Isolatie en karakterisering van dendritische cellen en macrofagen van de muis Darm

Het algemene doel van deze procedure is om snel intestinale dendritische cellen of dc's en macrofagen van muizen te isoleren voor fenotypische en functionele karakterisering. Dit wordt bereikt door eerst het darmweefsel te verzamelen. De tweede stap is om het darmepitheel los te maken van de Lamin propria.

Vervolgens wordt de intestinale Lamin Propria gedurende de laatste stappen van de procedure gedigesteerd. De Lamin propria cellen worden gekleurd met fluorescentie, geconjugeerde antilichamen en geselecteerd voor specifieke celpopulaties. Uiteindelijk kunnen intestinale DC en macrofagen populaties nauwkeuriger worden gekenmerkt en gezuiverd voor functionele studies om cytokine productie, antigeenpresentatie en de regulatie van immuuncellen te beoordelen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat de snelheid van de weefseldigeratie een optimale expressie van celoppervlakteantigenen, celviabiliteit en/of cellulaire kenmerken waarborgt. Na het euthanaseren van de muis en het bevestigen van de dood door de teenprikstest, spuit je 70% ethanol op de buik en borstkas van het dier. Gebruik vervolgens een schaar om een kleine horizontale incisie in het midden van de buik te maken en pel de huid terug om het peritoneum bloot te leggen.

Open het peritoneum met een schaar na het snijden bij de pilo sphincter om de maag te scheiden van de bovenste dunne darm en gebruik een pincet om het mesenterium weg te trekken. Snijd opnieuw bij de ileocecale klep om de hele dunne darm te bevrijden van de dikke darm. Blijf het mesenterium van de dikke darm losmaken en maak een snede bij de anale rand.

Gebruik een schaar om de colon longitudinaal open te snijden en gebruik C-M-F-P-B-S op kamertemperatuur om de fecale inhoud en slijm uit het darmlumen te wassen. Gebruik vervolgens de schaar en het pincet om macroscopisch de pyres patches langs het antimesenterische oppervlak van de dunne darm te dissecteren en snijd de dunne darm longitudinaal open.

Vervolgens maakt u het lumen van de dunne darm schoon van fecale inhoud en slijm met meer C-M-F-P-B-S op kamertemperatuur. Snijd afzonderlijk de dunne en dikke darm in stukken van ongeveer 1,5 centimeter en plaats de stukken in afzonderlijke 50 milliliter conische buizen met 30 milliliter voorverwarmde C-M-F-H-B-S-S met FBS en twee millimolair EDTA. Plaats elke 50 milliliter conische buis horizontaal in een orbitale shaker en schudden de buizen gedurende 20 minuten bij 250 RPM op 37 graden Celsius.

Plaats vervolgens een enkele gaasdraadstofzuiger over een afvalemmer. Giet de inhoud van elke 50 milliliter conische buis door het gaas om de darmstukken te herstellen en plaats ze vervolgens in nieuwe afzonderlijke 50 milliliter conische buizen met 30 milliliter voorverwarmde C-M-F-H-B-S-S met FBS en twee millimolair EDTA. Plaats de buizen tenslotte nog 20 minuten terug in de orbitale shaker.

Na de tweede ronde van schudden, giet je de inhoud van elke buis door het zeefje. Veeg het overtollige medium af met een papieren handdoek en plaats vervolgens de darmstukken in een kleine plastic whey boot. Het moeilijkste aspect van deze techniek is de weefseldigeratie om succes te garanderen, alle verschillende parameters van de duur van de digestie, de eigenschappen van het collageenase, de weefselintegriteit en de grootte van het weefsel dat moet worden gedigesteerd moeten allemaal worden overwogen. Gebruik snel een schaar.

Snijd de darmstukken en voeg vervolgens de gehakte darm toe aan een 50 millimeter conische buis met 20 milliliter collageenase-oplossing. Plaats de conische buis horizontaal in de orbitale shaker en verteer de darmstukken gedurende 10 tot 20 minuten bij 200 RPM op 37 graden Celsius. Vorm de buis kortstondig om ervoor te zorgen dat alle resterende darmweefsel volledig is losgemaakt en filter vervolgens de celslurry door een 100 micron celstrainer direct in een 50 milliliter conische buis.

Ten slotte vult u de conische buis aan met C-M-F-H-B-S-S met FBS en centrifugeert u de celsuspensie twee keer gedurende vijf minuten bij 425 keer G bij vier graden Celsius. Giet vervolgens het supernatant af en suspendeer het celpellet in ijskoud C-M-F-H-B-S-S met FBS en plaats de monsters op ijs. Na het kleuren van de cellen voor de oppervlakte-eiwitten van belang.

Begin met het maken van een stipplot waarbij de cellen die positief zijn voor de dode celkleuring worden uitgesloten, zoals hier wordt gedemonstreerd. Vervolgens worden dubbele gebeurtenissen uitgesloten, zoals hier en hier wordt getoond. Gebruik nu de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingskanalen om de cellen van belang te selecteren, zorg ervoor dat puin wordt uitgesloten.

Maak vervolgens een andere stipplot waarbij u de CD 45-positieve en IAB-positieve antigeen selecteert. Stelende cellen in een aparte stipplot creëert gebieden voor het onderscheiden van specifieke DC- en macrofaagsubsets. Het R een gebied hier getoond, vangt de CD 11 C positieve CD 11 B zwakke negatieve cellen op.

Het R twee gebied schetst de cellen die een vergelijkbaar niveau van oppervlakte-expressie voor CD 11 C hebben als de cellen in het R een gebied, maar die ook CD 11 B uitdrukken. De R drie gebieden wijzen de cellen aan die CD 11, B positief en CD 11 C zwakke negatief zijn. Deze drie gebieden kunnen verder worden geanalyseerd op F vier 80 en CD 1 0 3 expressie om macrofaag- en DC-populaties te differentiëren. Zoals te zien is in deze stipplot, zullen de CD 11 C positieve CD 11 B zwakke negatieve cellen in het R een gebied hoge niveaus van de alfa een CD 1 0 3 en lage niveaus van F vier 80 uitdrukken.

Deze stipplot laat zien dat CD 11 B positieve CD 11 C positieve cellen in het R twee gebied zullen bestaan uit zowel DC's als macrofagen op basis van hun dichotome expressie van CD 1 0 3 en F vier 80. Ten slotte, op basis van hun F vier