Muis Model van Intraluminale mCaO: herseninfarct Evaluatie door cresyl Violet Staining

Het algemene doel van deze procedure is om een ischemisch infarct bij muizen na te bootsen. Eerst wordt de arteria carotis communis tijdelijk afgebonden, terwijl de arteria carotis externa zo distaal mogelijk permanent wordt afgebonden. Een tweede, licht aangespannen tijdelijke hechting wordt geplaatst op de ECA boven de bifurcatie.

De tweede stap is het afklemmen van de arteria carotis interna met reverse-action pincetten om bloedingen te voorkomen. Snijd vervolgens de ECA door tussen de permanente en tijdelijke ligaturen. Daarna wordt het met siliconen gecoate monofilament in de ECA ingebracht.

Vervolgens wordt de ECA omgekeerd om het monofilament in de ICA in te brengen tot aan de basis van de middelste cerebrale slagader. Eén uur later wordt de bloedstroom hersteld door het monofilament te verwijderen, om het herstel van de bloedstroom na lysis van een tromboembolische klonter bij mensen na te bootsen. Uiteindelijk kan het neurologische defect, dat het succes van T-M-C-A-O en de ernst van het infarct weerspiegelt, direct na reperfusie en op verschillende tijdstippen na reperfusie worden geëvalueerd.

Cyan-beeldsoftware van de NIH wordt gebruikt om het infarctvolume te berekenen op representatieve hersensecties die zijn gekleurd met Crystal Violet. Een van de belangrijkste voordelen van de transiënte occlusie van de middelste hersenslagader via de intraluminale filamenttechniek is dat het ischemische beroerte bij patiënten nabootst door het herstel van de bloedstroom; de ontwikkeling van deze procedure bij muizen biedt bovendien de mogelijkheid om genetische labelingsinstrumenten te gebruiken om de rol van een doeleiwit te identificeren. Voor het induceren van een beroerte wordt de transiënte occlusie van de middelste hersenslagader uitgevoerd bij mannelijke C57BL/6-muizen van twee tot drie maanden oud met een gewicht tussen 22 en 28 gram.

Dit protocol is goedgekeurd door de Bioethics Care Committee van het IRCM om de reproduceerbaarheid van het infarctvolume te vergroten. We maken gebruik van herbruikbare 12 millimeter lange, 6-0 siliconen-gecoate monofilamenten van de Doco Corporation. Twee uur voor de operatie.

Injecteer een muis intraperitoneaal met buprenorfine in een dosis van 0.03 mg/kg. Om de procedure te starten, anestheseer de muizen met 5% isofluraan en handhaaf de anesthesie bij 2.5% isofluraan. Gebruik een warmtemat om de lichaamstemperatuur van de muis tijdens de operatie constant te houden en desinfecteer de huid van de muis met 70% ethanol of Betadine. Maak vervolgens een mediane incisie in de nek en trek de weke delen uit elkaar onder een stereomicroscoop.

Disseceer de nek van de muis met een botte dissectie om de trachea bloot te leggen. Trek vervolgens de spieren opzij om de arteria carotis te lokaliseren. Disseceer voorzichtig de linker arteria carotis communis uit het omringende weefsel.

Plaats een tijdelijke 5-0 zijden hechting, geknipt in segmenten van 20 millimeter, rond de arterie. Let erop dat de nervus vagus niet beschadigd raakt. Scheid vervolgens de bifurcatie van de linker arteria carotis interna (ICA) en de arteria carotis externa (ECA) en plaats een permanente hechting rond de ECA zo distaal mogelijk.

En een andere tijdelijke hechting op de ECA boven de bifurcatie. Clip vervolgens de linker ICA met behulp van reverse action tweezers om bloedingen te voorkomen. Wees opnieuw zeer voorzichtig om de nervus vagus niet te beschadigen.

Maak een klein gaatje in de ECA vóór de bifurcatie naar de ECA en de ICA, en tussen de permanente en tijdelijke hechtingen die eerder zijn aangebracht. Voer vervolgens een siliconen gecoate monofilament hechtdraad van 12 millimeter 6-0 in de ECA in, knip de ECA volledig door en keert de monofilament om naar de ICA. Knoop de hechting stevig aan om bloedingen te voorkomen en verwijder de pincet met omkeerbare werking.

Voer vervolgens het monofilament in de cirkel van Willis in totdat het monofilament de basis van de MCA blokkeert. De insertie vindt plaats op ongeveer negen tot 10 millimeter voorbij de bifurcatie van de ECA en CCA. Over het algemeen zal het monofilament geblokkeerd raken en niet meer kunnen bewegen.

Zorg ervoor dat de arteria palatina niet wordt gepenetreerd. Knoop de hechting op de ECA stevig aan om het filament op zijn plaats te fixeren. Sluit nu de huid met een auto clip wondsluitingssysteem.

Injecteer één milliliter zoutoplossing subcutaan en plaats de muizen onder een infraroodverwarmingslamp tijdens de periode na de occlusie, welke 60 minuten bedraagt. Anestheseer de muizen zoals voorheen en verwijder de autoclips; open de hechting op de ECA lichtjes zodat het monofilament kan worden teruggetrokken en het bloed opnieuw kan perfunderen. Knoop vervolgens de tijdelijke hechting op de ECA permanent af om bloedverlies te voorkomen.

Eén uur na het infarct wordt het monofilament verwijderd en bewaard voor hergebruik. Verwijder vervolgens de tijdelijke hechting op de CCA om de bloedcirculatie te herstellen. Sluit de wond en de subcutane laag.

Injecteer nog eens één milliliter zoutoplossing in de muizen. Nadat is vastgesteld dat het dier zijn mobiliteit heeft teruggewonnen, wordt het teruggeplaatst in de kooi en wordt de helft van de kooi op het warmtekussen geplaatst, zodat de muizen hun eigen omgeving kunnen kiezen. 12 uur na de operatie ontvangen de muizen bij alle sham-operaties nog een dosis buprenorfine.

Alle procedures zijn identiek, behalve dat het monofilament na de operatie niet wordt ingebracht. Het neurologisch deficit wordt geëvalueerd om het succes van de T-M-C-A-O te bevestigen en de efficiëntiescore te bepalen; de neurologische deficiënties van de muizen worden 1, 24, 48 en 72 uur na perfusie beoordeeld op een zespuntsschaal als volgt: nul staat voor normaal, één staat voor mild, draaien met of zonder inconsistent krullen wanneer men ze bij de staart optilt. Meer dan 50% van de pogingen om naar de contralaterale zijde te krullen.

Twee staat voor een milde, consistente krulling in meer dan 50% van de pogingen om naar de contralaterale zijde te krullen. Drie staat voor een consistente, sterke en onmiddellijke krulling. De muis behoudt een gekrulde positie gedurende meer dan één tot twee seconden.

Met de neus die bijna de staart raakt. Vier staat gelijk aan ernstige kromming. Progressie naar 'barreling', verlies van loop- of schrijfreflex, vijf staat gelijk aan comateus of een hoopje.

Na perfusie met PBS-oplossing worden de hersenen snel bevroren in isopentaan en bewaard bij -80 °C. Let op dat muizenhersenen, afhankelijk van de geplande immunohistochemische studies, ook geperfuseerd kunnen worden met 4% paraformaldehyde. Gebruik vervolgens een cryostaat om coronale hersensecties van 17 µm te snijden op 30 objectglazen.

Plaats om de 30 coupes één sectie op dezelfde objectglas. Kleur vervolgens het eerste en het vijftiende objectglas met kristalviolet. Gebruik voor een nauwkeurigere schatting van het volumeschade een beeldanalysesysteem zoals Scion image van de NIH om de laesie-diepte en het infarctgebied te evalueren, welke wit verschijnen in de linker- en rechterhersenhelft.

Herhaal deze D-beperking op alle hersencoupes. Bereken het infarctvolume in willekeurige eenheden en druk deze uit als een percentage van het contralaterale, niet-geblesseerde gebied voor elke sectie. Bewaar de overige coupes bij minus 80 °C voor immunohistochemische studies.

De evaluatie van de neuroscore bevestigt het succes van T-M-C-A-O bij de muizen die zijn onderworpen aan de intraluminale procedure. Zoals hier te zien is, wordt een consistente, sterke en gemiddelde krulling waargenomen en behoudt de muis een gekrulde positie gedurende meer dan één tot twee seconden, waarbij de neus de staart bijna raakt. In ons experiment vertoonden alle muizen ten minste een milde consistente krulling, wat gedurende de hele testperiode overeenkomt met een neuroscore van twee.

Kressel-violetkleuring werd uitgevoerd om de omvang van het herseninfarct te evalueren. Na de T-M-C-A-O worden hier representatieve coronale doorsneden van de muizenhersenen getoond, gekleurd met Kressel-violet 72 uur na reperfusie. Het infarctgebied, voornamelijk het striatum, de cortex en aangrenzende hersengebieden, die zijn gelabeld, verschijnt in het wit omdat deze niet door Kressel zijn gekleurd.

De violette kleur hier geeft het letselvolume weer, wat het witte gedeelte van de rechterhemisfeer is, uitgedrukt als een percentage van het contralaterale niet-gelesioneerde gebied in de linkerhemisfeer. Het infarctvolume bij mannelijke C 57 black six muizen na een ischemische beroerte vertegenwoordigt ongeveer 70% van de niet-gelesioneerde hemisfeer. Deze procedure zorgt voor een sterke reproduceerbaarheid van de laesie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een transiënte ischemische beroerte bij muizen induceert. Bovendien biedt de benadering via de quiz viol om uw infarctvolume in de hersenen te meten u het grote voordeel dat er veel materiaal beschikbaar is om relevante markers via immunochemie te testen. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.