Collectie Protocol for Human Pancreas

Het algemene doel van deze procedure is om de menselijke pancreas te dissekeren op een manier die de anatomische oriëntatie behoudt. Dit wordt bereikt door het duodenum en de milt van de pancreas te verwijderen, om vervolgens overtollig vet en vaten van de pancreas weg te halen. De tweede stap is om het anterieure oppervlak met blauwe inkt en het posterieure oppervlak met zwarte inkt te inkleuren.

Vervolgens wordt de pancreas in drie regio's verdeeld. Elke regio wordt daarna dwars in gelijkmatige plakken gesneden en geplaatst in paraffinecassettes, OCT-matrijzen, of verder fijngehakt en in vials geplaatst. Uiteindelijk worden monsters verzameld uit alle drie de regio's van de pancreas, waarbij de correcte anatomische oriëntatie behouden blijft voor toekomstige analyse.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het onderzoek naar diabetes type 1, zoals de mechanismen die ten grond liggen aan het verlies van bètacelmassa of -functie, en de aard van de aanval door immuuncellen. Een visuele demonstratie van de verwerkingsmethode voor de pancreas is cruciaal, aangezien het behoud van de in vivo oriëntatie van de pancreas zorgvuldigheid vereist. De procedure zal worden gedemonstreerd door Linda Snyder, histotechnoloog, en Emily Montgomery, biologisch wetenschapper in mijn laboratorium.

Begin met het klaarmaken van alle materialen die nodig zijn voor de procedure. Label eerst de cassettes waarin de paraffineblokjes worden geplaatst met een donoridentificatie, het type monster, het aliquotnummer en eventuele aanvullende informatie. Label vervolgens de OCT-vormpjes op dezelfde wijze.

Knip voldoende stukken aluminiumfolie af om elk OCT-blok in te wikkelen en leg deze apart voor later gebruik. Bereid alle vials voor die nodig zijn om de verse en bevroren monsters te bewaren. Voeg indien van toepassing RNA later en RPMI-medium toe.

Bereid vervolgens de werkplekken voor door dissectieplanken, gesteriliseerde instrumenten en alle overige benodigdheden voor de procedure zowel in een biosafety-kast als op een aanrecht te plaatsen. Zorg dat alle cassettes en OCT-vormen in de volgorde van gebruik klaarstaan. Maak een vriesbad door voldoende isopentaan toe te voegen om het droogijs op de bodem van een piepschuimdoos te bedekken.

Om de dissectie te beginnen, verwijdert u het duodenum en de milt. Begin met het scheiden van het duodenum en de pancreas aan één uiteinde en ga door tot ze volledig zijn losgemaakt. De milt is losjes bevestigd en is eenvoudig te verwijderen uit het vet en de pancreas.

Reinig vervolgens de pancreas door vreemde vetvaten en zenuwen te verwijderen met een combinatie van stompe en scherpe dissectie. Bewaar het vet en de lymfeklieren apart om deze later te verwerken. Plaats de gereinigde pancreas op een dissectieplank die bedekt is met papieren handdoekjes.

Het handhaven van de juiste oriëntatie van de pancreas is het moeilijkste aspect van deze procedure. Om succes te garanderen, worden de anterieure en posterieure oppervlakken ingekleurd met inkt van verschillende kleuren. Doop een wattenstaafje in blauwe inkt, verspreid de inkt over het anterieure oppervlak van de pancreas en dep het overschot weg.

Doop vervolgens een nieuwe applicator in zwarte inkt en verdeel deze over het posterieure oppervlak van de pancreas. Breng de pancreas terug naar de normale oriëntatie. Met het anterieure oppervlak naar boven is de pancreas nu klaar om in drie secties te worden gesneden.

Snijd eerst de overgang tussen de kop en het lichaam door. Verdeel vervolgens het resterende gedeelte in ongeveer gelijke delen om het lichaam en de staart te scheiden en noteer het gewicht van elk deel van de pancreas, beginnend met het kopgedeelte.

Verdeel elk gebied in secties van ongeveer 0,5 centimeter door transversaal te snijden, vergelijkbaar met het snijden van een brood. Zodra elk deel van de pancreas is gesneden, verwijdert u de laatste sectie van het kopgebied, namelijk de sectie van de overgang tussen de kop en het lichaam, en plaatst u deze op een apart dissectiebord. Hak deze sectie in kleine stukjes en verdeel de stukjes gelijkmatig over gelabelde cryovials met en zonder RNA.

Vervolgens worden de vials ingevroren, volgens de standaardprocedures. Herhaal deze procedure voor het sectie van de overgang tussen het lichaam en de staart.

Zodra de fijngehakte monsters zijn verzameld, worden alle dwarsdoorsneden naar rechts gekanteld. Om en om worden secties van elke regio verwijderd. Voor paraffine- en OCT-blokken wordt de eerste sectie voor paraffine-blokkering verwijderd.

Als een sectie te groot is, snijd deze dan doormidden. Label de cassettes als A en B. Als het stuk nog steeds te groot is, snijd dan elke sectie loodrecht op de vorige snede en label de cassettes vervolgens van A tot en met D in met de klok mee. Zoals hier te zien is, plaatst u de cassette zodanig dat het label zich links bevindt.

Plaats vervolgens het weefsel in de cassette en sluit het deksel. Breng de cassette over naar een container met neutraal gebufferde formaline. Nummer de blokjes sequentieel binnen elke regio, beginnend met de meest mediale sectie voor OCT-blokjes.

Giet een dunne laag OCT-medium in een vooraf gelabelde mal. Bedek het weefsel met OCT-medium voordat u het introduceert en vries het monster snel in voor later gebruik, waarbij u terugkeert naar het weefsel dat eerder apart was gezet. Isoleer de pancreatische lymfeklieren door het vet en het bindweefsel rondom het klierkapsel weg te snijden. Plaats de klieren in een steriele schaal met DMEF en versnipper grote klieren in stukjes van maximaal 0,5 centimeter.

Zodra de pancreatische lymfeklieren zijn geïsoleerd, wordt het weefsel verdeeld over de voorbereide vials en cassettes voor verdere verwerking. Na het verwerken van de lymfeklieren wordt de milt fijngehakt en op soortgelijke wijze bewaard. Om het duodenum te verwerken, wordt een bevochtigd gaasje gebruikt om het slijm van het slijmvlies te verwijderen, waarna het slijmvlies wordt afgeknipt en in secties wordt gesneden.

Verdeel de mucosa-monsters zoals eerder getoond. Met deze procedure worden representatieve monsters van elk deel van de pancreas verzameld, zoals hier te zien is. De gewichten van de kop-, lichaam- en staartregio waren ongeveer gelijk.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe een menselijke pancreas kan worden verwerkt tot verschillende monstertypes, in het bijzonder het vermogen om de oriëntatie te behouden, alsmede hoe lymfeklieren uit het peripancreatische vet kunnen worden geïsoleerd.