Wholemount Immunohistochemie voor het openbaren van Complex Brain Topografie

Het algemene doel van deze procedure is om complexe patronen van genexpressie in een volledige, intacte hersenstructuur in kaart te brengen. Dit wordt bereikt door het dier eerst te perfunderen en de hersenen te verwijderen. Vervolgens wordt het cerebellum gedisseceerd en verwerkt volgens het whole mount kleuringsprotocol.

De laatste stap is het visualiseren van genexpressie met behulp van een histochemische kleurreactie. Uiteindelijk wordt veldverlichtingsmicroscopie gebruikt om oppervlaktepatronen van genexpressie in beeld te brengen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals immunohistochemie op weefselcoupes, is de mogelijkheid om complexe patronen in drie dimensies te visualiseren zonder dat reconstructie nodig is.

De procedure wordt gedemonstreerd door Joshua White, een promovendus uit mijn laboratorium. Nadat het dier is geofferd en de hersenen uit de schedel zijn verwijderd, scheidt u het cerebellum van de rest van de hersenen door eerst de punten van een pincet in het midden van de superieure en inferieure calli te plaatsen. Gebruik vervolgens een tweede pincet om de calli en de cortex voorzichtig van het cerebellum los te maken.

Positioneer het cerebellum zodanig dat de anterieure zijde naar beneden is gericht en de hersenstam naar boven wijst. Voer nu de pincet in de vierde ventrikel in, tussen de hersenstam en lobuli 9 en 10 van het cerebellum. Doorknip de pedunkels door met de pincet aan beide zijden te knijpen en til het cerebellum vervolgens voorzichtig weg van de hersenstam.

Voer de postfixatie van het cerebellum uit door onderdompeling in 4% paraldehyde bij vier graden Celsius gedurende minimaal 24 tot 48 uur. Het cerebellum kan gedurende een langere periode in 4% paraldehyde worden bewaard, mits er in een zuurkast wordt gewerkt. Giet de paraldehyde-oplossing voorzichtig af en vervang deze door dense fix.

Plaats de buis met het cerebellum en de fixatieoplossing op een schudder en schud voorzichtig gedurende zes tot acht uur. Nadat de incubatietijd is verstreken, giet het dichte fixatiemiddel af en vervang dit door dicht bleekmiddel. Incubeer het cerebellum in deze oplossing gedurende de nacht bij vier graden Celsius en schud de volgende dag.

Vervang de oplossing in de buis door 100% methanol. Plaats de buis op de agitator en schud deze voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Nadat de incubatietijd is verstreken, vervangt u de oplossing door verse 100% methanol en herhaalt u de incubatie om de dehydratie van het cerebellum te waarborgen.

Voer nu een vries-dooi-cyclus uit voor het weefsel in 100% methanol door de buis 30 minuten in een container met droogijs te plaatsen om deze te laten invriezen. Haal de buis na deze tijd met een pincet uit het droogijs en plaats deze 15 minuten op het werkblad om te ontdooien. Herhaal de vries-dooi-procedure minimaal vier keer om de penetratie van de kleuringsoplossingen te verbeteren.

Plaats de buis na de laatste ontdooiing gedurende één nacht in een vriezer van -80 °C. Het weefsel kan voor langere perioden worden bewaard bij -80 °C, direct vóór of na de vries-dooi-stappen. In andere gevallen dient het protocol direct te worden voortgezet.

De volgende dag. Rehydrateer het cerebellum door onderdompeling met schudden in 50% methanol/50% PBS, 15% methanol/85% PBS en vervolgens 100% PBS gedurende telkens 60 tot 90 minuten bij kamertemperatuur. Onderwerp daarna, voor cerebellaire weefsels van volwassen muizen, het weefsel aan enzymatische digestie met 10 µg/mL proteinase K in PBS gedurende twee tot drie minuten bij kamertemperatuur met schudden.

Deze digestiestap is niet nodig voor de cerebella van muizen van P5 of jonger. Giet na de digestie onmiddellijk de proteinase K af en was het cerebellum 3 keer gedurende elk 10 minuten in PBS om overdigestie te voorkomen. Vervang na de laatste wasbeurt de oplossing door PBS-M-T en bewaar dit gedurende één nacht bij vier graden Celsius om het weefsel de volgende dag te blokkeren.

Giet de PBSMT-blokkeringsoplossing af en incubeer het weefsel in de primaire antilichamen, verdund in PBSMT en aangevuld met 5% DMSO, gedurende 48 uur bij vier graden Celsius onder schudden. Nadat de incubatietijd is verstreken, wordt het cerebellum twee tot drie keer gewassen gedurende telkens twee tot drie uur in PBSMT bij vier graden Celsius onder schudden om ongebonden primaire antilichamen te verwijderen.

Incubeer het weefsel vervolgens in het secundaire antilichaam in een oplossing van P-B-S-M-T met 5% DMSO gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Was de volgende dag het cerebellum onder schudden in P-B-S-M-T zoals eerder beschreven. Voer daarna een laatste wasbeurt uit in PBT gedurende één tot twee uur onder schudden bij vier graden Celsius.

Deze stap verwijdert overtollige melk en verbetert de helderheid van de kleuring. Incubeer het weefsel tot slot in de DAB-oplossing. Het is aanbevolen om DAB in het donker te gebruiken totdat de optimale kleurintensiteit is bereikt.

Omdat licht ervoor zorgt dat het chromogeen neerslaat, wat de achtergrondkleuring kan verhogen. Het bruine reactieproduct moet duidelijk zichtbaar zijn binnen 10 minuten wanneer de optimale kleurintensiteit is bereikt. Stop de reactie door het cerebellum in PBS met 0,4% natriumazide te plaatsen.

Het weefsel kan op lange termijn in deze oplossing worden bewaard. Whole mount-gekleurd weefsel dient te worden afgebeeld terwijl het is ondergedompeld in PBS of een ander medium dat een optimale brekingsindex biedt. Om de whole mount eenvoudig te positioneren voor beeldvorming, wordt een 1% agar-gel in een plastic Petrischaal gemaakt.

Maak vervolgens kleine gaatjes in de gel en klem het cerebellum in deze gaatjes in de gewenste oriëntatie voor beeldvorming; bedek het cerebellum met PBS. Het gekleurde weefsel is nu klaar om te worden afgebeeld met behulp van lichtmicroscopie. ZEIN twee Adelaide c.

Immunohistochemie brengt sagittale banden in stand in transversale coupes van het cerebellum. Labiale vier, vijf en drie zijn gelabeld in het diagram. Ter oriëntatie representeert de schaalbalk 500 microns.

ZEIN twee. De C van Adelaide komt uitsluitend tot expressie in subsets van kinji-cel-sata en dendrieten. In deze afbeelding staat de schaalbalk voor 150 microns.

Deze afbeelding toont een whole-mount cerebellum gekleurd voor zein twee, Adela C, waarbij bikini-celstrepen zichtbaar zijn in beelden van de anterieure, centrale en posterieure zones van het cerebellum. De Romeinse cijfers duiden de cerebellaire lobuli aan. LS is de lobulus simplex.

PML staat voor de paramediale labiale. COP duidt de copulaire parameters en de labels aan. Crust één en crust twee duiden de namen aan van twee hemisferische LOE's; de aanduidingen P één en P drie zijn gebaseerd op een standaardnomenclatuur die wordt gebruikt om specifieke BR twee-strepen aan te geven.

Voor verdere details, zie Sillitoe en Hawks 2002. De schaalbalk vertegenwoordigt één millimeter. Hier is het cerebellum immunostained met een antilichaam tegen cocaine and amphetamine regulated transcript peptide.

Het is te zien dat deze kaart tot expressie komt in subsets van klimvezels die door de Purkinje-cellaag (aangeduid als PCL) lopen en eindigen in de moleculaire laag (aangeduid als ml). Hier representeert de schaalbalk 100 microns.

Op deze afbeelding is te zien dat de positieve vezels van de cart projecteren op strepen van dendrieten van bikini-cellen in de moleculaire laag van de cerebellaire cortex, inclusief regio's zoals de Oculus aangeduid als PFL en de Oculus aangeduid als fl. Tijdens deze procedure is het belangrijk om te voorkomen dat het cerebellum wordt ingesneden. Elke externe beschadiging zal de zichtbaarheid van complexe kleuringspatronen belemmeren.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u complexe en interessante patronen van genexpressie kunt blootleggen in neuronen en in de vezels die hiermee contact maken in het intacte brein.