stammen alleen waargenomen bij de eerdere tijdstippen. Deze beelden zijn gegenereerd met rscS overexpressie wild-type en mutant sypE V. fischeri cellen en maakten deel uit van de dataset voor Morris et al.., 2011. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig3.jpg" /> Figuur 3. Colony diameter als semi-kwantitatieve analyse van biofilmvorming. (A) Tijd loop van biofilmvorming door een vertegenwoordiger van biofilm-vormende (bovenste panel) en niet-biofilm-vormende (onderste paneel) stammen van V. fischeri. Merk op dat de biofilm-vormende stam tot een sterkere stijging vertoontdiameter tijd ten opzichte van de biofilm niet vormende stam. Deze beelden werden gegenereerd met wild-type V. fischeri met daarin een rscS tot overexpressie plasmide (biofilm-vormende) of een controle van vectoren (niet-biofilm-vormende) en maakten deel uit van de dataset verzameld voor Morris et al.., 2011. (B) Een grafische weergave van de stijging van de kolonie diameter van de loop der tijd door de twee stammen in het paneel A. Deze gegevens zijn gegenereerd met behulp van de ImageJ-en Excel-software zoals beschreven in het protocol.

<ol><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 167-167 (2002).</li>
<li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+as+complex+differentiated+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 187(2002).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20(2005).</li>
<li>Branda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11621 (2001).</li>
<li>Beyhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+rugosity+and+biofilm+formation+in+Vibrio+cholerae%3A+comparison+of+VpsT+and+VpsR+regulons+and+epistasis+analysis+of+vpsT%2C+vpsR%2C+and+hapR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR.</a> J. Bacteriol. 189, 388(2007).</li>
<li>Enos-Berlage, J. L., Guvener, Z. T., Keenan, C. E., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+determinants+of+biofilm+development+of+opaque+and+translucent+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic determinants of biofilm development of opaque and translucent Vibrio parahaemolyticus.</a> Mol. Microbiol. 55, 1160(2005).</li>
<li>Merritt, J. H., Brothers, K. M., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SadC+reciprocally+influences+biofilm+formation+and+swarming+motility+via+modulation+of+exopolysaccharide+production+and+flagellar+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SadC reciprocally influences biofilm formation and swarming motility via modulation of exopolysaccharide production and flagellar function.</a> J. Bacteriol. 189, 8154-8154 (2007).</li>
<li>Yip, E. S., Geszvain, K., DeLoney-Marino, C. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+symbiosis+regulator+rscS+controls+the+syp+gene+locus%2C+biofilm+formation+and+symbiotic+aggregation+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The symbiosis regulator rscS controls the syp gene locus, biofilm formation and symbiotic aggregation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 62, 1586-1586 (2006).</li>
<li>Morris, A. R., Darnell, C. L., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+a+novel+response+regulator+is+necessary+for+biofilm+formation+and+host+colonization+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of a novel response regulator is necessary for biofilm formation and host colonization by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 82, 114(2011).</li>
<li>Nyholm, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Vibrio+fischeri+and+nonsymbiotic+bacteria+in+the+dynamics+of+mucus+secretion+during+symbiont+colonization+of+the+Euprymna+scolopes+light+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of Vibrio fischeri and nonsymbiotic bacteria in the dynamics of mucus secretion during symbiont colonization of the Euprymna scolopes light organ.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5113(2002).</li>
<li>Yip, E. S., Grublesky, B. T., Hussa, E. A., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+conserved+cluster+of+genes+promotes+symbiotic+colonization+and+%C3%8F%C6%9254-dependent+biofilm+formation+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel, conserved cluster of genes promotes symbiotic colonization and Ïƒ54-dependent biofilm formation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 57, 1485(2005).</li>
<li>Mandel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215(2009).</li>
<li>Graf, J., Dunlap, P. V., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+transposon-induced+motility+mutations+on+colonization+of+the+host+light+organ+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 176, 6986(1994).</li>
<li>Geszvain, K., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hybrid+sensor+kinase+RscS+integrates+positive+and+negative+signals+to+modulate+biofilm+formation+in+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The hybrid sensor kinase RscS integrates positive and negative signals to modulate biofilm formation in Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 190, 4437(2008).</li>
<li>Krasteva, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+VpsT+regulates+matrix+production+and+motility+by+directly+sensing+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP.</a> Science. 327, 866(2010).</li>
<li>Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+rdar+morphotype%2C+a+multicellular+behaviour+in+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae.</a> Cell Mol. Life. Sci. 62, 1234(2005).</li>
<li>Berleman, J. E., Chumley, T., Cheung, P., Kirby, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rippling+is+a+predatory+behavior+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rippling is a predatory behavior in Myxococcus xanthus.</a> J. Bacteriol. 188, 5888(2006).</li>
<li>Lee, K., Veeranagouda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicrocells+form+by+reductive+division+in+macroscopic+Pseudomonas+aerial+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ultramicrocells form by reductive division in macroscopic Pseudomonas aerial structures.</a> Environ. Microbiol. 11, 1117(2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit werk beschrijven we een semi-kwantitatieve methode om te beoordelen biofilmvorming met behulp van V. fischeri als modelorganisme. In het bijzonder hebben we gebruik maken van een dissectie microscoop met camera gehechtheid aan biofilmvorming en ontwikkeling als gerimpelde kolonievorming loop van de tijd op een stevige ondergrond agar te controleren. In dit protocol, schetsen we twee specifieke types van methodes die we vaak gebruiken om gerimpelde kolonievorming te beoordelen. De eerste is de end-point test, die ons in staat stelt om de definitieve, totale 3D-architectuur, patronen, en de diameter van een gevlekte cultuur te observeren op een geselecteerde &quot;definitieve&quot; tijdstip. Deze aanpak is vooral nuttig voor de beoordeling van mutant stammen of omstandigheden die leiden tot dramatische defecten in biofilmvorming. Echter, deze aanpak geen onderscheid tussen meer subtiele verschillen die op het moment punten voor de geselecteerde eindpunt. Om meer te voet te volgen gerimpeld kolonievorming, gebruiken we een tijdsverloop test, die ons in staat stelt het identificeren van de start van de wrinkled kolonievorming en kijken naar de ontwikkeling in de tijd. Als gevolg van deze aanpak kan meer subtiele verschillen in timing van gerimpelde kolonievorming, 3D-architectuur en patronen worden geïdentificeerd. Wij hebben deze tijdsverloop assay twee semi-kwantitatieve bepalingen van biofilmvorming te genereren. Ten eerste kan het tijdstip waarop een spanning begint te ontwikkelen 3D architectuur worden vergeleken met die van controlestammen. Wij hebben gevonden dat de vertraging in biofilmvorming een bepaalde mutant onder dezelfde omstandigheden vrij consistent 9. Bijvoorbeeld in de gegevens in Fig. 2 mutant vertoonde steeds ongeveer 4 h vertraging bij de inleiding biofilmvorming. Een tweede semi-kwantitatieve maat biofilmvorming de verandering in de omvang van de diameter van de gerimpelde kolonie (spot). Wij hebben gevonden dat de diameter van gerimpelde kolonies geleidelijk verschilt van die van niet-biofilm kolonies tot ongeveer een 2-voudig verschil eind tijdstip (Fig. 3 </strong&gt;) (Morris en Visick, niet gepubliceerde gegevens). Tot op heden hebben we niet waargenomen een fenotype zonder de ander (dat wil zeggen, biofilmvorming zonder een toename van de kolonie diameter) (niet-gepubliceerde gegevens), ook al blijft het mogelijk een aantal mutanten zullen zich anders gedragen. Inderdaad is het gerapporteerd voor V. cholerae dat sommige gerimpelde kolonies resulteren in een aanzienlijke verhoging van de kolonie diameter en andere niet 15. Toch kon beoordeling van de verandering in diameter tijd te helpen bij de karakterisering van mutanten mogelijk biofilm en / of een extra kwantitatieve meting van mutanten met vertragingen in de ontwikkeling. Van beide maatregelen van biofilmvorming (tijd diameter) vaststellen van het begin van gerimpelde kolonievorming gevoeliger, maar ook subjectieve dan het bepalen van de diameter van de vlek. Maar toch, beide maatregelen zorgen voor een semi-kwantitatieve beoordeling van een fenotype dat is zeer nuttig om biofilm onderzoekers, maar niet gemakkelijk vatbaar is voor quantification. Bij het uitvoeren van gespot gekweekte testen, is het belangrijk om te overwegen de milieu-omstandigheden waarin de gevlekte stammen worden gekweekt. Gerimpelde kolonievorming wordt vaak beïnvloed door verschillende omgevingsfactoren, met inbegrip van de beschikbaarheid van voedingsstoffen, temperatuur en vochtigheid. Ter vermindering van de variabiliteit tussen de experimenten, is het nuttig om deze voorwaarden te standaardiseren zoveel mogelijk (dat wil zeggen het standaardiseren van de agar platen tot een bepaald maximum en het kweken van de gevlekte stammen bij een gecontroleerde temperatuur). Om verdere controle voor verschillen tussen het spotten van experimenten, is het belangrijk om de juiste controle stammen binnen elke reeks experimenten. Tenslotte het interpreteren van de gegevens van deze assays is nodig om een ​​experiment meerdere keren (3 +), voert het bijzonder bij de beoordeling kleine verschillen in gerimpeld kolonievorming (bijvoorbeeld een vertragingstijd in biofilmvorming of patronen verschillen). Enkele beperkingen van dit protocol zijn: 1) vaststelING of cellen een defect in de groei hebben kan lastig zijn: groei van cellen in vloeibare cultuur kan niet altijd volledig zijn groei op vaste media, en een nauwkeurige bepaling van de groei van biofilm-vormende cellen, die samen kunnen blijven plakken, is wellicht niet mogelijk; 2) stammen met groeistoornissen zal problematisch zijn om te analyseren, 3) het kan niet mogelijk zijn om met een diameter verschillen tussen de stammen met subtiele biofilm fenotypen onderscheiden; 4) voor de stammen die niet opgroeien in een concentrische ring het misschien niet mogelijk is om nauwkeurig te meten veranderingen in doorsnede; 5) terwijl de patronen waar te nemen tijdens de biofilmvorming, is er geen manier om de patronen van de daaruit voortvloeiende biofilm te kwantificeren, en 6) is er geen manier om de Z-dimensie van de biofilm te meten met deze experimentele set-up . Ondanks deze beperkingen wordt in dit protocol biedt toch een middel om numerieke gegevens te verkrijgen om te helpen bij de beoordeling van gerimpeld kolonievorming. In dit protocol maken we gebruik van een specifieke beeldvormingsysteem (dat wil zeggen, een Zeiss stereomicroscoop en Progres CapturePro imaging software) te observeren en te evalueren gerimpeld kolonievorming. Het afbeeldingsstelsel hier beschreven sterk: het vermogen tot het begin van gerimpelde kolonievorming te detecteren en derhalve evalueren ontwikkeling met een tijdsverloop benadering wordt aanzienlijk verbeterd door het gebruik van een stereomicroscoop. Indien deze technologie niet beschikbaar is, kan het protocol worden aangepast voor gebruik met andere apparatuur, zoals een eenvoudige digitale camera met een zoom focus. Hoewel dit protocol richt zich op de beoordeling van gerimpelde kolonie ontwikkeling, het kan ook worden aangepast om vlies vorming, een vorm van biofilm die ontstaat wanneer de cellen zijn statisch groeien in vloeibare cultuur te evalueren. Dit protocol kan ook nuttig zijn bij de beoordeling van andere indicatoren van biofilmvorming, inclusief het opnemen van specifieke kleurstoffen in de bonte koloniën tijdens de biofilm ontwikkeling. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, kleurstoffen, zoals Congo Red en calcofluof die kunnen binden aan cellulose, een gemeenschappelijk deel van bacteriële biofilms 16. Bovendien, dit protocol, hoewel ontworpen voor gebruik met V. fischeri is niet beperkt tot dit organisme, maar kan worden gegeneraliseerd tot studie biofilmvorming in vele verschillende organismen, zoals Bacillus subtilis 4 Vibrio cholerae 5 Vibrio parahaemolyticus 6 en Pseudomonas aeruginosa 7, die vertonen alle gerimpeld kolonievorming. Tenslotte kan ook worden aangepast aan andere kolonie morfologie een ontwikkelingspatroon, zoals mogelijk de patronen die optreedt tijdens de groei van Myxococcus Xanthus 17 en lucht structuurontwikkeling Pseudomonas aeruginosa 18 hebben bestuderen. Dit protocol is dus van algemeen nut voor de microbiologie en de biofilm onderzoekers.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Zeiss STEMI 2000-C dissectiemicroscoop </td><td> Zeiss </td><td> 45505300000000000 </td><td> (Verkregen door Lukas Microscoop) </td></tr><tr><td> Progres C10 PLUS </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> 017953-602-26 </td><td> Camera bijlage (verkregen door middel van Lukas Microscoop) </td></tr><tr><td> CL 1500 EG koudlichtbron </td><td> Zeiss </td><td> 4355400000000000 </td><td> (Verkregen door Lukas Microscoop) </td></tr><tr><td> Progres CapturePro </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> Gratis software met maatschappelijke camera </td><td> Computer programma voor het vastleggen van beelden </td></tr><tr><td> Afbeelding J </td><td> NIH </td><td> Gratis software van:ij / download.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> Computerprogramma voor diameter metingen </td></tr></tbody></table>

een semi-kwantitatieve benadering van biofilmvorming met behulp van gerimpelde colony ontwikkeling te beoordelen

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, of oppervlakte-aangesloten gemeenten van de cellen ingekapseld in een extracellulaire matrix, vormen een gemeenschappelijke levensstijl voor veel bacteriën. Binnen een biofilm, bacteriële cellen vertonen vaak veranderd fysiologie, waaronder verbeterde resistentie tegen antibiotica en andere milieu-invloeden 1. Daarnaast kunnen biofilms spelen een belangrijke rol in de gastheer-microbe interacties. Biofilms ontstaan ​​wanneer bacteriën overgang van individuele, op planktonische cellen vormen complexe, multi-cellulaire gemeenschappen 2. In het laboratorium worden biofilms bestudeerd door de beoordeling van de ontwikkeling van specifieke biofilm fenotype. Een veel voorkomende biofilm fenotype omvat de vorming van gekreukt of geplooid bacteriële kolonies op vaste agar 3. Gerimpelde kolonievorming zorgt voor een bijzonder eenvoudige en nuttige manier te identificeren en karakteriseren van bacteriële stammen vertonen veranderde biofilm fenotypes, en milieu-omstandigheden die van invloed zijn biofilmvorming te onderzoeken. Wrinkled kolonievorming dient als een indicator van biofilmvorming in verschillende bacteriën, zowel Gram-positieve bacteriën, zoals Bacillus subtilis 4 en Gram-negatieve bacteriën, zoals Vibrio cholerae 5 Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7 en Vibrio fischeri 8. De mariene bacterie V. fischeri is uitgegroeid tot een model voor de biofilmvorming te wijten aan de cruciale rol van biofilms tijdens de gastheer kolonisatie: biofilms geproduceerd door V. fischeri ter bevordering van de kolonisatie van de Hawaiiaanse bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Belangrijk biofilm fenotypen in vitro correleren met het vermogen van V. fischeri cellen daadwerkelijk koloniseren gastdieren: stammen inbreuk biofilmvorming in vitro bezitten kolonisatie defect 9,11, terwijl stammen vertonen verhoogdebiofilm fenotypes zijn verbeterd voor kolonisatie 8,12. V. fischeri biedt daarom een eenvoudig model systeem om de mechanismen die bacteriën reguleren biofilmvorming en hoe biofilms invloed gastheer kolonisatie te beoordelen. In dit rapport beschrijven we een semi-kwantitatieve methode om te beoordelen biofilmvorming met behulp van V. fischeri als modelsysteem. Bij deze methode wordt de zorgvuldige spotten van bacteriële culturen op bepaalde concentraties en hoeveelheden op vaste agar media; een gevlekte cultuur is synoniem voor een enkele bacteriële kolonie. Deze &#39;gespot cultuur&#39; techniek kan worden gebruikt om de bruto biofilm fenotypes te vergelijken op een enkele, bepaalde tijd-punten (eindpunt assays), of op te sporen en subtiele biofilm fenotypes karakteriseren door de tijd-gangen-assays van biofilm ontwikkeling en metingen van de kolonie met een diameter , die wordt beïnvloed door biofilmvorming. Aldus deze techniek is een semi-kwantitatieve analyse van biofilmvorming perdoorzenden van de evaluatie van de timing en patroonvorming van de gerimpelde kolonie ontwikkeling en de relatieve omvang van de te ontwikkelen structuur, kenmerken die verder gaan dan de eenvoudige algemene morfologie.

Wij bieden een eenvoudig, semi-kwantitatieve methode om biofilm vorming te onderzoeken<em&gt; In vitro</em&gt;. Deze methode maakt gebruik van de Zeiss STEMI 2000-C stereomicroscoop (met camera bijlage) om zowel de timing en het patroon van biofilmvorming te volgen, zoals beoordeeld door de ontwikkeling van gerimpelde kolonies.

Een semi-kwantitatieve benadering van biofilmvorming Met behulp van Gerimpelde Colony ontwikkeling te beoordelen

Biofilms, of aan het oppervlak gehechte gemeenschappen van cellen ingekapseld in een extracellulaire matrix, vormen een veelvoorkomende levenswijze voor veel bacteriën. Binnen een ...

Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in de biofilmvorming te identificeren en te meten door de ontwikkeling van gerimpelde kolonies in de loop van de tijd te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst de betreffende bacteriële stammen in vloeibare cultuur te kweken. De tweede stap is het spotten van de culturen op nutriëntenagar.Vervolgens worden de spots in de tijd gevolgd om het tijdstip te bepalen waarop ze driedimensionale structuren beginnen te ontwikkelen, wat wijst op de start van de vorming van gerimpelde koloniën. De ontwikkeling van de koloniemorfologie wordt gevolgd totdat er geen verdere veranderingen meer zichtbaar zijn. Uiteindelijk wordt microscopie van de spots gebruikt om op semi-kwantitatieve wijze verschillen in biofilmontwikkeling in de tijd door specifieke stammen of onder specifieke condities aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het een semi-kwantitatieve analyse van bacteriële biofilmvorming mogelijk maakt aan de hand van de ontwikkeling van een gerimpelde koloniemorfologie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de biofilmvorming bij Vireo fishery, kan deze ook worden toegepast voor de karakterisering van biofilmfenotypes in andere bacteriële systemen, zoals basc, slus, pseudomonas osa en vial cholera. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we bacteriële mutanten identificeerden die een vertraging in de ontwikkeling van de gerimpelde kolonievorming vertoonden.Biofilmvorming wordt over het algemeen beïnvloed door de celdichtheid en de groeisnelheid. Daarom moeten vóór het beoordelen van de gerimpelde koloniemorfologie de groeisnelheid en opbrengst van de betreffende stammen worden vastgesteld om de groeisnelheid te bepalen. Meet de toename van de optische dichtheid of OD van elke stam in de tijd en stel een groeicurve op om de opbrengst of het uiteindelijke celgetal te bepalen.Een celplaatassay kan worden gebruikt. De bacteriële stammen van belang worden gekweekt in vloeibare cultuur, waarna verdunningen van de culturen op agarplaten worden geplaatst. Na incubatie wordt het aantal levensvatbare cellen berekend en grafisch weergegeven zoals hier getoond.Het is daarnaast belangrijk om de beste spottingcondities te bepalen die de meest duidelijke verschillen onthullen tussen de controle en de mutante van belang. Om dit te bereiken vóór het spotten van groeistammen uit vloeibare culturen onder diverse condities, zoals verschillende media of temperaturen, en in verschillende groeistadia, zoals de exponentiële of stationaire fase, spot men 10 µL cultuur van verschillende celdichtheden op de geschikte media en incubeert men deze bij de gewenste temperatuur totdat de koloniemorfologieën zichtbaar worden. Op deze manier kan een optimale start-OD worden bepaald voor een gegeven set stammen of condities om met deze procedure te beginnen.Inoculeer v Fisher-oogcellen van agarplaten in vijf milliliter LB-zout of LBS-medium met de benodigde antibiotica; incubeer onder schudcondities bij 28 °C gedurende de nacht. Subcultiveer de volgende ochtend de cellen met een verdunning van 1:100 in vijf milliliter vers LBS-medium; incubeer onder dezelfde condities totdat de cellen de gewenste OD bij 600 nm hebben bereikt. Voor Vibrio fii worden de beste resultaten verkregen wanneer spots worden gegenereerd uit culturen met een OD van ongeveer 0,2. Pipetteer vervolgens één milliliter van elke cultuur in een microcentrifugebuis en centrifugeer op maximale snelheid.Verwijder gedurende één minuut het supernatant door aspiratie en resuspendeer de pellet in één milliliter steriel, 70% kunstmatig zeewater of een SW-centrifuge. De cellen; opnieuw zal deze wasstap residuen van het medium en extracellulaire componenten verwijderen. Verwijder na centrifugatie het supernatant en resuspendeer de gewassen pellet in één milliliter 70% A SW om ervoor te zorgen dat elk monster het aantal cellen bevat zoals geschat op basis van de OD bij 600 nanometers.Breng indien nodig correcties aan door meer geconcentreerde monsters te verdunnen met extra 70%A SW. Breng 10 microliters van elke cultuur in stippen aan op LBS-platen die de benodigde antibiotica bevatten. Zorg ervoor dat u de pipet met uw vinger net boven het agar-oppervlak houdt en de vloeistof verticaal en niet onder een hoek aanbrengt. Laat de vloeistof langzaam uitstromen voor een uniforme verdeling van de stip; voeg de juiste positieve en negatieve controles toe op dezelfde plaat.Bij het beoordelen van de vorming van gerimpelde kolonies op kleine platen kan AFL-variatie de ontwikkeling van de biofilm beïnvloeden. Het moeilijkste aspect van deze procedure is het vaststellen van het begin van de vorming van gerimpelde kolonies. Soms is dit pas duidelijk nadat de ontwikkeling al is ingezet.Om het begin van de ontwikkeling van rimpelkolonies vast te leggen, nemen we elk uur tijdspunten binnen een specifiek tijdsbestek. Dit stelt ons ook in staat om terug te kijken en vergelijkingen te maken nadat de ontwikkeling is begonnen. Om ervoor te zorgen dat de gespotte cultuur gelijkmatig verdeeld blijft, laat u de spotten drogen voordat u de plaat naar de incubator verplaatst; keer de platen om en incubeer ze bij 28 °C.Een manier om de morfologie van de geplaatste culturen te beoordelen is via een eindpuntanalyse, waarbij de vorming van gerimpelde koloniën wordt geëvalueerd op een vooraf vastgesteld tijdstip na het plaatsen. Dit is een representatief resultaat van een eindpuntanalyse waarin de vorming van gerimpelde koloniën werd beoordeeld. 40 uur na het plaatsen is links een niet-biofilmvormende stam van Vibrio FII te zien en rechts een biofilmvormende stam.De endpoint-assay is nuttig voor stammen die ernstige defecten in de biofilmvorming vertonen of waarvan wordt verondersteld dat ze dit vertonen. Een andere assay voor het beoordelen van de koloniemorfologie is een tijdskursus-assay, waarbij de vorming van gerimpelde koloniën over een bepaalde periode na het spotten wordt beoordeeld om de tijd na het spotten eenvoudig bij te houden. Stel een timer in om de tijd bij te houden.In deze demonstratie wordt de morfologie van de groeiende plek elk uur gemonitord, beginnend 12 tot 15 uur na het spotten, met behulp van een dissectiemicroscoop met camera-accessoire en beeldacquisitie en beeldanalyse. Softwareprogramma's worden gebruikt om de koloniemorfologie waar te nemen en te documenteren en om het begin en de progressie van de vorming van gerimpelde koloniën te beoordelenen. Voor het maken van beelden van gespotte culturen wordt het deksel van de Petrischaal doorgaans verwijderd om het helderste beeld te verkrijgen.Hier worden de plekken van onderaf verlicht via een transparante glazen tafel met een koudlichtbron, terwijl de beelden van bovenaf worden vastgelegd. Deze opstelling is optimaal voor het in beeld brengen van de ontwikkeling van gerimpelde kolonies, omdat Vibrio fischeri-kolonies doorschijnend zijn. Pas, om de ontwikkeling van gerimpelde kolonies optimaal te visualiseren, zowel de lichtintensiteit als de reflectiehoek onder de bacteriële kolonies aan, zodat de driedimensionale morfologie van de ontwikkelende biofilms kan worden onderscheiden.Bepaal de optimale belichtingsomstandigheden die het sterkste contrast bieden tussen de gevlekte kolonie en de omringende agarachtergrond. Het is belangrijk om gedurende het gehele experiment dezelfde vergroting te gebruiken bij het verzamelen van beelden. Gebruik hiervoor de hendel aan de achterzijde van de camera om het beeld van het oculair van de microscoop naar het computerscherm te schakelen, pas het beeld aan, stel scherp en maak vervolgens de opname. Leg passende beelden vast om het begin en de ontwikkeling van de rimpelige kolonievorming te documenteren. Het experiment is voltooid wanneer er geen verdere ontwikkeling van de biofilm meer plaatsvindt.Aan het einde van de verzamelde experimenten worden de afbeeldingen samengevoegd tot figuren om de ontwikkeling van het patroon in de loop van de tijd voor elke stam of conditie te visualiseren. Let op hoeveel tijd er verstrijkt vanaf het moment van inoculatie tot het tijdstip waarop de vorming van gerimpelde kolonies begint; de start van de vorming van gerimpelde kolonies wordt gedefinieerd als het tijdstip waarop de vorming van patronen en 3D-structuren voor het eerst zichtbaar is. In dit voorbeeld is de initiatie van biofilmvorming duidelijk zichtbaar bij 12 uur voor een biofilm-competente controlestam van Vibrio FII, afgebeeld in het bovenste paneel.In het onderste paneel is een representatieve afbeelding te zien van een mutante stam van Vibrio FII die een vertraging van vier uur vertoont in de start van de vorming van gerimpelde kolonies over de tijd, waarbij de biofilmvorming start 16 uur na inoculatie. Let erop dat hoewel er subtiele verschillen tussen deze stammen worden waargenomen op de eerdere tijdstippen bij 40 uur, de stammen vergelijkbaar lijken in de intensiteit en het patroon van biofilmvorming op elk tijdstip na de start van de vorming van gerimpelde kolonies. Het patroon van de ontwikkeling van de gerimpelde kolonies dient te worden opgemerkt.De architectuur kan zich van buiten naar binnen ontwikkelen, zoals geïllustreerd in paneel A, of van binnen naar buiten, zoals geïllustreerd in Paneel B. Deze beoordeling biedt een mechanisme om biofilms die zijn gevormd door verschillende stammen of onder verschillende omstandigheden te onderscheiden. Een tweede semi-kwantitatieve maatstaf voor biofilmvorming maakt gebruik van de veranderende koloniediameter van de ontwikkelende kolonie in de loop van de tijd. Zoals getoond in het bovenste paneel, vormt een representatieve biofilm-competente stam kolonies die in complexiteit en diameter toenemen.In tegenstelling hiermee vormt een andere stam, getoond in het onderste paneel, geen biofilms. Ten slotte toont deze figuur een grafische weergave van de toename van de koloniediameter in de loop van de tijd. Van dezelfde twee stammen wordt de biofilm-competente stam weergegeven door witte cirkels.Terwijl de stam die geen biofilms vormt, wordt weergegeven door zwarte vierkantjes. Deze analyse maakte duidelijk dat de grootte van de biofilm-competente kolonies sneller toeneemt dan die van de biofilm-negatieve kolonies, en dat het verschil aan het eindpunt bijna tweevoudig was. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om elke stam zorgvuldig uit te zetten en om de initiële vorming van gerimpelde kolonies voor elke stam te documenteren.Na dit protocol kunnen andere methoden, zoals een iCal-assay of kristalbrede kleuring, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de betrokken processen en de biofilmvorming te beantwoorden.

a-semi-quantitative-approach-to-assess-biofilm-formation-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De test beschrijft een snelle wijze te vroeg biofilmvorming in bacteriën en schimmels te meten. Deze methode maakt gebruik van een microtiterplaat als substraat voor microbiële biofilm en de vorming van biofilm wordt gevisualiseerd met behulp van kristalviolet stam. De test geeft zowel een kwalitatieve of kwantitatieve test voor de vroege biofilmvorming.

Microtiter Dish biofilm vorming Assay

Dit artikel beschrijft de procedure voor de vorming en visualisatie van een bacteriële biofilm gegroeid binnen een 8-well kamer...

In vitro biofilmvorming in een 8-well Kamer Dia

Source: Bucher, T., et. al., Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. J. Vis. Exp.(2016)This video demonstrates the preparation of mature bacterial biofilm colonies for high-resolution imaging. It covers fixation, dehydration, mounting, and metal coating steps to preserve and visualize biofilm morphology.

Preparation of Bacterial Biofilm Colonies for Morphological Analysis

The video demonstrates a solid-phase adherence assay for assessing biofilm formation. In a multi-well plate, bacteria in bile salt-supplemented media adhere to solid surfaces, forming biofilms, which is confirmed by colorimetry through crystal violet staining and ethanol treatment.

A Solid Phase Adherence Assay to Assess Biofilm Formation

Een protocol voor de gelijktijdige kwantificering en vergelijking van drie cellulaire en extracellulaire componenten binnen biofilms wordt gepresenteerd. De methodologie omvat het gebruik van confocale laserscanningmicroscopie, software voor biofilmstructuuranalyse en -visualisatie, en statistische analysesoftware.

Concurrent Kwantificering van Cellulaire en extracellulaire componenten van biofilms

Deze studie presenteert de ontwikkeling van reproduceerbare methodologieën om biofilmremmers en hun effecten op Bacillus subtilis multicellulariteit te bestuderen.

Methodologieën voor het bestuderen<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms als een model voor het karakteriseren van Small Molecule biofilminhibitoren

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode te groeien en kwalitatief analyseren bacteriële biofilms op schimmeldraden door confocale en elektronenmicroscopie.

Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy

We beschrijven fixatie, paraffine insluiten en dunne vectorafbeeldingsbestanden technieken voor microbiële kolonie biofilms. In bereid monsters, kunnen biofilm substructuur en verslaggever expressiepatronen worden gevisualiseerd door microscopie.

Paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie Biofilms voor microscopische analyse

Dit protocol beschrijft de bereiding van het inoculum, de kwantificering van de biofilm op microtiterplaten met behulp van kristalviolette kleurstof, het aantal levensvatbare stoffen in biofilms en de visualisatie van biofilms van Acinetobacter.

Kwantificerings-, levensvatbaarheidsbeoordeling en visualisatiestrategieën voor Acinetobacter-biofilms

Dit protocol levert een modulaire BSL-2 workflow die kristal-violet biomassa-assays, time-lapse fase-contrast kinetiek, confocale 3D/matrix mapping, SEM-ultrastructuur en een in vivo hamsterinfectiemodule combineert om de functionele rol van Leptospira biofilm te cultiveren, kwantificeren, karakteriseren en onderzoeken, waardoor gestandaardiseerde evaluatie van mutanten en anti-biofilminterventies in laboratoria mogelijk is.

Een modulaire workflow voor kwantitatieve, structurele en functionele analyse van leptospira-biofilms

Leer een semi-kwantitatieve methode om biofilmvorming te bestuderen via gerimpelde koloniemorfologie. Deze techniek maakt het mogelijk om bacteriële fenotypen te vergelijken onder verschillende omstandigheden.

Een semi-kwantitatieve benadering van biofilmvorming Met behulp van Gerimpelde Colony ontwikkeling te beoordelen

Meer video's verkennen