Name: Collectie Protocol for Human Pancreas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Leer een dissectieprotocol voor het menselijk pancreas waarbij anatomische oriëntatie behouden blijft. Deze methode ondersteunt diabetesonderzoek door regionale isletanalyse mogelijk te maken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken de donateurs de familie en de Organ Procurement Organisaties die betrokken zijn bij dit onderzoek en Maria Martino en Irina Kusmartseva voor hun deskundige hulp. Dit werk werd gefinancierd door de Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) ter ondersteuning van het netwerk voor Pancreatic Organ Donors met diabetes.

1. Set-up <ol><li> Label cassettes voor paraffine blokken handmatig met een potlood, of automatisch met een cassette printer. Neem de donor identifier (CaseID), monster type, aliquot-nummer, en eventuele aanvullende unieke identificatie (zaak werkblad, <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">bijlage 1</a> ). </li><li> Label oktober mallen als voor cassettes met een permanent marker. Knip 5-10 cm rechthoeken van aluminium folie. </li><li> Print of handmatig label met permanente marker alle flacons en tubes. Neem genoeg flesjes voor gehakt snap bevroren monsters en buizen met RPMI media voor verse zendingen. Voor de snap bevroren flesjes met RNAlater, voeg 1 ml RNAlater aan elke cryovial. </li><li> Set-up dissectie borden in bioveiligheid kap en aanrechtbladen met gesteriliseerde dissectie instrumenten (tangen, scalpels, messen, gaasjes (4x4)) en cassettes en LGO-schimmels gerangschikt in volgorde van gebruik. </li><li> Maak een bevriezing bad door de invoeringdroogijs een middelgrote Styrofoam vak (10x10 cm) tot een diepte van ten minste 3 cm en voeg isopentaan tot droog ijs volledig bedekt. </li><li> Optioneel: Vul een klein Dewar vat met vloeibare stikstof. </li><li> Als pancreas nodig voor elektronenmicroscopie (EM) bereiden TAAB fixeermiddel door toevoeging 1,25 ml 16% paraformaldehyde, 1,25 ml 8% glutaraldehyde, en 7,5 ml 0,1 M PBS. Bereid Lowicryl fixeermiddel door toevoeging van 2,5 ml 16% paraformaldehyde 7,5 ml 0,1 M PBS. </li><li> Bereid oplossingen gebruikt voor het isoleren cellen. Om 500 ml fles DMEF (met glutamine), volg aseptische technieken, terwijl het volgende toegevoegd: <ol><li> Foetale bovine serum (FBS): voeg 50 ml, laatste 10%. </li><li> Penicilline / streptomycine (Pen / Strep, 10.000 E / ml / 10.000 ug / ml voorraad) - voeg 5 ml Pen / Strep voorraad RPMI voor de uiteindelijke concentratie van 100 U / ml / 100ug/mL. Voeg ook 5 ml van een 500 ml fles DPBS bij gebruik voor het houden van lymfeklieren en milt monsters. </li></ol></li></ol> 2. Personeel <ol&gt; <li> Procedure wordt optimaal bereikt met drie medewerkers maar de procedure kan worden uitgevoerd met een goed opgeleid persoon. Twee personen kan de procedure over het algemeen te voltooien in 90 minuten. De werkelijke duur is afhankelijk van het aantal van de ontvangen weefsels en het gemak van het vinden van lymfklieren. Monsters voor cel isolatie worden gehouden bij 4 ° C tot voltooiing van weefsel ontleding tijdens serummonsters parallel verwerkt. </li><li> Patholoog, pathologie-assistent, of een gelijkwaardig-een ervaren medewerker leidt het weefsel behandeling en voert grote dissecties waaronder divisie (s) van de alvleesklier het hoofd en het oogsten van lymfklieren. De eerste inspanningen zijn gericht op de alvleesklier, gevolgd door onderzoek van de peri-alvleesklier vet voor lymfeklieren. </li><li> Laboratorium technoloog of gelijkwaardig-medewerker getraind in het weefsel snijden waarvan de primaire taak, het pancreas en de regio&#39;s en versiering weefsels wegen voor vaste en bevroren blokken en voor snap bevroren vIALS. Ontvangt twaalfvingerige darm en de milt van de pathologie-assistent en verwerkt deze organen, terwijl de pathologie-assistent is het verwerken van de alvleesklier. </li><li> Laboratorium assistent-medewerker die de andere helpt met blok en flacon etikettering, monsters hakken voor cryovials, en serum verwerking. </li></ol> 3. Pancreas Dissection <ol><li> Verwijder de twaalfvingerige darm en de milt en reinig de alvleesklier van vreemde vet, vaten en zenuwen met behulp van stompe en scherpe dissectie </li><li> Leg de schoongemaakte alvleesklier op de snijtafel bord bedekt met keukenpapier. Doop een wattenstaafje in blauwe inkt en de verspreiding op de voorste oppervlak van de alvleesklier. Dep het overtollige. </li><li> Optioneel: Dompel een nieuwe applicator in zwarte inkt en de verspreiding op de achterste oppervlak van de alvleesklier. Keer terug naar de normale pancreas oriëntatie met anterior oppervlak naar prosector. </li><li> Snijd de alvleesklier in 3 regio&#39;s: hoofd, lichaam en staart (figuur 1). Snijd de kruising tussen head en lichaam dan verdeel het resterende deel naar ~ gelijke porties voor lichaam en staart. </li><li> Weeg elke regio van de alvleesklier en opnemen gewichten (Zaak workup blad ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">bijlage 1</a> )). </li><li> Sectie (~ 0,5 cm) elke regio van de alvleesklier in een dwarse &quot;brood brood&quot; manier (figuur 1). </li><li> Gebruik de secties van beide verbindingen tussen de regio&#39;s voor gehakt monsters. Afhankelijk pancreas grootte kan een monster van het lichaam-tail grensgebied moeilijk te verkrijgen waarbij het aantal paraffineblokken worden verlaagd tot gehakt monsters of slechts monsters van de alvleesklier kop lichaamsdeel verkrijgen kan worden verkregen. Label cryovials volgens het hoofd of lichaam te proximale regio aan te duiden op de kruising. <ol><li> Mince stukken en verdeel gelijkmatig tussen cryovials (≥ 1 gram per flacon). Snel invriezen flesjes zonder RNALater in vloeibare stikstof of in het droog ijs - isopentaan slurry vervolgens over to -80 ° C vriezer. </li><li> Houd flacons RNALater bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tot een evenwichtstoestand, remix en snel invriezen in vloeibare stikstof of in het droog ijs-isopentaan brij naar een -80 ° C diepvriezer. </li></ol></li><li> Verwijder afwisselende secties voor paraffine en de LGO blokken beginnen met paraffine (figuur 1). </li><li> Lean alle dwarsdoorsneden naar rechts. </li><li> Plaats ~ 1,5 x 1,5 x 0,5 cm secties in de cassettes. Indien de dwarsprofielen te groot, gehalveerd (figuur 2b). Label cassettes voor blauw voorste helft als &quot;A&quot; en achterste helft als &quot;B&quot;. </li><li> Als stukken nog te groot, elk gesneden loodrecht op de vorige snede (figuur 2c). Label cassettes AD met de klok mee. Knip stukken verder als nodig is om te passen binnen de cassettes. </li><li> Aantal blokken achter elkaar binnen regio, te beginnen met de meest mediale sectie. </li><li> Voor de paraffine blokken, stand cassettes zodat de label zich links en plaats weefsel in de cassette, handhaving van de oriëntatie. Sluiten bandhouder en overbrengen in een vat met ~ 500 ml 10% neutraal gebufferde formaline (NBF). Start timing fixatie wanneer de laatste cassette wordt geplaatst in fixeermiddel. </li><li> Voor OCT blokken, een dunne laag van oktober media giet het in de prelabeled vorm dan lag het weefsel in de mal en zorg ervoor dat de oriëntatie te behouden en weefsel te bedekken met oktober Snel onder te dompelen de LGO mallen in een droog ijs - isopentaan drijfmest voor ~ 1 minuut. Verwijderen uit drijfmest en plaats op droog ijs voor tijdelijke opslag of in de -80 ° C vriezer voor langdurige opslag. </li><li> Verkrijgen ~ 0,5 x 0,5 cm segmenten van het hoofd-lichaam knooppunt elektronenmicroscopie (EM). Plaats een sneetje in de TAAB fixatief en de andere plak in de Lowicryl fixeermiddel. Bewaren beide fixeermiddel met monsters bij 4 ° C gedurende ten minste 48 uur en / of onbepaalde tot verdere verwerking voor EM. </li></ol> 4. Spleen, lymfkliertest Dissecgen en duodenale slijmvlies Dissecties <ol><li> Isoleer de lymfklieren (PLN) van vet en te trimmen alle bindweefsel naar het knooppunt capsule. Plaats in steriele celkweek schotel met DMEF. Afhankelijk van de geïsoleerd totale aantallen, verdelen PLN in porties voor verse zendingen, gecryopreserveerd cel isolaties, paraffine en / of de LGO blokken, en flacons. Mince grote knooppunten in stukken niet groter dan 0,5 cm. </li><li> Mince niet-lymfklieren en de milt in kleine (~ 0,5 cm) blokjes. Plaats in fixatief, OCT media, en of DMEM voor verse monster zendingen of gecryopreserveerde cel isolatie op basis van hoeveelheden van de grondstoffen. </li><li> Open de twaalfvingerige darm en veeg de twaalfvingerige darm slijmvlies van de huid schoon met een vochtig gaasje. Snijd gedeelten van het slijmvlies van paraffine en / of bevroren oktober blokken en gehakt monsters voor flacons, met en zonder RNAlater. Freeze als voor andere monsters. </li></ol> 5. Wrap oktober blokken in de pre-gelabeld aluminiumfolie en plaats oktober blokken en<html> flacons in dozen voor langdurige opslag bij -80 ° C. 6. Stuur Vaste Monsters voor Paraffine Processing <ol><li> Bevestig weefsels voor 16 uur (tussen 20 ± 4 uur) met behulp van een automatische paraffine-processor of met behulp van handmatige timing. Proces om paraffine blokken met behulp van een automatische processor ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix2.doc" target="_blank">bijlage 2</a> ). </li><li> Insluiten delen in de juiste oriëntatie zoals die door de prosector de cassette label links. Plaats de duodenale mucosa met het snijvlak naar beneden tot het onderzoek van het slijmvlies loodrecht staat te stellen de submucosa. </li></ol> 7. Reinig dissectie gebieden en ontsmet. Was dissectie-instrumenten en opnieuw steriliseren. Plaats overblijfsel menselijk weefsel in formaline fixeermiddel voor opslag als biomedisch afval. Gooi biomedisch afval volgens de plaatselijke regels binnen een maand. 8. Werk de Sample Inventory System ve_title &quot;&gt; 9. representatieve resultaten Deze procedure zal het verwerken van een intact humaan alvleesklier met een representatieve steekproef in het orgaan waaronder afbakening van de drie grote regio&#39;s, namelijk, hoofd, lichaam en staart binnen 2 uur. De uncinate regio, te vinden in het achterste kop regio, is opgenomen in het hoofd dissectie. De mediaan van de pancreas gewicht in orgaandonoren zonder diabetes was 82,4 gram (52,7 tot 139,0 gram). Pancreas regionale gewichten waren ongeveer gelijk (figuur 3). Deze procedure kan ook zorgen voor reconstructie van de gehele alvleesklier met behulp van gekleurde dia&#39;s van een sequentiële paraffine en LGO-blokken. Meerdere formaten zijn mogelijk waardoor een maximale benutting van de huidige en toekomstige technologieën. De huidige nPOD geval werkblad is voorzien van ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">bijlage 1</a> ) die wordt gebruikt om hersteld monsters en de daarop volgende proc documenterenkingscapaciteit door de hoeveelheid soorten en hoeveelheden. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig1.jpg" /> Figuur 1. Algemene regeling van de procedure. De gehele alvleesklier wordt verwerkt met behoud van anatomische oriëntaties. De kop regio meer in de superieure inferieur as door de aanwezigheid van de ventrale pancreas nok in het posterieure gebied dat uncinate gebied omvat. Gearceerde gebied op de kruispunten geven gebieden voor gehakt monsters cryovials. P, Paraffine, O, oktober <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig2.jpg" /> Figuur 2. Belettering regeling voor alvleesklier secties. Transverse alvleesklier plakjes kan verder worden verdeeld in tweeën of in vieren en beletterd met de klok mee. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig3.jpg" /> Figuur 3. Pancreas gewichten van orgaandonoren zonder diabetes. Deintacte pancreas van volwassen donoren (&gt; 17 jaar) werd vervolgens gewogen verdeeld in regio&#39;s en regionale gewichten verkregen. De gegevens zijn gemiddelden ± SEM (n = 15).

<ol><li>Brissova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).</li>
<li>Rahier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreatic+polypeptide+cells+in+the+human+pancreas%3A+the+effects+of+age+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).</li>
<li>Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+ventral+and+dorsal+pancreas%3A+a+new+insight+into+anatomy+and+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatobiliary+Pancreat.+Surg%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development.</a> J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).</li>
<li>Wittingen, J., Frey, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+concentration+in+the+head%2C+body%2C+tail+and+uncinate+process+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas.</a> Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).</li>
<li>Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+the+human+diabetic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of the human diabetic pancreas.</a> Diabetologia. 24, 366-371 (1983).</li>
<li>Vaught, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+NCI+perspective+on+creating+sustainable+biospecimen+resources%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst.+Monogr%22%5BJournal%5D)">An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources.</a> J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).</li>
<li>Gianani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+results+of+screening+of+nondiabetic+organ+donors+for+expression+of+islet+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).</li>
<li>Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hyöty, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+high-quality+pancreatic+tissue+for+experimental+study+from+organ+donors+with+signs+of+%CE%B2-cell+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab.+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of β-cell autoimmunity.</a> Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).</li>
<li>In't Veld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+insulitis+in+adult+autoantibody-positive+organ+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors.</a> Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).</li>
<li>Töns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+pancreata+in+perspective+of+the+isolation+of+the+islets+of+langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans.</a> Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het doel van deze procedure is om een ​​standaard alvleesklier verwerking die kunnen worden geharmoniseerd over meerdere inzamelpunten dus definiëren en vergelijkingen van de resultaten verkregen door verschillende groepen mogelijk te maken. De dissectie methode is gebaseerd op standaard chirurgische pathologie praktijken met extra stappen voor annotatie van de grote pancreas regio&#39;s, gevolgd door de intra-regionale onderverdelingen. Standaardisatie van biospecimen verwerkingsmethoden is nodig om collectie van hoge ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Dissection instrumenten, waaronder de scalpels met 22 messen </td><td> Diverse </td><td> Diverse </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeerbuizen (15 en 50 ml) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-539-5, 430828 </td><td> Steriel </td></tr><tr><td> Cryotubes (1,8 ml) </td><td> VWR Noord-Amerika </td><td> 89004-300 </td><td> Steriel, barcodes optionele </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Pathologie Ink </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cassettes </td><td> Mercedes Medische </td><td> CAS ECO109 </td><td></td></tr><tr><td> 10% neutraal gebufferde formaline </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-245-685 </td><td></td></tr><tr><td> Oktober Invriezen Media </td><td> TissueTek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Matrijzen </td><td> ThermoScientific </td><td> 58952 </td><td> Diverse maten </td></tr><tr><td> Isopentaan </td><td> Fisher Scientific </td><td> O3551-4 </td><td> Oktober koelen bad </td></tr><tr><td> Droogijs </td><td></td><td></td><td> Oktober koelen bad </td></tr><tr><td> Vloeibare stikstof in dewarvat </td><td></td><td></td><td> Snap bevriezing cryovials </td></tr><tr><td> Celcultuur schotel (100mm) </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Steriel </td></tr><tr><td> Hyclone DMEF </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td> Steriel, de koelkast bewaren, glutamine opgenomen </td></tr><tr> &lt;td&gt; Foetaal runderserum </td><td> Cellgro </td><td> 35 tot 010-CV </td><td> Steriel, op te slaan bevroren aliquots </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine / Antischimmel </td><td> GIBCO </td><td> 15240-062 </td><td> Steriel, op te slaan bevroren aliquots </td></tr><tr><td> Type 9 Paraffine </td><td> Richard-Allan Wetenschappelijk </td><td> 8337 </td><td></td></tr><tr><td> 1X D-PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td> Steriel </td></tr><tr><td> 16% paraformaldehyde </td><td> EM Sciences </td><td> 15710 </td><td> Maak verse, gekoeld bewaren </td></tr><tr><td> 8% glutaaraldehyde </td><td> EM Sciences </td><td> 16019 </td><td> Maak verse, gekoeld bewaren </td></tr><tr><td> Biosafety Level 2 kap </td><td> Diverse </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultra-low vriezer </td><td> Diverse </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sakura Cassette Printer </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sakura VIP300 </td><td> Sakura </td><td></td><td> Automatische paraffine-processor </td></tr><tr><td> Paraffine Embedding Station </td><td> ThermoFisher </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Specifieke reagentia en materialen.

collectie protocol for human pancreas

Collection Protocol for Human Pancreas

Deze dissectie en bemonsteringsprocedure is ontwikkeld voor het netwerk voor Pancreatic Organ Donors met diabetes (nPOD) programma om de voorbereiding van de alvleesklier hersteld van postmortale orgaandonoren te standaardiseren. De alvleesklier is verdeeld in 3 grote regio&#39;s (hoofd, lichaam, staart), gevolgd door seriële dwarsprofielen in de mediale naar laterale as. Afwisselend secties worden gebruikt voor vaste paraffine en vers bevroren blokken en resterende monsters worden versneden voor snap bevroren monster preparaten, met of zonder RNAse inhibitoren DNA, RNA of eiwit isolatie. Het algemene doel van de alvleesklier dissectie procedure is om de hele alvleesklier te proeven met behoud van anatomische oriëntatie. Endocriene cellen heterogeniteit op het vlak van eilandje samenstelling, grootte, en getallen wordt gerapporteerd voor de menselijke eilandjes ten opzichte van knaagdieren eilandjes 1. De meerderheid van de menselijke eilandjes uit de alvleesklier hoofd, lichaam en staart regio&#39;s bestaat uit insuline-containing β-cellen gevolgd door lagere aantal glucagon bevattende α-cellen en somatostatine bevattende δ-cellen. Alvleesklier polypeptide bevattende PP cellen en ghreline-bevattende epsilon-cellen zijn ook aanwezig, maar in kleine aantallen. In tegenstelling, de uncinate gebied bevat eilandjes die hoofdzakelijk bestaan ​​uit pancreas polypeptide bevatten PP cellen 2. Deze regionale eilandje verschillen komen voort uit verschillen in ontwikkeling. De alvleesklier ontwikkelt zich uit de ventrale en dorsale alvleesklier knoppen in de voordarm en na rotatie van de maag en de twaalfvingerige darm, de ventrale lob beweegt en zekeringen met de dorsale 3. De ventrale lob vormt het achterste deel van de kop met de uncinate proces terwijl de dorsale nok geeft aanleiding tot de rest van het orgel. Regionale pancreas variatie wordt ook gemeld met de staart gebied met hogere dichtheid eilandje in vergelijking met andere regio&#39;s en de dorsale lob-afgeleide componenten die een selectief atrofie bij type 1 diabetes <sup&gt; 4,5. Extra organen en weefsels worden vaak hersteld van de orgaandonoren en zijn lymfklieren, milt en niet-lymfklieren. Deze monsters worden teruggewonnen met soortgelijke formaten de pancreas met de toevoeging van isolatie van cryogeconserveerde cellen. Wanneer de proximale twaalfvingerige darm wordt meegeleverd met de alvleesklier, de twaalfvingerige darm slijmvlies kan worden verzameld voor paraffine en bevroren blokken en gehakt snap bevroren bereidingen.

Deze video toont een dissectie procedure voor de verwerking van de menselijke pancreas in meerdere opslagformaten. Anatomische oriëntatie wordt gedurende de gehele pancreas regio&#39;s definitie van regionale eilandje samenstelling en dichtheid mogelijk te maken.

Collectie Protocol for Human Pancreas

Deze dissectie- en bemonsteringsprocedure is ontwikkeld voor het programma van het Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) om de preparatie te standaardiseren ...

Het algemene doel van deze procedure is om de menselijke pancreas te dissecteren op een manier die de anatomische oriëntatie behoudt. Dit wordt bereikt door het duodenum en de milt van de pancreas te verwijderen, waarna overtollig vet en vaten van de pancreas worden weggenomen. De tweede stap is om het anterieure oppervlak met blauwe inkt en het posterieure oppervlak met zwarte inkt te inkleuren.Vervolgens wordt de pancreas in drie regio's verdeeld. Elke regio wordt daarna dwars in gelijkmatige plakken gesneden en geplaatst in paraffinecassettes, OCT-vormpjes, of verder fijngehakt en in vials geplaatst. Uiteindelijk worden monsters verzameld uit alle drie de regio's van de pancreas, waarbij de juiste anatomische oriëntatie wordt behouden voor toekomstige analyse.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het onderzoek naar diabetes type 1, zoals de mechanismen die ten grond liggen aan het verlies van bètacelmassa of -functie, en de aard van de aanval door immuuncellen. Een visuele demonstratie van de verwerkingsmethode van de pancreas is cruciaal, aangezien het behoud van de in vivo oriëntatie van de pancreas veel aandacht voor detail vereist. De procedure wordt gedemonstreerd door Linda Snyder, histotechnoloog, en Emily Montgomery, biologisch wetenschapper in mijn laboratorium.Begin met het voorbereiden van alle materialen die nodig zijn voor de procedure. Label eerst de cassettes waarin de paraffineblokken worden geplaatst met een donoridentificatie, het monstertype, het aliquotnummer en eventuele aanvullende informatie. Label vervolgens de OCT-vormpjes op dezelfde wijze.Knip voldoende stukken aluminiumfolie af om elk OCT-blok in te wikkelen en leg deze apart voor later gebruik. Bereid alle vials voor die nodig zijn om de verse en bevroren monsters te bewaren. Voeg RNA later en RPMI-medium toe waar适当.Bereid vervolgens de werkgebieden voor door dissectieplanken, gesteriliseerde instrumenten en alle overige benodigdheden voor de procedure zowel in een biosafety-kast als op een aanrecht te plaatsen. Zorg dat alle cassettejes en OCT-vormpjes in de volgorde van gebruik klaarstaan. Maak een vriesbad door voldoende isopentaan toe te voegen om het droogijs op de bodem van een piepschuimdoos te bedekken.Om met de dissectie te beginnen, verwijdert u het duodenum en de milt. Begin met het scheiden van het duodenum en de pancreas aan één uiteinde en ga door tot ze volledig zijn losgekoppeld. De milt is losbevestigd en is eenvoudig te verwijderen uit het vet en de pancreas.Reinig vervolgens de pancreas door overtollig vet, bloedvaten en zenuwen te verwijderen met een combinatie van botte en scherpe dissectie. Bewaar het vet en de lymfeklieren apart voor verdere verwerking. Plaats de gereinigde pancreas vervolgens op een dissectieplank die is bedekt met papieren handdoeken.Het behouden van de juiste oriëntatie van de pancreas is het moeilijkste aspect van deze procedure. Om succes te garanderen, worden de anterieure en posterieure oppervlakken ingekleurd met inkt van verschillende kleuren. Doop een wattenstaafje in blauwe inkt, verspreid de inkt over het anterieure oppervlak van de pancreas en dep het teveel weg.Doop vervolgens een nieuwe applicator in zwarte inkt en verdeel deze over het posterieure oppervlak van de pancreas. Breng de pancreas terug naar de normale oriëntatie. Met het anterieure oppervlak naar boven is de pancreas nu klaar om in drie secties te worden gesneden.Snijd eerst de verbinding tussen de kop en het lichaam door. Verdeel vervolgens het resterende deel in ongeveer gelijke porties om het lichaam en de staart te scheiden, en noteer het gewicht van elk deel van de pancreas. Begin met het kopgedeelte.Verdeel elk gebied in secties van ongeveer 0,5 centimeter door dwars door te snijden, vergelijkbaar met het snijden van een brood. Zodra elk gebied van de pancreas is in plakken gesneden, verwijdert u de laatste sectie van het kopgebied, namelijk de sectie van de overgang tussen kop en lichaam, en plaatst u deze op een apart dissectiebord. Hak deze sectie in kleine stukjes en verdeel de stukjes gelijkmatig over gelabelde cryovials met en zonder RNA.Vervolgens worden de vials ingevroren, volgens de standaardprocedures. Herhaal deze procedure voor het sectie van de overgang tussen het lichaam en de staart.Zodra de fijngehakte monsters zijn verzameld, worden alle transversale doorsneden naar rechts gekanteld. Om en om worden doorsneden van elke regio verwijderd. Verwijder bij paraffine- en OCT-blokken de eerste doorsnede voor paraffineblokkering.Als een sectie te groot is, snijd deze dan doormidden. Label de cassettes als A en B. Als het stuk nog steeds te groot is, snijd dan elke sectie loodrecht op de vorige snede en label de cassettes vervolgens van A tot D in de klokrichting. Zoals hier te zien is, plaatst u de cassette zodanig dat het label zich aan de linkerkant bevindt.Plaats vervolgens het weefsel in de cassette en sluit het deksel. Breng de cassette over naar een container met neutraal gebufferde formaline. Nummer de blokken opeenvolgend binnen elke regio, beginnend met de meest mediale sectie voor OCT-blokken.Giet een dunne laag OCT-medium in een vooraf gelabelde mal. Voordat het weefsel wordt geplaatst, wordt het weefsel bedekt met OCT-medium en wordt het monster snel ingevroren voor later gebruik, waarbij wordt teruggegrepen op het weefsel dat eerder opzij was gezet. Isoleer de pancreatische lymfeklieren door het vet en het bindweefsel rondom het kapsel van de klier weg te snijden. Plaats de klieren in een steriele schaal met DMEF en versnij grote klieren in stukjes van maximaal 0,5 centimeter.Zodra de pancreatische lymfeklieren zijn geïsoleerd, wordt het weefsel verdeeld over de voorbereide vials en cassettes voor verdere verwerking. Na de lymfeklieren wordt de milt fijngehakt en op vergelijkbare wijze bewaard. Om het duodenum te verwerken, wordt een vochtig gaasje gebruikt om het slijm van het mucosa te vegen, waarna het mucosa wordt afgeknipt en in secties wordt gesneden.Verdeel de mucosa-monsters zoals eerder beschreven. Met deze procedure worden representatieve monsters van elk gebied van de pancreas verzameld, zoals hier te zien is. De gewichten van de kop-, lichaam- en staartregio waren ongeveer gelijk.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe een menselijke pancreas verwerkt kan worden tot verschillende monstertypes, in het bijzonder het vermogen om de oriëntatie te behouden, alsmede hoe lymfeklieren uit het peripancreatische vet geïsoleerd kunnen worden.

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel I: de spijsvertering en het verzamelen van de pancreas weefsel) met behulp van een aangepaste automatische methode.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel I: Spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel

Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel II: zuivering en cultuur van de menselijke eilandjes) met behulp van een aangepaste automatische methode.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel II: Zuivering en cultuur van de mens Eilandjes

Het aanbod van type 2 diabetes eilandjes voor onderzoek ontoereikend is. Hier delen we ons protocol voor het isoleren van eilandjes van patiënten die een gedeeltelijke pancreatectomy. Deze aanpak is een unieke locatie voor het verkrijgen van eilandjes van type 2 diabetes en klinisch afgestemd zonder diabetes in voldoende aantallen voor basis-en klinische studies.

Isolatie van de Mens Eilandjes van Gedeeltelijk Pancreatectomized Patiënten

Deze video demonstreert de procedures voor de karakterisering van humane pancreatische eilandjes met hematoxyline en eosine (H &amp; E) en immunohistochemie (IHC). Pancreas delen van het hoofd, lichaam en staart regio's worden gekleurd door zowel H &amp; E en IHC te eilandje endocriene samenstelling (insuline, glucagon, en pancreas polypeptide), cel-replicatie (Ki67) en inflammatoire infiltraten (H &amp; E, CD3) te bepalen. De uncinate regio is gelokaliseerd met behulp van IHC voor pancreas...

Kleuring Protocols for Human pancreatische eilandjes

Een protocol te isoleren, cultuur en imago eilandje cel clusters (ICC), afkomstig van menselijke foetale pancreas cellen wordt beschreven. De methode beschrijft de stappen die nodig zijn om ICC te genereren uit weefsel, cultuur als monolagen of in suspensie als aggregaten, en voor markers van proliferatie en alvleesklier cel beslissingen over het lot.

Isolatie, cultuur en beeldvorming van humane foetale Alvleesklierkanker celclusters

Cruciale uitdagingen voor het onderzoeksgebied diabetes zijn de moleculaire mechanismen die eilandje β-cellen replicatie en op werkwijzen voor het stimuleren van β-celregeneratie ontwikkelen begrijpen. Hierin een high-gehalte screening methode voor het identificeren en evalueren van de β-cel-replicatie bevorderende activiteit van kleine moleculen wordt gepresenteerd.

Een High-gehalte<em&gt; In Vitro</em&gt; Eilandjes van Langerhans β-cel Replication Discovery Platform

Hier presenteren we een protocol bij afbeelding menselijke alvleesklier secties in drie dimensies (3D) met behulp van geoptimaliseerde passieve methoden wissen. Dit manuscript toont deze procedures voor de passieve optische clearing gevolgd door meerdere immunofluorescentie kleuring ter identificatie van de belangrijkste elementen van de autonome en zintuiglijke neurale netwerken innervating menselijke eilandjes.

Hoge resolutie 3D beeldvorming van het Neuro-insulaire netwerk van menselijke alvleesklier

Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van de alvleesklier eilandjecellen muis voor het screenen van de ROS inducties door de xenobiotica teneinde de potentiële diabetogenic xenobiotische chemische stoffen.

Een lymfkliertest alvleesklier Islet cel-gebaseerde Screening voor Diabetogenic milieu chemische stoffen

Dit protocol beschrijft een methode voor de synchrone acquisitie en co-registratie van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen en de secretie van insuline en glucagon door primaire menselijke pseudo-eilandjes met behulp van de adenovirale toediening van een cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP) biosensor, een cAMP-verschildetector in situ (cADDis) en een microperifusiesysteem.

Menselijk pseudo-eilandsysteem voor synchrone beoordeling van fluorescerende biosensordynamica en hormoonsecretoire profielen

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van Lewis rat-pancreaseilandjes, waardoor hoogopbrengst- en hoogzuiverheidspreparaten mogelijk zijn voor direct gebruik in transplantatie- of in vitrostudies .

Isolatie en zuivering van het pancreaseiland door Lewisratten met behulp van enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntscheiding

Leer een dissectieprotocol voor het menselijk pancreas waarbij anatomische oriëntatie behouden blijft. Deze methode ondersteunt diabetesonderzoek door regionale isletanalyse mogelijk te maken.

Collectie Protocol for Human Pancreas

Meer video's verkennen