Het meten van voortgang van de celcyclus Kinetics met metabolische labeling en Flow cytometrie

Het algemene doel van de volgende procedure is het meten van de kinetiek en de progressie van de celcyclus. Eerst worden cellen pulse-chase gelabeld met romo, deoxy-uridine of BRDU, dat in de plaats van thymidine in het DNA van de cel wordt ingebouwd. De cellen worden vervolgens immunogekleurd met antilichamen tegen BRDU en direct na de kleuring geanalyseerd via flowcytometrie.

Alleen cellen in de S-fase worden gelabeld terwijl de gelabelde cellen door de celcyclus naar G2 vorderen. Deze worden gedetecteerd als cellen met een 4N DNA-gehalte na mitose. Het DNA-gehalte wordt vervolgens gereduceerd tot 2N. Daarom kan analyse van de fluorescentieprofielen gegenereerd door flowcytometrie worden gebruikt om de kinetiek van de celcyclusprogressie te bepalen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere protocollen die chemicaliën gebruiken voor cellsynchronisatie is dat er geen fysiologische verstoringen optreden die onbedoeld het celdelingsmechanisme kunnen beïnvloeden. We hebben deze methode voor het eerst toegepast toen onze pogingen om de snelheid van de celcyclusprogressie via chemische synchronisatie te bestuderen onverwachte resultaten opleverden die onze analyse beïnvloedden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de celbiologie.

Wat is bijvoorbeeld de basis voor de differentiële groeisnelheden tussen verschillende celtypen? Begin dit protocol met een pulse-chase labeling van de cellen met BRDU om dit te onderzoeken. Begin met het labelen van één plaat van 10 centimeter voor elk tijdspunt, plus één voor elk van de volgende controles.

alleen BRDU alleen PI BRDU negatief PI negatief zaai elke plaat met vijf keer 10 tot de vijfde MCF 7-cellen in aangevuld DMEM. Incubeer de platen gedurende 24 tot 48 uur om de cellen te laten herstellen en hechten. Zodra de cellen een confluentie van 60% bereiken, vervang het medium door vers DMEM met 10 micromolar.

Incubeer de cellen gedurende één uur bij 37 °C en 5%CO2 met BrdU om de incorporatie van BrdU in het DNA mogelijk te maken. Zorg ervoor dat één plaat onbehandeld blijft om te dienen als negatieve controle of nultijdstip na één uur. Verwijder het medium voor pulslabeling en spoel de cellen kort af met PBS voor de tijdstippen van twee tot acht uur.

Voeg vers groeimedium toe en plaats ze terug in de incubator. Oogst vervolgens onmiddellijk de platen van het nul- en één-uurs tijdstip zoals beschreven in de volgende sectie. Om de cellen te oogsten, moet het medium worden afgezogen en de plaat worden gespoeld.

Spoel de cellen eerst met PBS en behandel ze vervolgens met trypsine om ze van de plaat los te maken. Verzamel de cellen in DMEM en centrifugeer deze bij 390 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant. Spoel de cellen vervolgens met 1-5 ml ijskoud PBS en centrifugeer opnieuw bij 390 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 µL ijskoud medium.

Koude PBS met 1% FBS. De FBS helpt celklontering te voorkomen. Een van de belangrijkste aspecten van deze procedure is om ervoor te zorgen dat u een enkelcel-suspensie verkrijgt van de geoogste cellen.

Voor de feiten. Om dit te bereiken, kunt u uw cellen druppel voor druppel aan de ethanol toevoegen. Dit is cruciaal. Gebruik vervolgens de pipet om de cellen druppelgewijs toe te voegen aan vijf milliliter ijskoud water om de cellen te fixeren.

70% ethanol in een conische buis van 15 milliliter. Incubeer de cellen 30 minuten op ijs of bewaar ze overnacht bij vier graden Celsius. Dit is een ideale stap om de verzameling van monsters van de verschillende tijdspunten te onderbreken; de monsters kunnen enkele dagen in ethanol blijven staan, zodat ze gelijktijdig verder verwerkt kunnen worden volgens de rest van het protocol voor BRDU- en propidiumjodide-kleuring.

Haal de cellen uit de koelkast (4 °C) en centrifugeer ze 3 keer bij 90 ×g gedurende vijf minuten. Aspireer na het centrifugeren het grootste deel van het fixeermiddel, waarbij ongeveer 50 µL overblijft. Vortex vervolgens.

Om het pellet los te maken om het DNA te denatureren tijdens het vortexen. Voeg langzaam één milliliter 2 N HCl Triton X 100 druppelsgewijs toe en laat de monsters vervolgens 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Pelleteer de cellen door de monsters vijf minuten te centrifugeren bij 390 ×g, aspireer vervolgens het supernatant en gooi dit weg.

Resuspendeer vervolgens de celpellet in één milliliter 0,1 molair natriumtetraboraat. Aspireer na het centrifugeren de cellen opnieuw en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de celpellet daarna in 75 microliters BrdU-kleuring.

Meng en incubeer 45 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht na de incubatie. Pelleteer de cellen door centrifugatie zoals eerder beschreven en resuspendeer de celpellet in één milliliter PBS bevatten vijf microgram per milliliter propidiumjodide. Maak bij het analyseren van het PI-positieve monster via de flowcytometer een forward scatter versus side scatter plot om de juiste grootteverdeling van de cellen te waarborgen.

Beide parameters moeten op een lineaire schaal worden uitgezet. Bekijk gelijktijdig een plot van FL three H tegenover FL two W om de PI-kleuring ten opzichte van de fluorescentie-pulsbreedte te bekijken. Deze plot wordt gebruikt om een gate te maken om de fractie cellen te isoleren die waarvan wordt aangenomen dat ze binnen het normale distributiepatroon van de celcyclus vallen.

In het algemeen wordt dit distributiepatroon gekenmerkt door twee clusters cellen met een 2N en 4N DNA-gehalte bij PI-kleuring, die respectievelijk de G1- en G2-fasen van de celcyclus vertegenwoordigen. Een reeks cellen tussen deze twee clusters is representatief voor de lopende DNA-replicatie die plaatsvindt in de S-fase van de celcyclus. Maak een plot waarin de gegatede cellen worden weergegeven met FL1-H of FITC op een logaritmische schaal op de Y-as en PI op een lineaire schaal op de X-as.

Deze plot zal worden gebruikt om de resterende parameters in te stellen via de verschillende bedieningselementen, alsmede om gegevens te verzamelen. Plaats voor de analyse de enkel met PI gekleurde monster in de laadpoort van de flowcytometer en pas de gain aan om G1 op ongeveer 200 op de x-as te plaatsen. Dit is gemakkelijker te visualiseren in een histogramplot van de PI-kleuring.

Plaats vervolgens de monsterbuis met enkel BRDU in de laadpoort en start de analyse. Stel de gain zo in dat de twee celpopulaties, BRDU-positief en BRDU-negatief, op de plot verschijnen. Idealiter bevinden de BRDU-negatieve cellen zich precies op of onder 10¹.

De laatste controle is het BrDU/PI-negatieve monster. Voer deze negatieve controle uit om te bevestigen dat de cellen niet verschijnen in een van de bovenste of rechterkwadranten. Zodra de parameters van de verschillende plots zijn ingesteld, is de flowcytometer gekalibreerd en klaar voor de verwerking van BrDU- en PI-gekleurde cellen. Verzamel data van minimaal 10.000 PI-gegate cellen per monster.

Maak vervolgens met software zoals FlowJo of fax diva een plot van FITC tegenover PI, waarbij de cellen uit de PI versus FL twee W-plot zijn gegated als PI-positief, om de cyclende populatie te onderscheiden. Genereer daarna een tweede gate om de BRDU-positieve populatie te isoleren.

Om vervolgens het verloop van de celcyclusprogressie te volgen, wordt het aantal BrdU-positieve cellen met G1- of G2-inhoud uitgezet als functie van de tijd om de kinetiek van de celcyclusprogressie tussen twee colorectale cellijnen, HT 29 en LS 180, te vergelijken. Cellen werden elk uur gedurende acht uur verzameld na het verwijderen van de BrdU-puls.

Bij het vergelijken van de kinetiek van de twee profielen is de opkomst van een G1-piek duidelijk zichtbaar bij t gelijk aan vier uur na BrdU in de LS 180-cellen, vergeleken met het overeenkomstige tijdstip voor de HT 29-cellijn, waarbij deze piek ontbreekt. Dit wijst op een versnelde voortgang van de celcyclus door de G2-fase van de celcyclus. In de colorectale cellijn LS 180 om een cyclusprofiel van de borstkanker-cellijn te genereren.

MC-zeven cellen werden elk uur gedurende acht uur verzameld. Na het verwijderen van de BRDU-puls werden de immuungekleurde cellen en de DNA-tegengekleurde cellen vervolgens gesorteerd op basis van hun fluorescentiesignalen.

Zoals hier te zien is, doorliepen CF seven cellen de cyclus met een significant lagere snelheid dan beide geteste colorectale cellijnen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe metabole labeling van DNA in combinatie met oogsten op specifieke tijdstippen het mogelijk maakt om de kinetiek van de celcyclus te volgen.