Name: Wholemount Immunohistochemie voor het openbaren van Complex Brain Topografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Leer wholemount immunohistochemie voor het visualiseren van complexe genexpressiepatronen in het cerebellum. Deze methode maakt driedimensionale weergave mogelijk zonder reconstructie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

RVS wordt ondersteund door nieuwe onderzoeker start-up gelden van Albert Einstein College of Medicine van de Yeshiva University.

1. Animal Perfusie en kleine hersenen Dissection <ol><li> Afhankelijk van het eiwit, kan perfusie essentieel voor de succesvolle kleuring 1,2. Transcardiac perfusie is een invasieve, niet-survival procedure die het juiste gebruik van verdoving nodig is. De juiste opleiding, institutionele goedkeuring en IACUC goedkeuring zijn alle noodzakelijke voordat de procedure. Het is altijd een goed idee om de instelling dierenartsen te raadplegen om hulp te krijgen bij het identificeren van experimentele eisen en het verwerven van de juiste opleiding. Voordat de procedure, moet het dier diep onder narcose en niet reageren op prikkels zoals mond of staart knijpen. Met een schaar een snee in de buikhuid en spieren muur en dan verder naar de ribbenkast te openen door te snijden net naast het borstbeen aan elke kant. Bovendien van het experiment een grotere inwendige werkruimte maken, doordat de fascia rondom het membraan. Door het opheffen van de buik-en thoraxwand uitmuntenderly, zal het hart nu blootgesteld. Maak een kleine snede in de rechterboezem om bloed te laten stromen en onmiddellijk de perfusie naald in de linker ventrikel mogelijk te maken. Een basis hydrostatische pomp voorkeur de perfusie oplossingen (zie tabel 1 voor details). Ten eerste, spoelen het bloed met 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, zie tabel 3) totdat de vloeistof helder is. Schakel dan de hydrostatische pomp, snel de oplossing levering buis te schakelen naar een container van 4% paraformaldehyde (PFA, zie tabel 3) verdund in PBS en vervolgens weer zet de pomp aan het fixeermiddel te leveren. Het gebruik van een pomp is niet nodig: met praktijk twee spuiten gevuld met PBS en 4% PFA kan worden langzaam leveren oplossingen. </li><li> Het is van cruciaal belang om zorgvuldig ontleden de hersenen uit de schedel zonder dat er beschadigingen aan het weefsel. Zelfs kleine snijwonden aan de hersenen tijdens de dissectie zal geleidelijk uitbreiden naar zichtbare spleten dietrap antilichamen en veroorzaken kunstmatig kleuring bij de verwerking van het weefsel (bijvoorbeeld rood sterretjes in fig. 2). Voor cerebellaire dissecties, het is typisch voor de huid snijden in het midden van het hoofd en vervolgens voorzichtig te plagen de flappen uit elkaar om de schedel bloot te leggen. Snijd de schedel van voorste tot de achterste langs de dorsale middellijn, en ook zijdelings langs beide zijden van de schedel. Knip niet verder dan de bregma, omdat dit het risico loopt te jatten het cerebellum. Met behulp van een tang voorzichtig til de voorkant van de schedel van de hersenen dat evenwel niet te scheuren weg te hersenweefsel die is aangesloten op de hersenvliezen. Sever de hersenzenuwen aan de ventrale zijde van de hersenen. </li><li> Scheiding van het cerebellum van de rest van de hersenen om twee redenen. Ten eerste maakt exploratie van expressiepatronen in de voorste melkklieren, die uit het zicht onttrokken de colliculi in situ. De tweede is dat het weefsel scheiden in kleinere geïsoleerde gebieden maakt merts volledige fixatie de kleuring van sommige eiwitten kunnen vergemakkelijken. In deze laatste dissectie stap moet erop worden gelet dat de kleine hersenen niet aan met de uiteinden van de tang. Steek de uiteinden van een paar pincetten in het midden van de superieure en inferieure colliculi. Met een tweede set tang langzaam los te maken van de inferieure colliculi van de kleine hersenen. Vervolgens lag de kleine hersenen, zodat de voorste kant naar beneden en de hersenstam naar boven wijst. Plaats de tang in de vierde ventrikel tussen de hersenstam en melkklieren IX / X van het cerebellum. Snij de steeltjes door te knijpen met de tang aan beide kanten en dan zachtjes Til de kleine hersenen van de hersenstam. Zodra de cerebellum geïsoleerd, post-vast door onderdompeling in 4% PFA bij 4 ° C gedurende ten minste 24-48 uur. De cerebellum kan worden opgeslagen in 4% PFA langere tijd. De hersenvliezen dient te worden verwijderd voor of na kleuring voor een betere zichtbaarheid van de expressie patronen.Als de onderzoeker ervoor kiest om de meningen te verwijderen voordat kleuring is er een grote kans dat de kleine hersenen wordt gejat tijdens het proces. Afpellen de vliezen aan het einde van de kleuring werkwijze is veel eenvoudiger, omdat ze eenvoudiger te vinden na verkrijgen zwak achtergrondkleuring en wordt zwak nabewerking. </li></ol> 2. Het verwerken van de weefsel voor Wholemount kleuring Omdat de wholemount vlekken aanpak langer duurt dan immunohistochemische kleuring van weefselcoupes, is het nuttig om de tijdlijn te plannen voor elk van de experimenten, zoals in het voorbeeld kalender voorzien (tabel 2). Voordat u begint, zijn er verschillende belangrijke dingen in gedachten te houden. 1) De microbuizen die het weefsel gedraaid moet worden op een nutator allen tijde, behalve in het bevriezen / ontdooien proces. 2) Diverse oplossingen moeten worden vers gemaakt voor elk experiment (zie tabel 3 voor oplossing recepten). 3)Het gehele protocol bij het veranderen van oplossingen, voorzichtig giet de gebruikte oplossing in plaats van het verwijderen van de kleine hersenen met een pincet, om te voorkomen dat het aanraken van de kleine hersenen. Daarna, na het mengen van de nieuwe oplossing in andere reservoirs kunnen een pipet de verse oplossing langzaam aan de buis. 2.1 Dag 1: <ol class="lalpha"><li> Bevestig de kleine hersenen in de fix Dent&#39;s 3 bij kamertemperatuur 6-8 uur schommelen zachtjes op de nutator. Als methanol is destructief om uw antigeen, het beste vervangen door stappen 2.1a 2.3a met een antigen herstel methode. De warmte en buffers gebruikt voor antigen herstel zullen helpen bij de voorbereiding van het weefsel voor antilichamen penetratie. </li><li> Bleach de kleine hersenen in Bleach Dent&#39;s 3 overnacht bij 4 ° C. </li></ol> 2,2 Dag 2: <ol class="lalpha"><li> Drogen de cerebellum twee rondes van 100% MeOH bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten elk. </li><li> Vervolgens de penetratie van de oplossingen verbeteren, onderhet weefsel een reeks vries / ontdooi cycli. Plaats de buis in een bak met droog ijs en vries gedurende 30 minuten. Verwijder vervolgens de buis en laat het op kamertemperatuur op de bank voor 15 minuten. De vries / ontdooi stap worden uitgevoerd viermaal (min.). </li><li> Na de laatste ontdooien van het weefsel, de buis nachts plaats in een -80 ° C diepvriezer. </li><li> Het weefsel kan worden opgeslagen voor langere tijd bij -80 ° C of direct voor of na het vries / ontdooi stappen. Anders zou het protocol worden voortgezet. </li></ol> 2,3 Dag 3: <ol class="lalpha"><li> Hydrateren de cerebellum door wassen in 50% MeOH/50% PBS, 15% MeOH/85% PBS en 100% PBS voor elke 60-90 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Vervolgens voor volwassen muis cerebella, onder voorbehoud van het weefsel voor enzymatische vertering met 10μg/ml proteïnase K in PBS gedurende 2-3 minuten. Geen spijsvertering stap noodzakelijk is voor cerebella van jonge dieren (P5 of jonger in de muis). Langere digestion wordt voorgesteld voor grotere hersenen. Zo kan digestie oplopen tot 5-6 minuten voor primaten hersenen 4. </li><li> Na de vertering, onmiddellijk wassen de kleine hersenen in PBS drie keer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur aan het proteïnase K. te verwijderen </li><li> Blok het weefsel PMT (zie tabel 3) overnacht bij 4 ° C. Melkpoeder is vaak de eerste keuze bij het selecteren van een blokkerende stof voor eiwit werk, want het is goedkoop, effectief verlaagt achtergrondkleuring, en meestal heeft geen invloed op antilichaambinding of toegang tot het antigeen. Animal serums kan ook worden gebruikt, hoewel de experimentator de hoogte van de extra kosten en moet het serum kwaliteit eerste testen kruisreactief immunoglobulinen en de mogelijkheid een optimale signaal-ruisverhouding te produceren. </li></ol> 2,4 Dag 4-5: <ol class="lalpha"><li> Incubeer het weefsel primaire antilichamen verdund PMT aangevuld met 5% DMSO gedurende 48 uur bij 4 ° C (largER cerebella zal meer incubatietijden). </li></ol> 2,5 Dag 6: <ol class="lalpha"><li> Was de kleine hersenen 2-3 keer gedurende 2-3 uur in de PMT bij 4 ° C om ongebonden primaire antilichamen te verwijderen. </li><li> Vervolgens wordt het weefsel in secundaire antilichamen incuberen in een oplossing PMT met 5% DMSO bij 4 ° C geroerd (groter cerebella kan vergt meer incubatietijden). </li></ol> 2,6 Dag 7: <ol class="lalpha"><li> Was de cerebellum 2-3 keer 2-3 uur in PMT bij 4 ° C. </li><li> Geef het weefsel een laatste wasbeurt met PBT (zie tabel 3) voor 1-2 uur. Deze stap verwijdert overtollig melk en de duidelijkheid van de kleuring. </li><li> Tenslotte incuberen het weefsel in DAB (3,3 &#39;-diaminobenzidine) oplossing tot de optimale kleuringsintensiteit bereikt. De bruine reactieproduct moet duidelijk zichtbaar zijn binnen ~ 10 minuten. Het beste is om DAB te gebruiken in het donker als licht zorgt ervoor dat de chromogeen aan neerslagte, die achtergrondkleuring kan verhogen. </li></ol> 2,7 Wanneer de optimale kleuringsintensiteit bereikt, stopt de reactie door plaatsen van de cerebellum in PBS met 0,04% natriumazide. Het weefsel kan worden opgeslagen op lange termijn in deze oplossing. Natriumazide een krachtige remmer van de bacteriële groei, maar vermeden worden tot deze stap ook remt mierikswortelperoxidase. 2.8 Optioneel versterking procedure: volgens de normale protocol, maar deze stappen moeten worden uitgevoerd in plaats van stap 2.5b-2.7. <ol class="lalpha"><li> Overnacht incuberen het weefsel bij 4 ° C in biotine-geconjugeerde secundaire antilichamen in PBST (zie tabel 3) met 5% DMSO. </li><li> Spoel het weefsel gedurende 2-3 uur per 3-4 veranderingen PBST bij kamertemperatuur. </li><li> &#39;S nachts Incubeer de kleine hersenen bij 4 ° C in ABC complexe oplossing in PBST. </li><li> Spoel de weefsel voor 2-3 uur elk opkamertemperatuur in 3-4 veranderingen van PBS. </li><li> Incubeer het weefsel in vers bereide DAB oplossing, zoals hierboven beschreven. </li><li> Wanneer de kleuring optimaal is, stopt de reactie door wassen cerebellum in PBS met 0,04% natriumazide. </li></ol> 3. Beeldvorming van de Stained Tissue <ol><li> Wholemount beelden kunnen worden vastgelegd met behulp van, bijvoorbeeld, een Leica DFC3000 FX camera gemonteerd op een Leica MZ16 FA stereomicroscoop lopen Leica Application Suite FX software. Desgewenst kan deconvolutie microscopie worden gebruikt om meerdere opeenvolgende beelden te verwerven verschillende beeldvlakken met elk beeld slechts een lobulus scherp opstaat. Vervolgens kunnen de beelden worden gecomprimeerd tot een stapel en software verleend aan vervorming te verwijderen. De uiteindelijke samengestelde beeld zal laten zien cerebellaire oppervlakte-expressie patronen met alle zichtbare patronen in duidelijke focus. </li><li> Wholemount gekleurde weefsel moet worden afgebeeld, terwijl ondergedompeld in PBS (of een ander medium zal eenoptimale brekingsindex). Om gemakkelijk de wholemount voor beeldvorming positioneren, een 1% agar gel in een plastic petrischaal. Snij kleine openingen in de gel. De gaten zal de cerebellum worden ingeklemd in de gewenste oriëntatie. </li><li> Ruwe data worden geïmporteerd in Adobe Photoshop CS4 en aangepast voor contrast en helderheid niveaus. </li></ol> Dieren Alle dierlijke studies werden uitgevoerd in het kader van een goedgekeurde IACUC dier-protocol volgens de institutionele richtlijnen van Albert Einstein College of Medicine. Mannelijke en vrouwelijke outbred Zwitserse Webster (Taconic, Albany, NY) muizen werden gehandhaafd in onze kolonie en gebruikt voor alle studies. Geëuthanaseerd volwassen ratten werden vriendelijk verschaft door Dr Bryen Jordan (Albert Einstein College of Medicine). Alle dieren werden ten minste een maand oud. 4. Representatieve resultaten Het cerebellum is gecompartimenteerd door moleculaire expressie in vier transversale zones:de voorste zone (AZ: ~ melkklieren IV), de centrale zone (CZ: ~ melkklieren VI-VII), de achterste zone (PZ: ~ melkklieren VIII-rug-IX) en de nodulaire zone (NZ: ~ melkklieren IX ventrale en X ) 5. Elke zone bestaat uit een unieke reeks van parasagittal strepen 1,2,5,6 (afb. 1). ZebrinII uitdrukking in Purkinje cellen onthult strepen in het AZ en PZ (afb. 2) en eenduidige uitstraling in de CZ en NZ (afb. 2). De parasagittal organisatie van de Purkinje cellen wordt weerspiegeld door de terminal gebied topografie van afferente vezels. Cocaïne-en amfetamine-gereglementeerde transcript (CART) peptide wordt uitgedrukt in subsets van het beklimmen van vezels (Fig. 3a) dat project aan strepen van Purkinje cel dendrieten in de moleculaire laag van de cerebellaire cortex 7 (afb. 3b). Met de juiste aanpassingen, zoals de versterking 7, de wholemount-protocol zorgt voor de visualisatie van olivocerebellar patronen zonder de need een moeizame en tijdrovende reconstructies vuil worden weefselcoupes (Fig. 3b). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig1.jpg" /> Figuur 1. A. ZebrinII / aldolaseC expressie onthult sagittale banden in dwarsdoorsneden van het cerebellum. Schaal bar = 500 pm. B. ZebrinII / aldolaseC wordt uitsluitend uitgedrukt in Purkinje cel somata en dendrieten. Schaal bar = 150μm (gl = korrelige laag; pcl = Purkinje cel laag; ml = moleculaire laag). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig2.jpg" /> Figuur 2. Een wholemount cerebellum gekleurd voor ZebrinII / aldolaseC zien Purkinje cel strepen in de beelden van de voorste (AZ), centrale (CZ) en achterste (PZ) zones van het cerebellum. Hier hebben we tonen ook een voorbeeld van de negatieve consequentie van inkeping het cerebellum. De resulterende kleuring kunstmatig aangegevenmet rode sterretjes. Schaal bar = 1 mm (LS = lobulus simplex; PML = paramediane lobulus; COP = koppelwerkwoord pyramidis). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig3.jpg" /> Figuur 3. A. CART wordt uitgedrukt in klimvezel terminals in de moleculaire laag. Schaal bar = 100 micrometer. (Ml = moleculaire laag; pcl = Purkinje cel laag; gl = granulaire laag) B. Wholemount immunohistochemie van CART expressie in de NZ. Schaal bar = 2 mm (COP = koppelwerkwoord pyramidis; PML = paramediane lobulus; PFL = paraflocculus; FL = flocculus cerebelli).

<ol><li>Sillitoe, R. V., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+Immunohistochemistry%3A+A+high-throughput+screen+for+patterning+defects+in+the+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).</li>
<li>Kim, S. -H., Che, P., Chung, S. -H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Mount+Immunohistochemistry+of+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Whole-Mount Immunohistochemistry of the Brain.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (2006).</li>
<li>Dent, J. A., Polson, A. G., Klymkowsky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-mount+immunocytochemical+analysis+of+the+expression+of+the+intermediate+filament+protein+vimentin+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus.</a> Development. 105, 61-74 (1989).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Malz, C. R., Rockland, K., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+compartmentation+of+the+primate+and+tree+shrew+cerebellum%3A+a+common+topography+of+zebrin+II+in+Macaca+mulatta+and+Tupaia+belangeri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Antigenic compartmentation of the primate and tree shrew cerebellum: a common topography of zebrin II in Macaca mulatta and Tupaia belangeri.</a> J. Anat. 204, 257-269 (2004).</li>
<li>Ozol, K., Hayden, J. M., Oberdick, J., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transverse+zones+in+the+vermis+of+the+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transverse zones in the vermis of the mouse cerebellum.</a> J. Comp. Neurol. 412, 95-111 (1999).</li>
<li>Apps, R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+cortical+organization%3A+a+one-map+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).</li>
<li>Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+expression+of+a+cocaine-+and+amphetamine-regulated+transcript+peptide+reveals+complex+circuit+topography+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Patterned expression of a cocaine- and amphetamine-regulated transcript peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex.</a> J. Comp. Neurol. 519, 1781-1796 (2011).</li>
<li>Sarna, J. R., Marzban, H., Watanabe, M., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+stripes+of+phospholipase+Cbeta3+and+Cbeta4+expression+by+Purkinje+cell+subsets+in+the+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Complementary stripes of phospholipase Cbeta3 and Cbeta4 expression by Purkinje cell subsets in the mouse cerebellum.</a> J. Comp. Neurol. 496, 303-313 (2006).</li>
<li>Demilly, A., Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilament+heavy+chain+expression+reveals+a+unique+parasagittal+stripe+topography+in+the+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Neurofilament heavy chain expression reveals a unique parasagittal stripe topography in the mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 10, 409-421 (2011).</li>
<li>Larouche, M., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+clusters+to+stripes%3A+the+developmental+origins+of+adult+cerebellar+compartmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">From clusters to stripes: the developmental origins of adult cerebellar compartmentation.</a> Cerebellum. 5, 77-88 (2006).</li>
<li>Marzban, H., Chung, S., Watanabe, M., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+Cbeta4+expression+reveals+the+continuity+of+cerebellar+topography+through+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Phospholipase Cbeta4 expression reveals the continuity of cerebellar topography through development.</a> J. Comp. Neurol. 502, 857-871 (2007).</li>
<li>Blank, M. C., Grinberg, I., Aryee, E., Laliberte, C., Chizhikov, V. V., Henkelman, R. M., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+developmental+programs+are+altered+by+loss+of+Zic1+and+Zic4+to+cause+Dandy-Walker+malformation+cerebellar+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multiple developmental programs are altered by loss of Zic1 and Zic4 to cause Dandy-Walker malformation cerebellar pathogenesis.</a> Development. 138, 1207-1216 (2011).</li>
<li>Sawada, K., Sakata-Haga, H., Fukui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating+array+of+tyrosine+hydroxylase+and+heat+shock+protein+25+immunopositive+Purkinje+cell+stripes+in+zebrin+II-defined+transverse+zone+of+the+cerebellum+of+rolling+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nagoya.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Alternating array of tyrosine hydroxylase and heat shock protein 25 immunopositive Purkinje cell stripes in zebrin II-defined transverse zone of the cerebellum of rolling mouse.</a> Nagoya. Brain Res. 1343, 46-53 (2010).</li>
<li>Sawada, K., Fukui, Y., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+distribution+of+corticotropin-releasing+factor+immunopositive+climbing+fibers+in+the+mouse+cerebellum%3A+Analysis+by+whole+mount+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial distribution of corticotropin-releasing factor immunopositive climbing fibers in the mouse cerebellum: Analysis by whole mount immunohistochemistry.</a> Brain Res. 1222, 106-117 (2008).</li>
<li>Marzban, H., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+architecture+of+the+posterior+zone+of+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">On the architecture of the posterior zone of the cerebellum.</a> Cerebellum. 10, 422-434 (2011).</li>
<li>Pakan, J. M., Graham, D. J., Wylie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+visual+mossy+fiber+projections+and+zebrin+expression+in+the+pigeon+vestibulocerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization of visual mossy fiber projections and zebrin expression in the pigeon vestibulocerebellum.</a> J. Comp. Neurol. 518, 175-198 (2010).</li>
<li>Iwaniuk, A. N., Marzban, H., Pakan, J. M., Watanabe, M., Hawkes, R., Wylie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+the+cerebellar+cortex+of+hummingbirds+%28Aves%3A+Trochilidae%29+revealed+by+the+expression+of+zebrin+II+and+phospholipase+C+beta+4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of the cerebellar cortex of hummingbirds (Aves: Trochilidae) revealed by the expression of zebrin II and phospholipase C beta 4.</a> J. Chem. Neuroanat. 37, 55-63 (2009).</li>
<li>Sarna, J. R., Larouche, M., Marzban, H., Sillitoe, R. V., Rancourt, D. E., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Purkinje+cell+degeneration+in+mouse+models+of+Niemann-Pick+type+C+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Patterned Purkinje cell degeneration in mouse models of Niemann-Pick type C disease.</a> J. Comp. Neurol. 456, 279-291 (2003).</li>
<li>Sarna, J. R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Purkinje+cell+loss+in+the+ataxic+sticky+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterned Purkinje cell loss in the ataxic sticky mouse.</a> Eur. J. Neurosci. 34, 79-86 (2011).</li>
<li>El-Bizri, N., Guignabert, C., Wang, L., Cheng, A., Stankunas, K., Chang, C. P., Mishina, Y., Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SM22alpha-targeted+deletion+of+bone+morphogenetic+protein+receptor+1A+in+mice+impairs+cardiac+and+vascular+development%2C+and+influences+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">SM22alpha-targeted deletion of bone morphogenetic protein receptor 1A in mice impairs cardiac and vascular development, and influences organogenesis.</a> Development. 135, 2981-2991 (2008).</li>
<li>Mondrinos, M. J., Koutzaki, S., Lelkes, P. I., Finck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-engineered+model+of+fetal+distal+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A tissue-engineered model of fetal distal lung tissue.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, 639-650 (2007).</li>
<li>Coppola, E., Rallu, M., Richard, J., Dufour, S., Riethmacher, D., Guillemot, F., Goridis, C., Brunet, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epibranchial+ganglia+orchestrate+the+development+of+the+cranial+neurogenic+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epibranchial ganglia orchestrate the development of the cranial neurogenic crest.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 107, 2066-2071 (2010).</li>
<li>Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+guidance+of+embryonic+corneal+innervation%3A+roles+of+Semaphorin3A+and+Slit2%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental guidance of embryonic corneal innervation: roles of Semaphorin3A and Slit2.</a> Dev. Biol. 344, 172-184 (2010).</li>
<li>Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+mapping+of+afferent+topography+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions.</a> Brain Struct. Funct. 216, 159-169 (2011).</li>
<li>Davis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemistry.</a> Methods Enzymol. 225, 502-516 (1993).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

We hebben de technische details die nodig zijn voor een succesvolle wholemount kleuring met behulp van een veelzijdige immunohistochemische aanpak voor het openbaren van eiwitexpressie in de ontwikkelende en volwassen hersenen. Door deze aanpak kan complexe moleculaire expressiepatronen geanalyseerd en hersenen topografie gewaardeerd zonder bewerkelijk en tijdrovend weefsel snijden procedures. Dit protocol is gebruikt om het patroon expressie van verschillende Purkinje cel eiwitten laten zie...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materialen </td><td> Functie in protocol </td></tr><tr><td> Perfusie pomp (Fisher Scientific/13-876-2) </td><td> Zorgt voor consistente en langzame perfusie. </td></tr><tr><td> Sharp-tip Scharen (FST/14081-08) </td><td> Algemeen gebruik in perfusie en dissectie. </td></tr><tr><td> Blunt-tip tang (FST/91100-12) </td><td> Om het hart voor het inbrengen van de naald perfusie te stabiliseren. </td></tr><tr><td> Tang (FST door Dumont AA/11210-10) </td><td> Voor gebruik bij ontleding van de hersenen van de schedel en de cerebellum scheiden van de rest van de hersenen. Deze zijn essentieel omdat ze een licht afgeronde tip die helpt bij het minimaliseren schade aan de kleine hersenen tijdens de dissectie. </td></tr><tr><td> Nutator (Fisher Scientific) </td><td> Wordt gebruikt om weefsel in beweging te houden tijdens de incubatieperiode. </td></tr><tr><td> 1,5 ml buis (Sarstedt / Schroefdop Micro Tube) </td><td> Alle stappen van het zijntochemistry protocol plaats te vinden in deze microbuisjes. De afgeronde bodem zorgt ervoor dat de kleine hersenen blijft in beweging. </td></tr><tr><td> Geperforeerde lepel (FST/10370-17) </td><td> Wordt gebruikt om wholemounts te houden in de microbuisjes, terwijl voorzichtig decanteren van de gebruikte oplossing. </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA microscoop </td><td> Wordt gebruikt om wholemount vlekken te onderzoeken. </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 FX-camera </td><td> Wordt gebruikt om wholemount beelden vast te leggen. </td></tr></tbody></table> Tabel 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="9"> Voorbeeld agenda voor een typische wholemount experiment </td></tr><tr><td> Dag 1 </td><td colspan="4"> Dent&#39;s fix, kamertemperatuur, 8 uur </td><td colspan="4"> Dent&#39;s bleekmiddel, 4 ° C, &#39;s nachts </td></tr><tr><td> Dag 2 </td><td colspan="3"> 100% MeOH, kamertemperatuur, 2x, 30 min elk </td><td colspan="3"> 100% MeOH, Vorst / dooi, 4x, 30 min/15 min </td><td colspa<html> n = &quot;2&quot;&gt; 100% MeOH, 80 ° C een nacht </td></tr><tr><td> Dag 3 </td><td> 50% MeOH/50% PBS, kamertemperatuur, 60-90 minuten </td><td colspan="2"> 15% MeOH / 85% PBS, kamertemperatuur, 60-90 minuten </td><td colspan="2"> 100% PBS, kamertemperatuur, 60-90 minuten </td><td> 10μg/mL proteïnase K in PBS, kamertemperatuur, 2-3 min. </td><td> 100% PBS, kamertemperatuur, 3x 10 minuten elk </td><td> PMT, 4 ° C een nacht </td></tr><tr><td> Dag 4-5 </td><td colspan="8"> PMT + 1 ° antilichaam + 5% DMSO, 4 ° C, 48 uur </td></tr><tr><td> Dag 6 </td><td colspan="3"> PMT, 4 ° C, 2-3x 2-3 uur elk </td><td colspan="5"> PMT + 2 ° antilichaam + 5% DMSO, 4 ° C, 24 uur (of te beginnen versterking stappen met ABC-complex) </td></tr><tr><td> Dag 7 </td><td colspan="2"> PMT, 4 ° C, 2-3x 2-3 uur elk </td><td colspan="3"> PBT, kamertemperatuur, 2 uur </td><td colspan="3"> Incubeer in verse DAB in PBS tot een optimale kleuring is gevisualiseerd </td></tr></tbody></table>_content &quot;&gt; Tabel 2. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Recepten (* = voor te bereiden verse elke keer) </td></tr><tr><td> PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) </td><td> 0,1 M fosfaatgebufferde zoutoplossing in gedeïoniseerd water. pH 7,2 (Sigma tabletten; P4417) </td></tr><tr><td> PFA (Paraformaldehyde) </td><td> Gemaakt en in bevroren toestand bewaard als een 20% oplossing en vervolgens verdund tot 4% in PBS voor de werkende oplossing (Fisher Scientific, T353) </td></tr><tr><td> Dent&#39;s Fixatief 3 * </td><td> 4 delen methanol 1 deel dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific, D159-4) </td></tr><tr><td> Dent&#39;s Bleach 3 * </td><td> 4 delen methanol 1 deel dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific, D159-4) 1 deel 30% waterstofperoxide </td></tr><tr><td> Enzymatische digestie </td><td> 10 ug / ml Proteinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) in PBS. </td></tr><tr><td> PBST </td><td> PBS bevattende: 0,1% Tween-20 (Visserij, de drier Scientific BP337, Triton kan ook worden gebruikt in plaats van Tween-20 in alle gevallen). </td></tr><tr><td> PMT 25 * </td><td> PBS bevattende: 2% magere magere melkpoeder (Anjer voorkeur) 0,1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337) </td></tr><tr><td> PBT 25 * </td><td> PBS bevattende: 0,2% bovine serum albumine (Sigma; B9001S) 0,1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337) </td></tr><tr><td> DAB * </td><td> Los een 10 mg tablet 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) in 40 ml PBS. Voeg 10 pi 30% waterstofperoxide reactie te starten). </td></tr><tr><td> ABC complexe oplossing </td><td> Vectastain kit (Vector Laboratories, Inc; PK-4000) </td></tr></tbody></table> Tabel 3.

wholemount immunohistochemie voor het openbaren van complex brain topografie

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

De herhaalde en goed begrepen cellulaire architectuur van de kleine hersenen maken het een ideaal model systeem voor het verkennen van de hersenen topografie. Onderliggende zijn relatief uniforme morfologie is een complexe serie van parasagittal domeinen van gen-en eiwitexpressie. De moleculaire compartimentering van de kleine hersenen wordt weerspiegeld door de anatomische en functionele organisatie van afferente vezels. Om ten volle bewust van de complexiteit van cerebellaire organisatie hebben we eerder een verfijnd wholemount vlekken aanpak voor hoge doorvoer analyse van de patronen gebreken in de muis cerebellum. Dit protocol beschrijft in detail de reagentia, hulpmiddelen en praktische stappen die nuttig zijn om met succes eiwit expressie patronen laten zien in de volwassen muis kleine hersenen met behulp van wholemount immunokleuring. De stappen die hier aandacht aan te tonen het nut van deze methode gebruik van de uitdrukking van zebrinII / aldolaseC als een voorbeeld van hoe de fijne topografie van de hersenen kan worden onthuld in zijnnatieve driedimensionale conformatie. Ook beschreven zijn aanpassingen aan het protocol die het mogelijk maken voor de visualisatie van de expressie van eiwitten in afferente projecties en grote cerebella voor vergelijkende studies van moleculaire topografie. Om deze toepassingen te illustreren, worden de gegevens van afferente kleuring van de rat cerebellum inbegrepen.

Neurale circuits topografisch georganiseerd in functionele compartimenten specifieke moleculaire profielen. Hier bieden wij de praktische en technische stappen voor het openbaren van globaal brein topografie met behulp van een veelzijdige wholemount immunohistochemische kleuring aanpak. We zien het nut van de methode met behulp van de goed begrepen morfologie en de circuits van cerebellum.

Wholemount Immunohistochemie voor het openbaren van Complex Brain Topografie

De herhaalde en goed begrepen cellulaire architectuur van het cerebellum maakt het tot een ideaal modelsysteem voor het onderzoeken van de hersentopografie. Ten grondslag aan...

Het algemene doel van deze procedure is om complexe patronen van genexpressie in een volledige, intacte hersenstructuur in kaart te brengen. Dit wordt bereikt door het dier eerst te perfunderen en de hersenen te verwijderen. Vervolgens wordt het cerebellum gedisseceerd en verwerkt volgens het whole mount kleuringsprotocol.De laatste stap is het visualiseren van genexpressie met behulp van een histochemische kleurreactie. Uiteindelijk wordt veldverlichtingsmicroscopie gebruikt om oppervlaktepatronen van genexpressie in beeld te brengen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals immunohistochemie op weefselcoupes, is de mogelijkheid om complexe patronen in drie dimensies te visualiseren zonder dat reconstructie nodig is.De procedure wordt gedemonstreerd door Joshua White, een promovendus uit mijn laboratorium. Nadat het dier is geofferd en de hersenen uit de schedel zijn verwijderd, scheidt u het cerebellum van de rest van de hersenen door eerst de punten van een pincet in het midden van de superieure en inferieure calli te plaatsen. Gebruik vervolgens een tweede pincet om de calli en de cortex voorzichtig van het cerebellum los te maken.

wholemount-immunohistochemistry-for-revealing-complex-brain-topography

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Grootschalige immunodetectie van target eiwitten in het hele primaat hersenen is mogelijk door het gebruik van nieuwe weefsel inbedden en snijden methoden gecombineerd met het gebruik van creatieve apparatuur voor batch kleuring van meerdere vrij zwevende delen op een gegeven moment.

Batch Immunokleuring Grootschalige eiwitdetectie in de Whole Brain Monkey

Wij bieden een praktische gids voor het leveren van...

Revealing Neurale Circuit Topografie in Multi-Color

This video demonstrates the procedure for immunostaining a fixed mouse brain tissue section with fluorescently labeled astrocytes using primary and secondary antibodies and capture the images of the stained astrocytes through confocal microscopy.

Immunostaining of Fluorescently Labeled Astrocytes in a Mouse Brain Tissue Section

In dit artikel beschrijven we de volledige experimentele procedure te reconstrueren, met een hoge resolutie, de fijne hersenen anatomie van fluorescent gelabelde muis hersenen. De beschreven protocol bevat monstervoorbereiding en clearing, specimen montage voor imaging, data post-processing en multi-schaal visualisatie.

Micronschaal Resolutie Optische Tomografie van Gehele Mouse Brains met confocale Light Sheet Microscopie

Hier beschrijven we een procedure voor het weefsel wissen, fluorescerende benoemen, en grootschalige beeldvorming van muis hersenweefsel, waardoor, zodat, visualisatie van de driedimensionale organisatie van celtypes in de neocortex.

Grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de Neocortex muis

Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode ter voorbereiding van kleine dierlijke hersenen van micro-CT beeldvorming, in welke letsels kunnen worden gekwantificeerd en elektroden gelegen met hoge precisie in de context van de hele hersenen.

Een Micro-CT-gebaseerde methode voor het karakteriseren van laesies en vinden van elektroden in kleine dierlijke hersenen

Dit artikel introduceert een experimenteel protocol met behulp van 3D-scantechnologie die twee ruimtelijke schalen overbrugt: de macroscopische ruimtelijke schaal van de anatomie van de gehele hersenen die wordt afgebeeld door een MRI op &gt; 100 μm en de microscopische ruimtelijke schaal van neuronale verdelingen met behulp van Immunohistochemie-kleuring en een multi elektrode-array systeem en andere methoden (~ 10 μm).

3D scanning technologie bridging micro circuits en Macroscale hersen beelden in 3D novel insluiten overlappend Protocol

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor immunofluorescerende cokleuring van IBA1 en TMEM119, naast de analyse van microgliale dichtheid, distributie en morfologie, evenals perifere myeloïde celinfiltratie in muizen hersenweefsel.

Immunofluorescentie kleuring met behulp van IBA1 en TMEM119 voor Microgliale dichtheid, morfologie en perifere myeloïde Celinfiltratie analyse in Muizenhersenen

Dit protocol beschrijft een methode voor het combineren van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en fluorescentie immunohistochemie (IHC) in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersensecties van muizen, met als doel het bereiken van multilabel FISH en fluorescentie IHC-signaal. IHC richtte zich op cytoplasmatische en membraangebonden eiwitten.

Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen

Dit protocol beschrijft een efficiënte en reproduceerbare aanpak voor histologische studies van muizenhersenen, waaronder perfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming.

Vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen

Seriële tweefotontomografie (STPT) beeldvorming is een techniek om een weefselmassa in zijn driedimensionale vorm in beeld te brengen door tweefotonbeeldvorming te combineren met automatische faseregeling en microtoom slicing. Hier beschrijven we een protocol voor de implementatie ervan voor zijdeaapjes om hun structurele kenmerken beter te begrijpen.

Seriële twee-fotontomografie van het hele zijdeaapje brein voor neuroanatomische analyses

Leer wholemount immunohistochemie voor het visualiseren van complexe genexpressiepatronen in het cerebellum. Deze methode maakt driedimensionale weergave mogelijk zonder reconstructie.

Wholemount Immunohistochemie voor het openbaren van Complex Brain Topografie

Meer video's verkennen